הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מטאפאזה DNA-FISH מתפשטת כדי להבחין בין DNA חוץ-כרומוזומי לבין אזורים עם צביעה הומוגנית בקווי תאים סרטניים אנושיים

399 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71970

⸱

4 באוגוסט 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

אנו מדווחים על פרוטוקול התפשטות מטאפאזה של DNA-FISH שמזהה חזותית את מספר עותק הלוקוס ומיקומו בתוך הגנום. גישה זו מאפשרת פתרון תאים בודדים של מצבי הגברה, במיוחד בקווי תאים סרטניים המכילים DNA חוץ-כרומוזומי ואזורים צובעים באופן הומוגני.

תקציר

ריצוף גנום מלא מזהה הגברות DNA מוקדיות ברזולוציית זוג בסיסים, אך אינו יכול לקבוע האם רצפים מוגברים נמצאים ב-DNA חוץ-כרומוזומי (ecDNA, הידוע גם כדקות כפולות) או בתוך אזורי צביעה הומוגניים משולבים כרומוזומלית (HSRs). התפשטות מטאפאזה של DNA פלואורסצנציה בהיברידיזציה במקום (DNA-FISH) נשארות הסטנדרט הזהב להבחנה בין מצבי הגברה אלו ברזולוציה של תא יחיד. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט להתפשטות מטאפאזה של DNA-FISH באמצעות קווי תאים סרטניים בבני אדם, הכולל תרבית תאים, עצור מטאפאזה, טיפול היפוטוני, קיבועה, התפשטות כרומוזומים, היברידיזציה של גלאי פלואורסצנטי ודימות פלואורסצנטי. הפרוטוקול משלב שלבי בקרת איכות ביניים לאימות פיזור כרומוזומים מוצלח ואופטימיזציה של איכות התפשטות מטאפאזה, מה שהופך את זרימת העבודה לנגישה למעבדות ללא מומחיות ציטוגנטיקה מיוחדת. התוצאות מראות ויזואליזציה ברורה של מצבי הגברה של ecDNA ו-HSR באמצעות גלאים ספציפיים ללוקוס וממחישות ארטיפקטים טכניים נפוצים שיכולים להשפיע על הפרשנות. פרוטוקול זה מספק גישה איתנה וניתנת לשחזור לחקר הארגון המבני של הגברת אונקוגנים בתאי סרטן.

מבוא

הגנום האנושי מאורגן לא רק לפי הרצף שלו, אלא גם לפי המבנה שלו, ושינויים ברצף או במבנה יכולים להוביל לסרטן 1,2,3,4. הגברת אונקוגן קיימת בכ-40% מכלל הגידולים, שם היא תורמת להתחלה, צמיחה, גרורות ועמידות לתרופות5. במקרים מסוימים, אונקוגנים מוגברים מועברים על DNA חוץ-כרומוזומליים (ecDNAs, הנקראים גם דקות כפולות), שהם אלמנטים מעגליים, משכפלים את עצמם, בעלי שני גדיליים, השוכנים מחוץ לכרומוזומים הליניאריים 6,7,8,9. ecDNA הם מאות קילובסיסים עד מגה-בסיסים בגודל10,11. עקב היעדר הצנטרומרים, הם נפרדים באופן אסימטרי במהלך מיטוזה, מה שמוביל ליצירת עד 100+ עותקים בגרעין יחיד 12,13,14,15,16,17,18. הפרדה לא אחידה זו יוצרת שונות במספר העותקים בין תאי הבת, מה שמניע התפתחות מהירה של הגידול ותוצאות גרועות שלהמטופלים 17,19.

ecDNAs קיימים במערכת יחסים דינמית עם אזורי צביעה הומוגנית (HSRs) (איור 1A)8,18. HSRs הם הגברות מוקדיות, תוך-כרומוזומליות, שיכולות להיווצר באמצעות אינטגרציה מחודשת של ecDNAs ללוקוס יחיד בגנום 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. שני המצבים הללו, ecDNA ו-HSRs, יכולים להתמודד זה עם זה, וכך לחשוף שהגברת אונקוגנים היא פלסטית מבחינהמבנית 24,25,32,33. המרה זו רלוונטית טיפולית משום ש-ecDNAs יכולים לעבור למצב HSR בנוכחות תרופות 32,33,34,35,36,37,38. תאים שעוברים מעבר זה למצב HSR הופכים לעמידים לתרופה תחת לחץ טיפולי33. HSRs נראים גם נפוצים יותר בגידולים ממאירים מאשר בגידולים שפירים39. למרות הרלוונטיות הקלינית שלהן, אף אסטרטגיה שאושרה על ידי ה-FDA אינה מכוונת למצב HSR, בין היתר משום ששיטות להבחין במבני הגברה אלו עדיין לא מנוצלות מספיק.

