דגימת דם מעורק הזנב בחולדות תחת הרדמה באיזופלורן מאפשרת איסוף מבוקר ודל-stress של נפחי דם גדולים יחסית. התאוששות מהירה והתאמה לדגימה חוזרת הופכות שיטה זו לאידיאלית למחקרי אורך הדורשים פרמטרים פיזיולוגיים אמינים.
דוח מהיר
דגימת דם מעורק הזנב בחולדות תחת הרדמה באיסופלורן מפחיתה סטרס ומשפרת את המהימנות
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטה זו מתארת דגימת דם דרך עורק הזנב בחולדות תחת הרדמה באיסופלורן (isoflurane). השימוש באיסופלורן ממזער תנועות הגנה, ובכך מאפשר הליך מבוקר ודל-סטרס עבור בעל החיים והחוקר כאחד. יתרונות נוספים כוללים התאוששות מהירה של בעלי החיים לאחר הדגימה בשל טבעו קצר-הפעולה של האיסופלורן, היכולת לאסוף נפחי דם גדולים יחסית מנקב דקירה בודד, והתאמת הטכניקה לדגימות דם חוזרות. בנוסף, זרימת הדם העורקית המהירה עשויה להפחית את הסבירות לארטפקטים של קרישה, אם כי נושא זה לא הוערך באופן ספציפי במחקר הנוכחי. התוצאות נקבעו כחלק ממחקר פרמקוקינטיקה. איסוף הדם הצליח בכל בעלי החיים, מה שהוביל לשיעור הצלחה של 100% בדגימה. לא נצפתה ירידה משמעותית במשקל הגוף 24 h לאחר דגימת הדם, ובעלי החיים הראו התאוששות מהירה ללא סימנים גלויים למצוקה או סיבוכים הקשורים להליך. באופן כללי, גישה זו מתאימה מאוד למסגרות ניסוי הדורשות איסוף דם אמין וניתן לשחזור עם מינימום סטרס מטפל. לאחר שלב למידה קצר, ההליך הוכח כאמין לשימוש ניסויי שגרתי. עם זאת, יש לשקול את ההשפעה הפוטנציאלית של הרדמה באיסופלורן על גזים בדם ועל פרמטרים מטבוליים ואנדוקריניים בעת תכנון ניסויים ופירוש התוצאות.
מבוא
דגימת דם היא טכניקה מרכזית במחקר ניסויי באמצעות חולדות להערכת פרמטרים פיזיולוגיים ופרמקוקינטיים. הטכניקות המומלצות כוללות חתך בזנב, דגימה מווריד הזנב הלטראלי, וריד הספנוס, וריד התת-לשוני, וריד הג'וגולריס, סינוס רטרו-אורביטלי וקטטרים1,2,3,4,5,6,7. עם זאת, בחירת השיטה תלויה בתוצאות הרצויות, ולכל אחת מהן מגבלות מובנות.
דגימה מווריד הזנב הלטראלי וחיתוך הזנב עשויים להניב נפחים מוגבלים, בעוד שדגימה רטרו-אורביטלית, למרות יעילותה, היא פולשנית יותר, משפיעה על ההחלמה1 וכרוכה בסיכונים לנזק רקמתי4,8 ובחששות אתיים. דגימה מווריד הספנה דורשת קיבוע וגילוח של נקודת הדקירה2, דבר שעלול לגרום לסטרס ולהשפיע על תוצאות הניסוי. דגימות דם חוזרות מווריד הספנה עלולות להיות מאתגרות בשל אורכו הקצר של הווריד וההמוסטזיס. הדבר נכון גם לגבי הווריד התת-לשוני. למרות שניתן להוציא נפחי דם גדולים במהירות באמצעות דקירה של הווריד הג'וגולרי, קיימת סכנה לפגיעה בריאות המובילה לפנומותרקס. כמו כן, מכיוון שהווריד אינו נראה, יש לבצע את הדקירה באופן עיוור6.