למרות שלמצבים של ecDNA ו-HSR יש השלכות קליניות מובחנות, גישות הריצוף הנוכחיות אינן יכולות להבחין ביניהם באופן אמין. ריצוף הגנום המלא (WGS) מזהה כיום אזורים מוגברים ברזולוציית זוג בסיס40. WGS היה בעל ערך בהגדרת הרכב הרצפים של ecDNAs ו-HSRs, אך על חשבון הרזולוציה המרחבית. בניגוד לגישות ציטוגנטיות מסורתיות, WGS לבדו אינו יכול לקבוע האם רצף מוגבר נמצא על ecDNA או משולב בכרומוזום כ-HSR 41,42,43. כתוצאה מכך, שיטות השומרות על ההקשר המרחבי של ההגברה נשארות חיוניות להבנת הביולוגיה של מצבים מובחנים אלו.

ב-40 השנים האחרונות, התפשטות מטאפאזה של DNA פלואורסצנציה במקום (DNA-FISH) שימשו כסטנדרט הזהב לזיהוי והבחנה בין מצבי הגברה של ecDNA ו-HSR 42,44,45,46. למעשה, ecDNA ו-HSRs זוהו ואופינו לראשונה באמצעות ניתוחים ציטוגנטיים מבוססי מטאפאזה 7,47. לפני השימוש הנרחב בגלאי פלואורסצנטי, היברידיזציה במקום בוצעה באמצעות גלאי DNA מסומנים ברדיו, ששימשו גם להמחשת ecDNA ו-HSRs48,49. ככל ש-WGS הפך לפופולרי, התפשטות מטאפאזה של DNA-FISH הפכה לפחות נפוצה. היבטים רבים של זרימת העבודה מפוזרים בספרות הציטוגנטית, ופרוטוקולים מותאמים נשמרים בדרך כלל בתוך קבוצות מחקר בודדות או במעבדות ציטוגנטיקה שמתייחסים לשיטהכ-50,51 קנייני. כאן, אנו מתארים פרוטוקול התפשטות מטאפאזה של DNA-FISH לפתרון חזותי של מצב הגברה ברמת התא היחיד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הליכי תרבית התאים האנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. עצירת תאים במטאפאזה באמצעות קולסמיד (N-מתיל-N-דה-אצטיל-קולכיצין)

  1. התחילו בכ-2.0 × 10,6–2.0 × 10,7 תאי סרטן או תאים מתורבתים אחרים. מעט מדי תאים יניבו פחות התפשטות מטפאזה, בעוד שיותר מדי תאים עלולים לגרום לקיבוע לא מספק.
  2. קבעו את זמן הדגירה המתאים של קולסמיד למערכת הניסויית. זמן הדגירה משפיע על מספר התפשטות המטאפאזה שמתקבלות ועל אורך הכרומוזומים, והתנאים האופטימליים משתנים בין סוגי התאים.
    הערה: זמני דגירה קצרים יותר גורמים לפחות תאים שנעצרים במטאפאזה בזמן האיסוף. זמני דגירה ארוכים יותר יוצרים יותר כרומוזומים מעובים עם זרועות קצרות יותר, מה שמקשה על הניתוח. בקווי תאים סרטניים עם זמן הכפלה של כ-24 שעות, תקופות דגירה הנעות מ-45 דקות ועד לילה מייצרות התפשטות מטפאזה מתאימה. מייעל את זמן הדגירה לתאים עם זמני הכפלה איטיים יותר. דגירה של 2 שעות בדרך כלל מספיקה ליצירת מספר מספק של התפשטות מטפאזה עם אורכי כרומוזומים מתאימים לניתוח.
  3. חשב את כמות הקולסמיד הנדרשת להשגת ריכוז סופי של 10 מיקרוליטר/מ"ל במדיום תרבית התאים המתאים.
    הערה: לשמור על תאים בצמיחה לוגריתמית על ידי העברת תאים או זריעתם לפחות 24 שעות לפני עצור המטאפאזה. לטפל בתאים בקולסמיד כאשר התרביות מגיעות ל-70%–90% מפגש משותף.
  4. מדלל את תמיסת המקור של קולסמיד 1:1 עם מים סטריליים וטהורים מאוד. הוסף את הנפח המתאים לתרבית ודגר במשך 45 דקות עד לילה בתנור תרבית תאים.