בהקשר זה, שיטות מעודכנות הממזערות את סבל בעלי החיים תוך הבטחת איכות דגימה טובה הופכות לחשובות יותר ויותר. דגימת דם מעורק הזנב תחת הרדמה באיסופלורן מציעה גישה כזו. השימוש בהרדמה בשאיפה בעלת השפעה קצרה מפחית את הלחץ הנובע מהטיפול ומקל על ביצוע הליך מבוקר. בנוסף, איסוף דם עורקי צפוי לספק דגימות דם באיכות גבוהה עם סיכון מופחת לארטפקטים של קרישה בשל זרימת הדם המהירה. הטכניקה מתאימה במיוחד לדגימה חוזרת ולעיצובי מחקר אורך, שכן בעלי החיים מתאוששים במהירות וההפרעה הפיזיולוגית היא מינימלית. באופן כללי, שיטה זו משלבת אמינות טכנית עם רווחת בעלי חיים משופרת, ולכן היא מתאימה מאוד למסגרות ניסוייות הדורשות מדידות דם מדויקות וניתנות לשחזור.
פרוטוקול
כל הניסויים שבהם נעשה שימוש בשיטה המוצגת אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית בווינה ומשרד החינוך, המדע והמחקר האוסטרי.
1. הכנה
הערה: הכינו את כל החומרים הנדרשים לפני ההרדמה כדי להבטיח הליך חלק ויעיל.
- מלא את המזרק בציטראט 3.2% (הכמות תלויה בפרמטרים הרצויים) למניעת קרישת דם.
- כוון את זרימת החמסן ל-0.5 L/min, תוך הזרחתו אל תוך תא ההשראה והמסכה.
- חסום את הצינור המחובר למסכה כדי להבטיח שגז ההשראה והחמסן יופנו אך ורק אל תוך התא.
- הוצא את החולדה מהכלוב והנח אותה בתא ההשראה.
- סגור את מכסה תא ההשראה, תוך כדי וידוא שזנב החולדה או רגליה אינם נצבטים.
- כוון את האיסופלורן ל-3% (בהתאם למערכת הצינורות) ושמור על רמה זו עד שהחיה תראה אובדן של תנועה ספונטנית ושל רפלקס ההצדקה.
- נער בעדינות את התא קדימה ואחורה כדי לאשר את אובדן רפלקס ההצדקה.
- חסום את הצינור המחובר לקופסה כדי להסיט את הגז והחמסן אל המסכה.
- פתח את מכסה התא והוצא את החולדה.
- הנח את החולדה במצב גב על משטח חימום (38 °C), כאשר אפה ממוקם בתוך המסכה (איור 1).
- נקה את הזנב עם מים ויבש בעזרת נייר סופג.
- חטא את הזנב בעזרת אלכוהול.
- אשר את היעדרו של הרפלקס הבין-אצבעי על ידי צביטה בין אצבעות הגפה האחורית של החולדה ווידוא היעדר תגובת נסיגה.
איור 1מיקום החולדה. החולדה מונחת על גבה, כאשר אפה ממוקם בתוך מסכת ההרדמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
2. דגימת דם
הערה: העורק ממוקם בצד הוונטרלי (הבטני) של הזנב. אתר הדקירה האופטימלי נמצא בין החלק האמצעי לחלק הדיסטלי של הזנב. העורק מזוהה בעיקר לפי מיקומו האנטומי, אך בחולדות בעלות פיגמנטציה קלה (למשל, Sprague Dawley), העורק הוונטרלי של הזנב עשוי להיות נראה לעיתים ככלי דם כחלחל ועמום. במקרה זה, ניתן בדרך כלל לזהות בקלות את העורק הוונטרלי של הזנב בבסיס הזנב לפי מיקומו האנטומי בקו האמצע הוונטרלי. לאחר הזיהוי, ניתן לעקוב אחר מסלולו לכיוון דיסטלי עד לאתר הדקירה המתוכנן.
- עקבו אחר העורקי מהקצה הפרוקסימלי לדיסטלי.
- כוון את שיפוע המחט כלפי מעלה.
- החדירו את המחט בזווית של כ-30 ° (איור 2).
- העבירו את המחט קראניאלית ולאחר מכן במקביל לזנב (איור 2).
- שאבו דם למזרק (איור 2).
הערה: אם ניתן להחדיר את המחט בקלות, שאבו את נפח הדם הנדרש בהתאם להנחיות הרלוונטיות. אם לחץ הדם נמוך מדי לדגימה, הפחיתו את ריכוז האיסופלורן ל-2.5% וחזרו על הפרוצדורה מבלי להוציא את המחט מאתר הדקירה. עבור כל דגימת דם עוקבת, יש למקם את אתר הדקירה קראניאלית לאתר הקודם. - השתמשו בטמפון כדי ללחוץ על אתר ההזרקה לפני הוצאת המחט.
- כבו את הרCדמיה הגזית ובדקו את אתר ההחדרה.
הערה: ברגע שהדימום פסק, החזירו את החולדה לכלוב המגורים שלה.
איור 2אתר הדקירהאתר הדקירה ממוקם בצד הבטני בין השליש האמצעי לשליש המרוחק של הזנב, ויש להחדיר את המחט בזווית של 30°. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
3. עיבוד דם
- שפכו את הדם שנאסף לתוך מבחנה.
- שמרו את הדם על קרח עד לסבב הצנטריפוגה.
תוצאות
הנתונים המוצגים במאמר שיטה זה התקבלו במהלך מחקר פרמקוקינטי. המחקר כלל רק חולדות זכרים מסוג Sprague Dawley בגיל 6–8 שבועות, עם משקל גוף שנע בין 393 g ל-429 g. דגימת דם אחת (0.3 mL) נלקחה מעורק הזנב ביום 0. משקל הגוף נרשם מיד לפני איסוף הדם ושוב 24 h לאחר הדגימה. הגז השהר התנשף במהירות, והחיות התאוששו במהירות. זמן קצר לאחר מכן, הן החלו לאכול ולא הראו סימנים לפגיעה ברווחתם הכללית. החולדות לא הפגינו סימני מצוקה או פחד כאשר הוצאו מהכלוב לדגימות דם עוקבות. כמו כן, לא נצפתה התנהגות הגנתית בימים שלאחר הפרוצדורה. לא נצפו המטומות על הזנב כאשר הפרוצדורה בוצעה נכון. החיות לא הראו סימני כאב מיד לאחר שאיבת הדם או בימים שבאו לאחר מכן, ואתרי שאיבת הדם בזנבותיהן היו חסרי כאב למגע. לא נצפתה ירידה במשקל הגוף בתוך 24 h לאחר איסוף הדם. משקל הגוף הממוצע עלה מ-409 g ביום 0 ל-419 g ביום 1, מה שמתאים לעלייה ממוצעת במשקל הגוף של 2.6% ±± 1.1%, דבר המצביע על כך שפרוצדורת דגימת הדם נסבלה היטב (איור 3).
איור 3שינוי במשקל הגוףמשקל גוף (בגרמים) לפני (יום 0) ו-24 שעות לאחר (יום 1) דגימת דם בחולדות (n = 12). לא נצפתה ירידה במשקל הגוף לאחר איסוף הדם. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מורחבת של דמות זו.
דיון
טכניקת דגימת הדם מעורק הזנב המוצגת מתאימה במיוחד למחקרים הדורשים דגימות דם חוזרות או נפחי דגימות דם גדולים יחסית. בהשוואה לדגימה מווריד הזנב, טכניקה זו מקלה על איסוף נפחי דם גדולים יותר מאתר דקירה בודד ועשויה להעניק יתרונות מעשיים לדגימות חוזרות, שכן ניקור ורידי חוזר עלול להפוך למאתגר יותר עקב היווצרות המטומה ונגישות מופחתת לווריד. על פי המלצות Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) ו-Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), איסוף דם בודד לא יעלה על 10% מנפח הדם במחזור, בעוד שדגימות יומיות חוזרות תוגבלו לכ-1% מנפח הדם במחזור ל-24 h, ולאחריהן תקופת התאוששות מתאימה. הטכניקה המתוארת מאפשרת להשיג נפחי דגימה מומלצים אלו באופן מהימן וניתן לשחזור, מה שהופך אותה למתאימה הן לפרוטוקולים של איסוף דם בודד והן לפרוטוקולים של איסוף דם חוזר.
טכניקה אידיאלית לאיסוף דם צריכה לספק נפחי דם מספיקים עבור האנליזות המתוכננות, תוך מזעור הסטרס הפרוצדורלי והבטחת דגימות באיכות גבוהה. איסוף דם מהמקלעת הורידית רטרו-אורביטלית (retro-orbital venous plexus) ומהוריד הסב-לשוני עלול להוביל לבעיות קרישה עקב טראומה לרקמה8,9, דבר שיהיה תת-אופטי למחקרי קרישה. באופן דומה, טכניקות של טפטוף — כגון "milking" של וריד הזנב — עלולות להוביל גם הן לקרישה שנגרמה מהדגימה. בהשוואה לשיטות דגימה אלו, דם עורקי המופק דרך הזנב נראה פחות נוטה לקרישה מוקדמת. ניתן לייחס זאת לתהליך האיסוף המהיר, להיעדר טראומה לרקמה ולמגע המיידי של הדם עם ציטראט במזרק, המונע ביעילות קרישה. טכניקות אחרות, כגון פנצ'ור של הווריד הג'וגולרי (jugular vein), טומנות סיכון לנזק לאיברים1,6, ונהלי קתטריזציה מומלצים דורשים הרדמה כללית, ולאחריה טיפול פוסט-אופרטיבי וניהול פצעים. שטיפה סדירה של הקתטר נחוצה כדי למנוע חסימות, וישנו תמיד הסיכון שהבעלי החיים יסירו את הקתטר.