2. קציר תאים

  1. הכינו את הקיסטיב הטרי של קרנוי (3:1 מתנול: חומצה אצטית). שמור על הקרח על הקרח לאורך כל תהליך הקיבע.
  2. הכינו תמיסה טרייה של 0.075 מטר KCl וחממו אותה באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
  3. אסוף את התאים ככדור ותעד את ספירת התאים. השתמש בערך זה כדי לחשב את נפח ההשעיה הסופי.
    הערה: ניתוק תאים דביקים באמצעות טריפסיניזציה. העבר תאי תלייה ישירות לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל. להשליך מדיה המכילת קולסמיד וקולסמיד בהתאם להנחיות מוסדיות לפסולת מסוכנת.
  4. שטוף את התאים עם PBS.
  5. החזירו בעדינות את התאים ל-10 מ"ל של 0.075 מ' KCl חמים וערבבו בהיפוך עדין. טיפול ההיפוטוני הזה מנפח את התאים, ומאפשר להם להתפוצץ ולפזר כרומוזומים במהלך הכנת הסלייד.
  6. דגרו את התאים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  7. הוסיפו לאט 2 מ"ל של הקיבוע הקר של קרנוי תוך ערבוב עדין של המתלים באמצעות היפוך.
  8. תן לתאים לעמוד 5 דקות.
  9. צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  10. שאף בזהירות את הסופרנטנט או הסר אותו עם פיפטה.
  11. הוסיפו לאט 10 מ"ל של קיבוע קרנוי קר במרווחים של 0.5 מ"ל תוך ערבוב עדין אחרי כל הוספה.
  12. תן לתאים לעמוד 10 דקות ב-RT.
  13. צנטריפוגה ב-650 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  14. חזור על צעדים 2.10–2.13 פעמיים
  15. במהלך השטיפה הסופית, השאירו את התאים תלויים בתוך הקיבוע של קרנוי.
    הפסקה: אחסן את המתלה התא הקבוע בטמפרטורה של −20°C או המשך מיד לסעיף 3.
    הערה: לדגימות המכילות פחות מכ-3 ×-10תאים בכ-6 , יש לבצע קיבוע בצינורות מיקרוצנטריפוגה בקוטר 1.5 מ"ל במקום בצינורות חרוטיים גדולים יותר. הפחתת נפחים של 0.075 מטר קילוקליטר ו-10 פעמים הקיבעון של קרנוי תוך שמירה על כל זמני הדגירה, הטמפרטורות ותנאי הצנטריפוגה.

3. נפילת משחקי השולחן

  1. שלפו את הדגימה מ-−20°C והפשרו אותה ל-RT.
  2. צנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 7 דקות ב-RT.
  3. תייג את שקופיות הזכוכית ותנח אותן על קרח.
  4. באמצעות ספירת התאים שהושגה לפני הקיבוע, חשב את נפח הקיבוע של קרנוי הנדרש להשבת הכדור בריכוז סופי של כ-5 ×-106 תאים/מ"ל. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטה, והשאיר את נפח הקיבוע המחושב מעל הכדור.
  5. החזיר את התאים הקבועים בקיבוע של קרנוי באמצעות פיפטת P1000.
  6. העבר כ-300 מיקרוליטר מהמתלה הקבוע לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  7. תלה היטב את הדגימה באמצעות פיפטת P200 על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.
  8. שאפו 60 מיקרוליטר מהתאים שהוחזרו באמצעות פיפטת P200.
  9. החזק את קצה הפיפטה כ-1 מטר מעל המגלשה הזכוכית על הקרח וכיוון למרכז המחסנית.
  10. הזרקו לאט טיפה אחת מהמתלים של התא על המחסנית.
    הערה: סמן את מיקום הנפילה בקצה המגלשה עם טוש עמיד לאתנול כדי להקל על הזיהוי בשלבים הבאים.
  11. תן לתאים להתייבש על קרח למשך 10 דקות.
  12. הנח את המגלשות על אינקובטור שקופיות בטמפרטורה של 80°C למשך 10 דקות.
  13. הסר את המחסניות עם מלקחיים ותן להן להתקרר למגע.
  14. בדקו את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פאזה-ניגודיות עם מטרה של 10× או 20×. אשר את קיומם של מספר התפשטות מטפאזה מפוזרות היטב ללא חפיפה מופרזת.