איסוף דם מהעורק הזנבי (caudal artery) דורש הרגעה קצרה, שכן יש להניח את בעלי החיים במצב גב (supine position) והדקירה היא כואבת, מה שמעלה את הסבירות לתנועות הגנה. שימוש בהרדמה באמצעות isoflurane ממזער תנועות הגנה, ומאפשר ביצוע של הפרוצדורה באופן מבוקר ויעיל. כתוצאה מכך, ניתן להשלים את איסוף הדם במהירות, דבר המפחית את העומס הכולל על בעל החיים בהשוואה לטכניקות של ניקור וריד (venipuncture) באמצעות וריד הזנב, שם איסוף כמות הדם הרצויה עשוי להיארך יותר. היעדר תנועות הגנה מפחית גם את הסבירות לדקירות מחט חוזרות. חשוב לציין כי בעלי החיים אינם תופסים את הפרוצדורה באופן מודע, הם מתאוששים במהירות ובדרך כלל חוזרים להתנהגות רגילה זמן קצר לאחר הדגימה1. לאחר איסוף הדם, בעלי החיים התאוששו במהירות מההרדמה ב-isoflurane ובדרך כלל חזרו להתנהגות רגילה זמן קצר לאחר מכן. במחקר הנוכחי, משקל גוף שנמדד 24 h לאחר דגימת הדם הראה עלייה קלה בהשוואה למצב הבסיס, מה שמעיד על כך שצריכת המזון לא נפגעה מהפרוצדורה ותומך בהתאוששות קצרת טווח ללא סיבוכים.
ידוע כי Isoflurane מפחית את לחץ הדם10,11, דבר שעלול לסבך דגימת דם ורידית עקב מילוי ורידי מופחת. לעומת זאת, ביצוע דגימה ורידית ללא הרדמה דורש קיבוע1,2, שעלול להשריע סטרס משמעותי ולהשפיע פוטנציאלית על תוצאות הניסוי. מעבר לכך, סטרס גורם לכיווץ כלי דם (vasoconstriction), שעלול אף הוא להקשות על איסוף הדם. ירידה בלחץ הדם עלולה להשפיע גם על דגימה עורקית; עם זאת, בניסיוננו, ניתן לנהל בעיה זו בקלות על ידי התאמת ריכוז ה-Isoflurane, ובכך לשמור על זרימת דם מספקת לצורך הדגימה.
עם זאת, ידוע כי Isoflurane משפיע גם על פרמטרים פיזיולוגיים, ובמיוחד על ערכי גזי דם, בשל דיכוי נשימתי12,13. Isoflurane עלול להשפיע על תפקודי הנשימה ועל חילוף גזים, ובכך לשנות פוטנציאלית את רמות החמצן והפחמן הדו-חמצני העורקיים. מספר מחקרים הראו כי Isoflurane יכול לשנות גם פרמטרים מטבוליים ואנדוקריניים, כולל גלוקוז בדם, לקטט, אינסולין, קורטיקוסטרון ומטבוליזם של ליפידים14,15,16. עם זאת, נמצא כי Isoflurane גורם לפחות שינויים בפרמטרים הקשורים למתח מאשר משטרי הרדמה אחרים, והוא מביא עמו יתרונות של השראה מהירה, זמן התאוששות קצר ובקרה מדויקת על עומק ההרדמה, מה שהופך אותו למתאים לדגימות דם שגרתיות14. כתוצאה מכך, יש לקחת בחשבון את ההשפעה הפוטנציאלית של Isoflurane בעת תכנון וניתוח ניסויים, שכן דגימות דם עורקיות שהושגו תחת הרדמה עשויות שלא לשקף במדויק את התנאים הפיזיולוגיים הבסיסיים. עם זאת, עבור מחקרי פרמקוקינטיקה, השפעות אלו הן לרוב בעלות רלוונטיות מינורית בהשוואה ליתרונות של השגת דגימות דם הניתנות לשחזור תוך מזעור המתח הנובע מהטיפול בבעל החיים.