4. לטפל מראש במגלשה

  1. הכינו צנצנות קופלין לשלבי הכביסה
    1. הכינו כל מגיב טרי: 70% חומצה אצטית (40 מ"ל), PBS (40 מ"ל), PBS (45 מ"ל), 70% אתנול (40 מ"ל), 85% אתנול (40 מ"ל) ו-100% אתנול (40 מ"ל).
  2. שים את הזכוכית ב-70% חומצה אצטית למשך 2 דקות.
  3. הנח את מחסניות הזכוכית ב-40 מ"ל PBS למשך 30 שניות.
  4. שים את מחסניות הזכוכית ב-45 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
  5. ייבשו את גלגלי הזכוכית ברצף ב-70%, 85% ואתנול של 100% למשך דקה כל אחד.
  6. ייבשו את המחסניות באוויר ב-RT למשך 10 דקות.

5. הכינו את הגשושית

הערה: פרוטוקול זה עושה שימוש בגשושי DNA-FISH ייחודיים ללוקוס הזמינים מסחרית, אשר עוברים היברידים לאזור גנומי מעניין.

  1. בחר גלאי המכוון למוקד המוגבר לבדיקה. הפשיר את הגלאי ובופ ההיברידיזציה לפי הוראות היצרן. תאפשר לגלאי להגיע ל-RT לפני השימוש.
  2. הכינו תערובת פרוב המכילה 1 מיקרוליטר של גלאי ו-4 מיקרוליטר של בופר היברידיזציה לכל זכוכית.
    הערה: הריכוז האופטימלי של הגשש עשוי להשתנות בהתאם ליצרן ולגש. הריכוז שמצוין כאן אופטימלי בהתאם לגלאים ששימשו במחקר זה. עם זאת, יש לייעל את ריכוז הגשוש עבור כל לוקוס חדש.
  3. יש להניח 5 מיקרוליטר מתערובת הבופר/ההיברידיזציה במרכז כל נקודת נפילה על סלייד הזכוכית.
    הערה: גשושים רגישים לאור. מזעור חשיפה לאור לאורך כל שאר התהליך על ידי אחסון השקופיות במגירה חשוכה בין השלבים ובזמן עיבוד שקופיות אחרות.
  4. הנח בזהירות כיסוי מעל הדגימה.
  5. אוטום את קצוות הכיסוי עם מלט גומי.
  6. הנח את מחסניות הזכוכית בתא לח.
  7. היברידיז את הגשושית לפי פרוטוקול היצרן. אפשרו להיברידיזציה להתקדם במהלך הלילה (12–18 שעות).

6. שטיפות לאחר היברידיזציה, צביעת נגד, התקנה והדמיה

  1. הכינו צנצנות קופלין לשלבי הכביסה
    1. הכינו כל תגובה טרי: 2× SSC (40 מ"ל), 0.4× SSC (40 מ"ל), 70% אתנול (40 מ"ל), 85% אתנול (40 מ"ל), 100% אתנול (40 מ"ל) ו-PBS (45 מ"ל).
    2. הכינו ואחסנו את SSC בתמיסת מלאי של 20× (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate, pH 7.0). להכנת 1 ליטר, יש להמיס 175.3 גרם NaCl ו-88.2 גרם נתרן ציטראט בליטר מים אולטרה-טהורים. דילל את המלאי להכנת פתרונות עובדים של 2× SSC ו-0.4× SSC לפי הצורך.
  2. חממו את תמיסת ה-SSC של 0.4× ל-72 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  3. הסר את מחסניות הזכוכית מהתא הלח והוציא בזהירות את מלט הגומי.
  4. הנח את מחסניות הזכוכית ב-2× SSC למשך 2 דקות ב-RT. הסר בזהירות את הכיסוי.
  5. הניחו את הזכוכית ב-0.4× SSC מחוממים מראש בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  6. שים את מחסניות הזכוכית ב-2× SSC לדקה אחת ב-RT.
  7. ייבשו את גלגלי הזכוכית ברצף ב-70%, 85% ואתנול של 100% למשך דקה כל אחד.
  8. ייבשו את הסליידס באוויר ב-RT למשך 10 דקות בחושך.
  9. מדלל 1 מ"ג/מ"ל DAPI 1:1000 ב-PBS לנפח סופי של 1 מ"ל.
    הערה: ניתן לאחסן את האליקווט הזה בטמפרטורה של 4°C עד שבוע אחד.
  10. פיפט של 10 מיקרוליטר של ה-DAPI המדולל על כל שקופית זכוכית במיקום הנפילה המסומן.
  11. הנח בזהירות כיסוי מעל הדגימה כדי להבטיח שפתרון ה-DAPI יתפזר באופן שווה.
  12. דגרו את המגלשות בחושך למשך 5–10 דקות.
  13. שים את מחסניות הזכוכית ב-PBS למשך 30 שניות.
  14. הסירו את הכיסוי.
  15. הנח את מחסניות הזכוכית ב-PBS למשך 2 דקות.
  16. ייבוש את שקופיות הזכוכית על ידי טבילה קצרה ב-70%, 85% ו-100% אתנול למשך כ-10 שניות כל אחד.
  17. ייבשו את הסליידס באוויר ב-RT למשך 10 דקות בחושך.
  18. הוסיפו 15 מיקרול מדיום התקנה לכל זכוכית, ואז הניחו כיסוי מעל.
  19. תן למדיום ההרכבה להתפשט באופן אחיד, ואז לנקות בעדינות כל עודף.
  20. אטום את קצוות הכיסוי עם לק לציפורניים.
  21. תני ללק להתייבש במשך 15 דקות ב-RT בחושך.
    הפסקה: אחסן את המחסניות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.
  22. דמיינו את השקופיות.
    הערה: התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך עם מטרת טבילה בשמן במהירות 60×.
  23. אסוף מספר ערימות z לכל ערוץ פלואורסצנציה כדי ללכוד את האות לאורך כל עומק התפשטות המטאפאזה.
  24. דה-קונבולציה של ערימות התמונה באמצעות אלגוריתם הערכת סבירות מקסימלית כדי לשפר את בהירות האות ולהפחית פלואורסצנציה מחוץ לפוקוס.
  25. לעבד ולנתח את התמונות הסופיות ב-ImageJ, ולבחור את מישור המוקד האופטימלי לכל פיזור מטאפאזה לפני הניתוח במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה (איור 1B) מניב כרומוזומים מטאפאזה נקיים, מפוזרים היטב ושלמים המתאימים לניתוח ציטוגנטי, כאשר כרומוזומים ואותות DNA-FISH נראים בבירור במיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש במיקרוסקופ בהיר/ניגודיות פאזה בהגדלה נמוכה (10× או 20×) הוא שלב חשוב בבקרת איכות כדי לוודא שהגרעינים התפוצצו והכרומוזומים התפזרו (איור 2). קיבוע מוצלח ונפילת שולחן אמורים להניב פיזורי מטאפאזה מפוזרים היטב עם מספר התפרצויות כרומוזומים גלויים לאורך השקופה. התפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות היתרונות המוכרים שלהן, התפשטות מטאפאזה של DNA-FISH מנוצלות פחות בעידן WGS. הארגון הפיזי של DNA מוגבר הוא משמעותי תפקודית, שכן הוא יכול להשפיע על התנהגות ביולוגית במורד הדרך ותגובה טיפולית 61,62,63,64. אונקוגנים מוגברים פוקלית יכולים להתקיים על ecDNA או בתוך HSRs, ושני מצבי ההגברה הללו אינם שווים פונקציונלית 14,65,66,67.<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HG011467 ו-CPRIT RR23004 ל-G.S.E. הדמיה לפרויקט זה נתמכה על ידי ליבת מיקרוסקופיה משולבת במכללת ביילור לרפואה במימון ה-NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). המחברים מודים לד"ר פאבל סטנקייביץ' על עצתו בתחילת הדרך. המחברים מודים גם לד"ר פול מישל (אוניברסיטת סטנפורד) על אספקת קווי התאים GBM39ec ו-GBM39hsr.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15-mL conical centrifugeמכל מקורNAצנטריפוגה. 
15-mL conical tubesמכל מקורNAאיסוף תאים.
200 proof ethanolמכל מקורNAשלבי שטיפה. 
חומצה אצטית, קריולי, 99.7%Millipore Sigma695092Carnoys fixative ושלבי שטיפה של שקופיות.
Antifade Mounting MediumFisherScientificNC9265087הרכבת שקף לאחר הכנת השקף הושלמה
ארון בטיחות ביולוגית עם יציאת ואקוםמכל מקורNAאחסון כימיקלים.
Colcemid (N-methyl-N-deacetyl-colchicine)Millipore Sigma10295892001קושר טובולי, עוצר תאים במטאפזה.
כלי Coplinמכל מקורNAשלבי שטיפה. 
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Milipore SigmaD8417-1MGכתם DNA פלואורסצנטי.
EGFR/CON7 FISH probe Empire GenomicsEGFR-CHR07כתם פלואורסצנטי ספציפי ללוקוס. 
דבק גומי של Elmerמכל מקורNAשמירת מיקום השקף הכיסוי במהלך הכלאה לילי של הגשש.
מרקר קבוע עמיד לאתנולמכל מקורNAתיוג שקף.
מיקרוסקופ פלואורסצנטימכל מקורNAהדמיית שקף. 
שקוף זכוכית, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780הכלאה של הגשש על השקף.
שקוף זכוכית, נקי מראשVWR48311-703להורדת מפרקי מטאפזה ולביצוע DNA-FISH.
חממה מאווררת ב-CO2מכל מקורNAדגירת תאים חיים.
Buffer הכלאהEmpire GenomicsHyb-BufferBuffer המשמש עם הגשש. 
דלי קרחמכל מקורNAשמירת הקירור של הקרנויס פיקסיטיב. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640Gהתנפחות תאים לפני קיבוע. 
מתנול, 99.9%, בדרגת HPLCMillipore Sigma1060351000לקרנויס פיקסיטיב. 
מיקרוצנטריפוגהמכל מקורNAצנטריפוגה. 
צינורות מיקרוצנטריפוגהמכל מקורNAלתאים במהלך קיבוע, ולהכנת הגשש. 
MYC / SE 8 ProbeLeicaKI-10106כתם פלואורסצנטי ספציפי ללוקוס. 
PBS, pH 7.4Gibco10010-023שלבי שטיפה. 
מיקרוסקופ ניגוד פאזהמכל מקורNAהדמיה של מפרקי מטאפזה מייד לאחר הורדתם
קצות פיפטהמכל מקורNAפיפטה.
נתרן כלוריMillipore SigmaS9888ל-SSC buffer.
נתרן ציטראטMillipore Sigma567446ל-SSC buffer.
מים סטריליים טהורים במיוחדמכל מקורNAשלבי שטיפה. 
חממה תרמית ניתנת לתכנותמכל מקורNAדגירת שקף.
מלקחייםמכל מקורNAלשלבי שטיפה של השקף. 
אמבט מיםמכל מקורNAלדגירה ב-KCl. 

מקורות

  1. Albertson DG. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 2006;22:447-455.
  2. Bagci O, Kurtgöz S. Amplification of cellular oncogenes in solid tumors. N Am J Med Sci. 2015;7:341-346.
  3. Schimke RT, et al. Gene amplification and drug resistance in cultured animal cells. Cancer Treat Rev. 1984;11:9-17.
  4. Baker TM, Waise S, Tarabichi M, Van Loo P. Aneuploidy and complex genomic rearrangements in cancer evolution. Nat Cancer. 2024;5:228-239.
  5. Ohshima K, et al. Integrated analysis of gene expression and copy number identified potential cancer driver genes with amplification-dependent overexpression in 1,454 solid tumors. Sci Rep. 2017;7:641.
  6. Pecorino LT, Verhaak RGW, Henssen A, Mischel PS. Extrachromosomal DNA (ecDNA): An origin of tumor heterogeneity, genomic remodeling, and drug resistance. Biochem Soc Trans. 2022;50:1911-1920.
  7. Cox D, Yuncken C, Spriggs AI. Minute chromatin bodies in malignant tumours of childhood. Lancet. 1965;286:55-58.
  8. Kohl NE, et al. Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell. 1983;35:359-367.
  9. Giollant M, et al. Characterization of double minute chromosomes' DNA content in a human high-grade astrocytoma cell line using comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization. Hum Genet. 1996;98:265-270.
  10. Stephens PJ, et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell. 2011;144:27-40.
  11. Zhang CZ, et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 2015;522:179-184.
  12. Lange JT, et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 2022;54:1527-1533.
  13. Turner KM, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature. 2017;543:122-125.
  14. Wu S, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575:699-703.
  15. Deshpande V, et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 2019;10:392.
  16. Levan A, Levan G. Have double minutes functioning centromeres? Hereditas. 1978;88:81-92.
  17. Stöber MC, et al. Intercellular extrachromosomal DNA copy-number heterogeneity drives neuroblastoma cell state diversity. Cell Rep. 2024;43:114711.
  18. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Amplified dihydrofolate reductase genes in unstably methotrexate-resistant cells are associated with double minute chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:5669-5673.
  19. Kim H, et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 2020;52:891-897.
  20. Schlesinger HR, et al. Establishment and characterization of human neuroblastoma cell lines. Cancer Res. 1976;36:3094-3100.
  21. Balaban-Malenbaum G, Gilbert F. Double minute chromosomes and the homogeneously staining regions in chromosomes of a human neuroblastoma cell line. Science. 1977;198:739-741.
  22. Gilbert F, et al. Homogeneously staining region in a retinoblastoma cell line: Relevance to tumor initiation and progression. J Natl Cancer Inst. 1981;67:301-306.
  23. Quinn LA, Moore GE, Morgan RT, Woods LK. Cell lines from human colon carcinoma with unusual cell products, double minutes, and homogeneously staining regions. Cancer Res. 1979;39:4914-4924.
  24. Montgomery KT, Biedler JL, Spengler BA, Melera PW. Specific DNA sequence amplification in human neuroblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:5724-5728.
  25. Singer MJ, et al. Amplification of the human dihydrofolate reductase gene via double minutes is initiated by chromosome breaks. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:7921-7926.
  26. Shimizu N. Gene amplification and the extrachromosomal circular DNA. Genes (Basel). 2021;12:1533.
  27. Carroll SM, et al. Double minute chromosomes can be produced from precursors derived from a chromosomal deletion. Mol Cell Biol. 1988;8:1525-1533.
  28. Alitalo K, et al. Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene (c-myc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:1707-1711.
  29. George DL, Powers VE. Amplified DNA sequences in Y1 mouse adrenal tumor cells: Association with double minutes and localization to a homogeneously staining chromosomal region. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:1597-1601.
  30. Storlazzi CT, et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome Res. 2010;20:1198-1206.
  31. Biedler JL, Meyers MB, Spengler BA. Homogeneously staining regions and double minute chromosomes, prevalent cytogenetic abnormalities of human neuroblastoma cells. In: Fedoroff S, Hertz L, editors. Advances in Cellular Neurobiology. Academic Press; New York, NY; 1983. p. 267-307.
  32. Shoshani O, et al. Chromothripsis drives the evolution of gene amplification in cancer. Nature. 2021;591:137-141.
  33. Nathanson DA, et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 2014;343:72-76.
  34. Song K, et al. Plasticity of extrachromosomal and intrachromosomal BRAF amplifications in overcoming targeted therapy dosage challenges. Cancer Discov. 2022;12:1046-1069.
  35. Kang X, et al. Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with the DNA damage pathway in tumors. Cell. 2025;188:3405-3421.e27.
  36. Pommier Y, Nussenzweig A, Takeda S, Austin C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23:407-427.
  37. Coquelle A, et al. Expression of fragile sites triggers intrachromosomal mammalian gene amplification and sets boundaries to early amplicons. Cell. 1997;89:215-225.
  38. Coquelle A, et al. A new role for hypoxia in tumor progression: Induction of fragile site triggering genomic rearrangements and formation of complex double minutes and homogeneously staining regions. Mol Cell. 1998;2:259-265.
  39. Mandahl N, Mertens F, Mitelman F. Gene amplification in neoplasia: A cytogenetic survey of 80,131 cases. Genes Chromosomes Cancer. 2024;63:e23214.
  40. Roepman P, et al. Clinical validation of whole genome sequencing for cancer diagnostics. J Mol Diagn. 2021;23:816-833.
  41. Ho SS, Urban AE, Mills RE. Structural variation in the sequencing era. Nat Rev Genet. 2020;21:171-189.
  42. Rajkumar U, et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 2019;21:428-435.
  43. Purshouse K, Pollard SM, Bickmore WA. Imaging extrachromosomal DNA (ecDNA) in cancer. Histochem Cell Biol. 2024;162:53-64.
  44. Shapiro DN, et al. Detection of N-myc gene amplification by fluorescence in situ hybridization: Diagnostic utility for neuroblastoma. Am J Pathol. 1993;142:1339-1346.
  45. Krupina K, et al. Chromothripsis and ecDNA initiated by N4BP2 nuclease fragmentation of cytoplasm-exposed chromosomes. Science. 2025;390:1156-1163.
  46. Trask BJ, Hamlin JL. Early dihydrofolate reductase gene amplification events in CHO cells usually occur on the same chromosome arm as the original locus. Genes Dev. 1989;3:1913-1925.
  47. Biedler JL, Spengler BA. A novel chromosome abnormality in human neuroblastoma and antifolate-resistant Chinese hamster cell lines in culture. J Natl Cancer Inst. 1976;57:683-695.
  48. Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75:5553-5556.
  49. Gapski GR, et al. Synthesis of a fluorescent derivative of amethopterin. J Med Chem. 1975;18:526-528.
  50. Verma RS, Babu A. Tissue culture techniques and chromosome preparation. In: Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. Pergamon Press; 1989. p. 4-45.
  51. Moorhead PS, et al. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res. 1960;20:613-616.
  52. Ohara H, Terasima T. Colcemid effects on mitotic synchrony and synchronized cells. Cell Struct Funct. 1976;1:187-195.
  53. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Loss and stabilization of amplified dihydrofolate reductase genes in mouse sarcoma S-180 cell lines. Mol Cell Biol. 1981;1:1084-1093.
  54. Marsden CG, Dragon JA, Wallace SS, Sweasy JB. Base excision repair variants in cancer. Methods Enzymol. 2017;591:119-157.
  55. Nichols A, et al. Chromosomal tethering and mitotic transcription promote ecDNA nuclear inheritance. Mol Cell. 2025;85:2839-2853.e8.
  56. Henegariu O, et al. Improvements in cytogenetic slide preparation: Controlled chromosome spreading, chemical aging, and gradual denaturing. Cytometry. 2001;43:101-109.
  57. Lichter P, et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet. 1988;80:224-234.
  58. Pinkel D, et al. Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:9138-9142.
  59. Sumner AT, Evans HJ, Buckland RA. New technique for distinguishing between human chromosomes. Nature New Biol. 1971;232:31-32.
  60. Howe B, Umrigar A, Tsien F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. 2014;e50203.
  61. Cavalli G, Misteli T. Functional implications of genome topology. Nat Struct Mol Biol. 2013;20:290-299.
  62. Kosak ST, Groudine M. Form follows function: The genomic organization of cellular differentiation. Genes Dev. 2004;18:1371-1384.
  63. Sehgal P, Chaturvedi P. Chromatin and cancer: Implications of disrupted chromatin organization in tumorigenesis and its diversification. Cancers (Basel). 2023;15:466.
  64. Misteli T. Beyond the sequence: Cellular organization of genome function. Cell. 2007;128:787-800.
  65. Zhu Y, et al. Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription. Cancer Cell. 2021;39:694-707.
  66. Hung KL, et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 2021;600:731-736.
  67. Taghbalout A, et al. Extrachromosomal DNA associates with nuclear condensates and reorganizes chromatin structures to enhance oncogenic transcription. Cancer Cell. 2025;43:2191-2205.e6.
  68. Hsu TC, Pomerat CM. Mammalian chromosomes in vitro: II. A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture. J Hered. 1953;44:23-30.
  69. Erwin GS, Bhimsaria D, Eguchi A, Ansari AZ. Mapping polyamide-DNA interactions in human cells reveals a new design strategy for effective targeting of genomic sites. Angew Chem. 2014;126:10288-10292.
  70. Erwin GS, et al. Synthetic genome readers target clustered binding sites across diverse chromatin states. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E7418-7427.
  71. Erwin GS, et al. Synthetic transcription elongation factors license transcription across repressive chromatin. Science. 2017;358:1617-1622.
  72. Erwin GS, et al. Recurrent repeat expansions in human cancer genomes. Nature. 2023;613:96-102.
  73. Shimizu N, Kanda T, Wahl GM. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 1996;12:65-71.
  74. Jaworski JJ, et al. ecDNA replication is disorganized and vulnerable to replication stress. Nucleic Acids Res. 2025;53:gkaf711.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ביולוגיהגיליון 234גיליון 234ערך ריקגיליוןהיברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH)פריסת מטאפאזהכרומוזוםecDNADNA חוץ-כרומוזומליאזור צביעה הומוגניתHSRקריוטיפהגברה גנטית
מטאפאזה DNA-FISH מתפשטת כדי להבחין בין DNA חוץ-כרומוזומי לבין אזורים עם צביעה הומוגנית בקווי תאים סרטניים אנושיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.