שיקול נוסף הוא החשיפה התעסוקתית של הבודק ל-isoflurane. מאחר שהמערכת אינה סגורה לחלוטין, קיים סיכון לחשיפה לגז הרדמה במהלך הפרוצדורה. עבודה תחת מנדף זרימה למינרית או שימוש במערכות שאיבה מתאימות ימזערו את החשיפה, אך ייתכן שציוד כזה אינו זמין בכל סביבת ניסוי.
באופן כללי, הטכניקה המתוארת מהווה חלופה בעלת ערך לשיטות דגימת דם קונבנציונליות, שכן היא משלבת איכות דגימה טובה צפויה עם הפחתה במתח ושיפור בתנאי הטיפול. היא מספקת יתרונות ברורים מבחינת רווחת בעלי החיים ויעילות הפרוצדורה. התאמתה תלויה בסופו של דבר בשאלת המחקר הספציפית, אך היא יעילה במיוחד במסגרות ניסיוניות שבהן פרמטרים מהימנים של הדם והפרעה פיזיולוגית מינימלית הן חיוניות.
גילויים
למחבר אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
המחברת מעוניינת להודות ל Katharina Tillmann על כך שהעניקה לה השראה לפרסם שיטה זו.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת הרדמה | Dräger | https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products | הרדמה גזית |
| מבחנת Citrate Vacuette (נתרן ציטראט 3.2%) | Greiner Bio-One | 454332 | נוגד קרישה |
| מבחנת Eppendorf 1.5 mL | Eppendorf | 3,01,25,150 | אחסון דם |
| Isoflurane נוזלי (Isospire) | Dechra | הרדמה גזית | |
| מחט (25 G ´ 5/8'') | BD Microlance | 300600 | דגימת דם |
| מזרק 1 mL (Tuberculin Luer) | Chirana | CHTUB01 | דגימת דם |
| Thermomaquet 2000 | Maquet | Thermomaquet 2000 | מערכת חימום |
| סמרטוט תא צלולוזה Zelletten בגודל 5 cm ´ 4 cm | Lohmann&Rauscher | המוסטזיס |
מקורות
- Toft, M., Peterson, M. H., Dragsted, N., Hansen, A. K. The impact of different blood sampling methods on laboratory rats under different types of anaesthesia. Laboratory Animals. 40, 261-274 (2006).
- Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guineapig, ferret and mink. Laboratory Animals. 32, 364-368 (1998).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- National Institutes of Health, Office of Animal Care and Use. . Guidelines for survival blood collection in mice and rats. , (2025).
- Xu, Y., Zhu, Y., Lin, J., Borlak, J. Serial blood collection in anaesthetised rats: Enhancing animal welfare without the need for jugular vein catheterisation. Regul Toxicol Pharmacol. 164, 105988 (2026).
- Fluttert, M., Dalm, S., Oitzl, M. S. A refined method for sequential blood sampling by tail incision in rats. Laboratory Animals. 34, 372-378 (2000).
- Salemink, P. J. M., Korsten, J., de Leeuw, P. Prothrombin times and activated partial thromboplastin times in toxicology: a comparison of different blood withdrawal sites for Wistar rats. Comp Haematol Int. 4, 173-176 (1994).
- Seibel, J., et al. Comparison of haematology, coagulation and clinical chemistry parameters in blood samples from the sublingual vein and vena cava in Sprague-Dawley rats. Laboratory Animals. 44, 344-351 (2010).
- Albrecht, M., et al. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: a telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Vet Res. 10, 310 (2014).
- Janssen, B. J. A., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H1618-H1624 (2004).
- Flecknell, P. . Laboratory animal anaesthesia. , (2009).
- Tsukamoto, A., et al. Combining isoflurane anesthesia with midazolam and butorphanol in rats. Exp Anim. 65 (3), 223-230 (2016).
- Arnold, M., Langhans, W. Effects of anesthesia and blood sampling techniques on plasma metabolites and corticosterone in the rat. Physiol Behav. 99, 592-598 (2010).
- Rauch, E., Ari, C., D'Agostino, D. P., Kovács, Z. Exogenous ketone supplement administration abrogated isoflurane-anesthesia-induced increase in blood glucose level in female WAG/Rij rats. Nutrients. 16 (10), 1477 (2024).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comp Med. 67 (2), 122-132 (2017).
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאהתגיות
