פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה סטנדרטי וניתן לשחזור להערכת יכולת השגשוג והגזירה האוסטאוגנית והאודונטוגנית של תאי גזע דנטליים אנושיים שגודלו על פיגומים של ננו-חומרים, תוך שימוש במבחנים סטנדרטיים (פעילות ALP, אימונופלואורסצנציה של RANKL [אוסטאוגנית], ואימונופלואורסצנציה של DMP-1 [אודונטוגנית]) ואסטרטגיות נורמליזציה כדי להבטיח יכולת השוואה בין מחקרים.
מאמר שיטה
פרוטוקול In Vitro סטנדרטי להערכת דיפרנציאציה ושגשוג של תאי גזע מפולפה שיניים אנושית על פיגומים של ננו-חומרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הערכה מהימנה של דיפרנציאציה אוסטאוגנית ואודונטוגנית, כמו גם של פרוליפרציה של תאי גזע, היא חיונית להערכת הביצועים הביולוגיים של אסטרטגיות רגנרטיביות המבוססות על פיגומים. עם זאת, שונות בפרוטוקולים ניסיוניים, בבחירת הבדיקות ובפרשנות הנתונים מגבילה לעיתים קרובות את השחזוריות ואת ההשוואה בין מחקרים. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מציג זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכה in vitro של דיפרנציאציה אוסטאוגנית ואודונטוגנית, וכן של קיבולת פרוליפרטיבית, של תאי גזע המגודלים על פיגומים של חומרים ביולוגיים. מחויבות אוסטאוגנית מוערכת באמצעות פעילות אנזימטית של פוספטאז אלקלי (ALP) ואימונופלואורסנציה של Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand (RANKL), בעוד שמחויבות אודונטוגנית מוערכת באמצעות אימונופלואורסנציה של DMP-1 (dentin matrix protein-1); שני נקודות הקצה החלבוניות מכוממות באמצעות מתודולוגיית H-score סטנדרטית. פרמטרים ניסיוניים קריטיים, כולל צפיפות זריעת תאים, לוחות זמנים של אינדוקציה, תנאי בדיקה, אסטרטגיות נורמליזציה (כולל פעילות ALP מנורמלת לחלבון, חיוניות 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) מנורמלת לתאים, ו-H-score של אימונופלואורסנציה), וגישות לניתוח נתונים, מפורטים יחד עם הנחיות לפתרון בעיות כדי למזער שונות טכנית. המתודולוגיה יושמה כמסגרת סטנדרטית במגוון מחקרים ניסיוניים מבוססי פיגומים, והפגינה חסינות ושחזוריות. באמצעות אספקת מסגרת מקיפה ומאומתת, מאמר זה שואף להקל על הערכה סטנדרטית של אינטראקציות בין תאי גזע לפיגומים ולשפר את יכולת ההשוואה בין מחקרים רגנרטיביים פרה-קליניים.
מבוא
אנדודונטיה רגנרטיבית מייצגת שינוי פרדיגמה ברפואת שיניים, המתמקדת בשחזור חיוניות מחית השן באמצעות שימוש בתאי גזע, גורמי גדילה ופיגומים (scaffolds)1,2. שמירה על חיוניות המחית חיונית לתפקוד החושי ולתגובה החיסונית, והיא קריטית במיוחד בטיפול בשיניים שאינן בשלות עם מחית נמקית, כדי לאפשר המשך התפתחות השורש2.
תאי גזע מפולפה שיניים אנושית (DPSCs) ותאי גזע מהפפילה האפיקלית (SCAPs) הם מועמדים עיקריים להליכים אלו בשל פוטנציאל ההתרבות הגבוה שלהם, יכולת התחדשות עצמית, תכונות אימונו-סופרסיביות ויכולת להתמיין לתאים דמויי אודונטובלסטים תחת תנאים מיקרוסביבתיים מתאימים, מה שהופך אותם למועמדים בעלי היתכנות גבוהה ליישומים עתידיים ברפואה רגנרטיבית ובהתערבויות טיפוליות מבוססות תאים3,4,5.
בעוד שחומרים המנוסחים באופן קונבנציונלי, כגון מלט מבוסס סיליקט סידן, נבחנו בעבר, עדויות עולות כי מודיפיקציה של חלקיקים ננומטריים יכולה להשפיע באופן משמעותי על אינטראקציות בין חומרי ביו-חומרים לתאים6. ביו-חומרים בעלי מבנה ננומטרי עשויים לספק מיקרו-סביבה ביו-מימטית יותר, ובכך לשפר פוטנציאלית את היצמדות תאי גזע ואת הדיפרנציאציה לסוגי תאים ספציפיים7. עם זאת, ההתנהגות הביולוגית של חומרים חדשניים, כגון NeoMTA2 בצורת חלקיקים ננומטריים, אינה מובנת דיו בהשוואה לחומרים מבוססים, כגון ננו-הידרוקסיאפטיט8. פרוטוקול זה נותן מענה לצורך במסגרת מתודולוגית סטנדרטית להערכה מדויקת וניתנת לשחזור של אינטראקציות אלו.
מסגרת סטנדרטית זו מתאימה במיוחד למחקרים המעריכים ביו-חומרים חדשניים או פיגומים של ננו-חומרים תחת תנאים ביולוגיים זהים, שבהם השוואה בין מחקרים היא בעלת חשיבות עליונה. היא מציעה יתרונות על פני גישות של בדיקה בודדת על ידי שילוב של סריקת חיוניות (MTT), מחויבות אוסטאוגנית מוקדמת (פעילות ALP), ודיפרנציאציה ברמת החלבון (H-score של אימונופלואורסנציה) בתוך תהליך עבודה אחד. חוקרים המשתמשים בצביעת alizarin red קונבנציונלית או בבדיקות של נקודת זמן בודדת עשויים להפיק תועלת מאימוץ מסגרת רב-פרמטרית זו כדי להפחית הטיות של הצופה ולשפר את הרזולוציה הכמותית. עם זאת, פרוטוקול זה אינו מיועד לתרביות אורגנואידים תלת-ממדיות, למערכות של תרבית משותפת (co-culture), או למודלים של תאי גזע ממקור חייתי ללא התאמה מתאימה. חוקרים הדורשים פרופיל ביטוי גנים (למשל, RT-qPCR עבור RUNX2, OCN, או DSPP) צריכים להשלים תהליך עבודה זה בבדיקות מולקולריות, שכן הפרוטוקול הנוכחי מתמקד אך ורק בנקודות קצה חלבוניות ואנזימטיות.
כדי לתעד באופן מקיף את יכולת הדיפרנציאציה הדו-תפקודית של תאי גזע דנטליים, פרוטוקול זה משתמש בשני סממנים משלימים של אימונופלואורסצנציה המשקפים נקודות קצה ביולוגיות שונות. RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) משמש כסממן למחויבות לשורה אוסטאוגנית: ביטויו בתאים דמויי אוסטאובלסטים משקף אותות מינרליזציה המונעים על ידי יוני סידן והפעלה של תאים יוצרי עצם, בהתאם לשימושו במספר מחקרים שהעריכו SCAPs4,8,9. במקביל, DMP-1 (dentin matrix protein-1) משמש כסממן ספציפי לדיפרנציאציה אודונטוגנית/דנטינוגנית: עליית הביטוי שלו בתאים דמויי אודונטובלסטים משקפת את השראת היווצרות מטריצת הדנטין ותיקון רקמה קשה ספציפית למוך השן, והוא רלוונטי במיוחד כאשר אוכלוסיית תאי המטרה היא DPSCs10. על ידי כימות של RANKL ו-DMP-1 במסגרת ניסויית אחת באמצעות מתודולוגיית H-score, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להבחין בין מחויבות אוסטאוגנית למחויבות אודונטוגנית; שתי תוצאות חופפות אך שונות מבחינה מכניסטית של אינטראקציות בין תאי גזע לפיגום, ללא צורך בתכנוני ניסוי נפרדים.
פרוטוקול
פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואת שיניים, אוניברסיטת עין שמס, עם מספר אישור FDASU-Rec IM112105. כל ההליכים הכוללים רקמות אנוש בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי. הסכמות מדעת בכתב התקבלו מכל המשתתפים לפני עקירת השן ואיסוף התאי הגזע.
1. הכנה ואפיון של ננו-חומרים
- סנתז חומרי ננו לפי הדרישות הספציפיות10,11. עבור Nano-NeoMTA2, טחן את האבקה באמצעות טחנת כדורים פלנטרית (ראה טבלת חומרים) למשך 10 h במהירות של 350 rpm עם מרווחי הפעלה/כיבוי של 3 min. השתמש ביחס משקלי של כדורים לאבקה של 10:1 עם כדורי טחינה מזירקוניה (קוטר 5 mm) בתוך כלי טחינה מזירקוניה. אפעל את גודל החלקיקים הסופי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) (יעד: <200 nm) לפני ההמשך.
זהירות: אבקת NeoMTA2 עלולה לגרום לגירוי דרכי הנשימה במקרה של שאיפה. בצע את כל שלבי הטחינה היבשה במכסה מסיס מאושר תוך שימוש במסכת N95, משקפי מגן וכפפות ניטריל. - הכן ננו-הידרוקסיאפטיט באמצעות שיטת שיקוע כימית רטובה8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. הכן 1 L של תמיסת סידן ניטרט 0.5 M ו-0.6 L של תמיסת אמוניום פוספט 0.3 M, שתיהן במים דה-יוניים. טפטף את תמיסת הסידן ניטרט אל תוך תמיסת האמוניום פוספט בקצב של כ-2–3 mL/min תחת ערבוב רציף במהירות 400 rpm וחמם ל-70 °C, תוך שמירה על pH 10–12 באמצעות הוספה טיפית של אמוניום הידרוקסיד8.
זהירות: אמוניום הידרוקסיד הוא חומר קורוזיבי ומשחרר אדי אמוניה רעילים. טפל בו אך ורק במכסה מסיס כימי. הגן על עצמך באמצעות כפפות עמידות לחומצה, משקפי מגן מפני נתזים וחלוק מעבדה. במקרה של מגע עם העור, שטוף מיד במים למשך ≥15 min. - טפל במשקע האפטיט שהתקבל באופן הידרותרמי באוטוקלאב ב-140 °C ו-0.3 MPa למשך 2–3 h10. ייבש בהקפאה את המשקע המטוהר ב-50 °C- תחת ואקום של ≤0.05 mbar למשך 48 h8.
- הכן ננו-חלקיקי זכוכית ביו-אקטיבית 45S5 באמצעות שיטת sol-gel באופן הבא:
- הכן את תמיסת המקדימים על ידי ערבוב 40 mL של tetraethyl orthosilicate (TEOS) עם 10 mL של חומצה חנקית (HNO₃) 2 M כזרז חומצי בתוך כלי פוליפרופילן תחת ערבוב רציף במהירות 300 rpm בטמפרטורת החדר.
- לאחר 30 min, הוסף סידן ניטרט טטרהידראט (Ca(NO₃)₂·4H₂O) ונתרן ניטרט (NaNO₃) כדי להגיע להרכב המולרי המתוכנן: 45 mol% SiO₂, 24.5 mol% CaO, 24.5 mol% Na₂O ו-6 mol% P₂O₅. הוסף triethyl phosphate (TEP) כמקדים לזרחן.
- ערבב בטמפרטורת החדר למשך 24 h. יישן את הג'ל ב-60 °C למשך 24 h במכל אטום. ייבש ב-120 °C למשך 24 h. בצע קלצינציה בתנור מופלה ב-650 °C למשך 3 h (קצב עלייה: 2 °C/min). טחן ואשר את הרכב הפאזה באמצעות TEM ועקיפת קרני X (XRD)4,9.
זהירות: TEOS ואתנול הם חומרים דליקים. HNO₃ הוא חומר קורוזיבי. בצע את כל הפרוצדורות במכסה מסיס הרחק ממקורות הצתה.
- אפיין את כל הננו-חלקיקים שהוכנו באמצעות TEM ברזולוציה גבוהה ו-XRD כדי לאשר את גודל החלקיקים והגבישיות8. רשום את גודל החלקיקים הממוצע, את מדד הפולי-דיספרסיביות (PDI) ואת פוטנציאל הזטא באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) כדי לאשר את היציבות הקולואידית. קבל מנות עם גודל חלקיקים ממוצע <200 nm ופוטנציאל זטא <−15 mV או >+15 mV.
2. איסוף וגידול של תאי גזע
- הוצאת תאי גזע מהפולפה הדנטלית (DPSCs) או תאי גזע מהסביבה האפיתליאלית של מיליון השיניים (SCAPs) משיניים שלישיות תחתונות (ביניות) שחולצו זה עתה, לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב10יש לעבד שיניים שנשלפו בתוך שעתיים מהשליפה ולהובילהן בתמיסת סליין זרחתי (PBS) סטרילית בטמפרטורת 4 °C.
הערה: קריטריונים להבחרת תורמים כוללים מבוגרים בריאים מערכתית בגילאי 18–35, שאינם מעשנים, ללא היסטוריה של שימוש באנטיביוטיקה ב-3 החודשים preceding, ללא מחלה פריודונטלית וללא עדות רדיוגרפית לפתולוגיה פרי-אפיקלית. - בידוד תאים באמצעות שיטת עיכול אנזימטי9קצץ את רקמת השן לחתיכות בגודל של 1-2 מ"מ ועשה עיכול באמצעות תמיסת collagenase type I בריכוז של 3 מ"ג/מ"ל בתוך DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ללא סרום, למשך שעה אחת ב- 37 °C בערבוב רצוף במהירות של 60 סל"ד על פלטפורמה נדנדה (rocking platform)8נטרלו באמצעות מצע תרבית מלא וסננו דרך 70 µm מסנן תאים.
אזהרה: קולגנז (Collagenase) מסוג I עשוי להכיל אנדוטוקסינים. השתמשו אך ורק בקולגנז בדרגת תרבית רקמות שנבדק לאנדוטוקסינים. הגנו על עצמכם באמצעות כפפות והימנעו משאיפה. - זריעה של תרחיף תאים בודדים בבקבוק תרבית בנפח 75 סמ"ק2 בקבוקים בצפיפות התחלתית של 1 × 104 תאים/סמ"ק2 עם מצע גידול מלא המורכב מ-DMEM, 10% סרום בקר עוברי (FBS), ו-1% פניצילין/סטרפטומייצין (טבלת חומרים)8.
- דגרו את הבקבוקים ב- 37 °C באטמוספירה של 5% CO2₂8יש לנטר את הצמיחה והזיהום מדי יום באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך.10יש להחליף את מצע התרבית כל 48–72 שעות. יש להשליך כל בקבוק המראה סימני זיהום (עכירות, שינוי בצבע, מורפולוגיה לא תקינה של התאים).
- יש לקצור את התאים לאחר המעבר השלישי, כשהם מגיעים לכש 70%–80% התמזגות (confluency)8עבור מעבר (passaging), שאבו את המדיום, שטפו עם PBS, ונתקו את התאים באמצעות 0.25% trypsin-EDTA ב- 37 °C במשך 3–5 דקות. יש לנטרל באמצעות מצע תרבית מלא, ולסבב בצנטריפוגה במהירות של 300 x ג במשך 5 דקות, והזרע מחדש בריכוז של 1 × 104 תאים/סמ"ק2השתמשו רק בתאים שבין מעבר 3 למעבר 6 כדי לשמור על יציבות פנוטיפית.
3. אפיון תאי גזע
- בצעו הערכה של האימונופנוטיפ של התאים המבודדים באמצעות ציטומטריית זרימה8,10. אפיינו את התאים במעבר (passage) שלושה. כללו ביקורת שלילית ללא צביעה ובקרות פיצוי לצביעה בודדת עבור כל פלואורוכרום שנעשה בו שימוש.
- כווננו את ריכוז התאים ל-106/mL ב-PBS. סבבו בצנטריפוגה במהירות 800 x g למשך 10 min ושטפו את המשקע פעמיים ב-PBS8,10.
- צבעו את התאים באמצעות נוגדנים אנטי-אנושיים לסמנים מזנכימליים (CD44, CD73) וסמנים המטופויטיים (CD45) בדילול המומלץ על ידי היצרן (בדרך כלל 1:100 ב-PBS המכיל 1% bovine serum albumin (BSA) (טבלת החומרים)8,10. הדגירו ב-4 °C למשך 45 min בחשכה. שטפו פעמיים ב-PBS והשביו את התאים לתליה ב-300 µL PBS לצורך רכישת הנתונים.
- נתחו את התאים באמצעות תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה (טבלת החומרים) כדי להעריך את האימונופנוטיפ (ביטוי של CD44 ו-CD73, כאשר CD45 משמש כסמן להדרה המטופויטית). השתמשו בביצוע gating רצפי: (א) scatter gating (FSC-A לעומת SSC-A); (ב) הדרה של דובלטים (FSC-H לעומת FSC-A); (ג) שערים ספציפיים לפלואורוכרומים שנקבעו אל מול בקרות ללא צביעה. דווחו על אחוז התאים החיוביים לכל סמן יחד עם אסטרטגיית ה-gating.
4. קביעת ריכוז חומר בטוח (ריכוז יעיל חצאי-מקסים, EC₅₀)
- קבע את ה-EC₅₀ באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי (GraphPad Prism 9). התאם את נתוני תגובת המינון לעקומת סיגמואיד של רגרסיה לא ליניארית (מודל לוגיסטי בעל ארבעה פרמטרים: Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). דווח על ערך ה-EC₅₀ ב-µg/mL עם רווח בר סמך של 95%8.
- הכן מיהולי סדרה של הננו-חומרים (50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, ו-1.56 µg/mL) ב-1 mL PBS. ערבב את תמיסת המקור במכשיר וורטקס למשך 30 s, ולאחר מכן בצע סוניקציה (סוניקטור Probe, 40 W, 30 s פעילות/10 s הפסקה למשך 3 מחזורים ב-4 °C) כדי להבטיח סספנזיה הומוגנית. בצע עיקור ב-UV בתוך קבמינה לבטיחות ביולוגית תחת אור UV למשך 30 min.
- תרבת תאי גזע בצפיפות של 1 × 104 cells/well בלוחות 96-well למשך 72 h עם הריכוזים השונים, וספור תאים חיוניים באמצעות Trypan blue כדי לחשב את ה-EC₅₀ באמצעות המודל הלוגיסטי בעל ארבעת הפרמטרים שתואר בשלב 4.1.
- בצע את הניסויים בשלישייה (n = 3 בארות בלתי תלויות לכל ריכוז) עם לפחות שלוש חזרות ביולוגיות. דווח על ערכי EC₅₀ כממוצע ± SD וחשב את מקדם השונות (CV%) בין החזרות (CV מקובל <15%).
5. הערכת דיפרנציאציה אוסטאוגנית ואודונטוגנית
הערה: חלק זה מעריך שני מסלולי התמיינות משלימים באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנציה מקבילות מאותה הכנה של תאים. RANKL (שלב 5.5) משמש כסמן אוסטאוגני; DMP-1 (שלב 5.6) משמש כסמן אודונטוגני. שניהם נמדדים כמותית באמצעות אותה מתודולוגיית H-score (שלב 5.8). יש לבצע את שתי הבדיקות על כיסויי זכוכית נפרדים שהוכנו בו-זמנית.
- זריעו תאי גזע בפלטות של שישה בארות בצפיפות של 4.5 × 105 תאים לבאר. יש לאפשר לתאים להיקשר במשך 24 שעות במצע גידול מלא לפני תחילת הדיפרנציאציה.
- חלק את הדגימות לארבע קבוצות: ביקורת שלילית (DMEM לבדו), ביקורת חיובית (מדיום בידול אוסטאוגני/אודונטוגני), וקבוצות ניסוייות (ננו-חומרים בריכוז EC)₅₀ריכוזים בטוחים שנגזרו).
- הכינו מצע ג উদ הפרדה אוסטאוגנית על ידי תוספת של 10% FBS, 1% פניצילין/סטריפטומייצין ו-10 mM ל-DMEM βגליסרופוספט,- 50 µg/mL חומצה אסקורבית (L-ascorbate-2-phosphate), ו-100 nM דקסמתזון. יש להחליף את המצע בכל 48 שעות. דגירה למשך 72 שעות ב- 37 °C ו-5% CO2₂.
- מדידת פעילות ALP
- זרע תאים בלוחות תרבית בעלי 24 בארות בריכוז של 1 × 104 תאים לבור ודגרו ב- 37 °C באטמוספירה מלחחת עם 5% CO2₂ למשך 72 שעות.
- שאבו את מצע התרבית, שטפו את הבארות ב-PBS, ובצעו ליזה של התאים על ידי הוספת 200 µL של באפר ליזיס לכל באר (0.1% Triton X-100 ב-PBS) ודגירה ב- 4 °C במשך 10 דקות תוך כדי ניעור עדין.
- יש לאסוף את הליזאט ולסובב במערך צנטריפוגה במהירות של 500 x g ג במשך 5 דקות ב- 4 °C; השתמש בנוזל העיל (supernatant) לכל מדידות ה-ALP בהמשך התהליך. העבר 50 µL של כל דגימת בדיקה ו- 100 µL של תמיסות סטנדרט של p-ניטרופנול לתוך פלטת מיקרוטיטר של 96 בארות. הוסף בופר סובסטרט AMP (טבלת חומרים) כדי להתחיל את התגובה הקטליטית.
- בעקבות דגירה שנייה של 30 דקות ב- 37 °C, הפסיקו את התגובה על ידי הוספת 50 µL של 0.5 M NaOH לכל באער. מדוד את הבליעה באופן מיידי באורך גל של 405 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות לבליעה (טבלת חומרים).
- הפיקו עקומה סטנדרטית של בליעה (absorbance) מול ריכוז p-nitrophenol וחשבו את פעילות ה-ALP ביחידות של U/L.
- קבע את תכולת החלבון הכוללת של אותו ליזאט תאי באמצעות בדיקת חלבון מסוג Bradford או BCA. נרמל את פעילות ה-ALP לתכולת החלבון הכוללת ודווח על התוצאות הסופיות כיחידות של U/mg חלבון.
- סמן אוסטאוגני (RANKL)
- העריכו את ביטוי חלבון RANKL באמצעות אימונופלואורסצנציה. ראשית, הכינו בקרות איזוטיפ ובקרות לנוגדן משני בלבד: (א) החליפו את הנוגדן הראשוני ב-rabbit IgG תואם-איזוטיפ באותו ריכוז, ו-(ב) השמיטו את הנוגדן הראשוני לחלוטין בבארות נפרדות.
- קבעו את התאים ב-4% formaldehyde שהוכן טרי ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו שלוש פעמים ב-PBS (5 דקות בכל פעם).
- בצעו חדירה (Permeabilization) באמצעות 0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות, ולאחר מכן חסמו באמצעות 5% נסורת עזים נורמלית (normal goat serum) ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להפחית קישור לא ספציפי. ללא שטיפה, הוסיפו ישירות נוגדן ראשוני Rabbit Anti-RANKL בדילול של 1:200 בבופר חסימה (טבלת חומרים) ולהדגיר למשך לילה ב- 4 °C.
- שטפו שלוש פעמים ב-PBS, ולאחר מכן דגרו עם נוגדן משני אנטי-Rabbit IgG מעז, המשורשר לפלואורופור, בדילול של 1:500 בבופר חסימה (טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, בחושך8לאחר דגירה עם הנוגדן השני, שטפו שלוש פעמים ב-PBS (5 דקות בכל פעם) והמשיכו ישירות לשלב 5.7 לצורך הקיבוע (mounting).
זהירות: פורמלהיד (תמיסה בריכוז 4%) הוא מקבע רעיל וחומר מסרטן פוטנציאלי. יש להכין ולהשתמש בו אך ורק במכסות שאיבה כימיות מאושרות. יש ללבוש כפפות ניטריל, משקפי מגן מפני נתזים וחלוק מעבדה. יש להשליך את הפסולת בהתאם להנחיות המוסדיות.
הערה. זהות התאים מאושרת במקום זאת באמצעות מיקרוסקופיה בניגוד מופע (phase contrast) וקריטריונים מורפולוגיים לפני הדירוג האימונופלורסצנטי (ראה שלב 5.10).
- סמן אודונטוגני (DMP-1)
הערה: הערך את ביטוי החלבון DMP-1 (dentin matrix protein-1) באמצעות אימונופלורסצנציה במקביל לשלב 5.5 כדי להעריך מחויבות אודונטוגנית.- באמצעות סט נפרד של למינציות (coverslips) מאותה הכנה תאית, חזרו על כל שלבי הקיבוע, הפרמיליזציה והחסימה כפי שמתואר בשלב 5.5, כולל בקרות איסוטיפ (isotype) ובקרות למספרים משניים בלבד (secondary-only).
- מבלי לשטוף לאחר החסימה, יש להוסיף ישירות נוגדן ראשוני נגד DMP-1 (ראה טבלת חומרים) בדילול של 1:200 בבuffer חסימה (blocking buffer) והדגרה למשך לילה ב- 4 °Cשטוף שלוש פעמים ב-PBS, ולאחר מכן דגור עם הנוגדן המשני המתאים המשורר לפלואורופור (השתמש בפלואורוכרום הנבדל ספקטרלית מזה ששימש עבור RANKL; ראה טבלת חומרים) בדילול של 1:500 בבופר חסימה (blocking buffer) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך.
- יש להשיג תמונות פלואורסצנציה בהגדלה של 10x כדי להעריך את הביטוי של DMP-1 כאינדיקטור לדיפרנציאציה דמוית אודונטובלסטים10לאחר דגירה עם הנוגדן המשני, שטפו שלוש פעמים עם PBS (5 דקות בכל פעם) ועברו ישירות לשלב 5.7 לצורך קיבוע הדגימה (mounting).
- הצמידו את הזריקות באמצעות תמיסת סגירה למניעת דהייה (ראה טבלת חומרים) ולהשאיר להשקיע למשך לילה בטמפרטורת החדר. יש להכין דגמי הרכבה (Mount) בנפרד עבור השקופיות שצבעו ב-RANKL וב-DMP-1 ולסמן אותן בבירור (למשל, "קבוצת RANKL 1" ו- "קבוצה 1 של DMP-1") לפני הדימות.
- בחן את הנסכיות באופן מיידי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או שמור אותן ב- 4 °C יש להגן מאור. יש לכמת את ביטוי החלבון על ידי הערכת עוצמת הצביעה באמצעות מערכת דירוג סטנדרטית בעלת ארבע רמות: 0 (ללא צביעה), +1 (חלשה), +2 (בינונית) ו-+3 (חזקה).
- רכשו תמונות באמצעות הגדרות מיקרוסקופ זהות (זמן חשיפה, הספק לייזר והגבר) בכל הקבוצות הניסיוניות. החילו הגדרות זהות באופן עצמאי עבור כל סמן (RANKL ו-DMP-1) כדי להבטיח עקביות פנים-סמנית בין הקבוצות.
- בצעו דירוג של לפחות חמישה שדות ראייה (objective x20) שנבחרו באופן אקראי לכל באר. שני צופים בליינדים ועצמאיים יבצעו את הדירוג, וידווחו על מקדם הקאפה של כהן (Cohen's kappa coefficient) (ערך קאפה מקובל ≥ 0.7).
- חשב את ה-H-score באמצעות הנוסחה: H-score = Σ(i × Pi), כאשר i = עוצמת הצביעה (1, 2 או 3) ו-Pi = אחוז התאים (0%–100%) בכל רמת עוצמה.
הערה: מדד H-score נע בין 0 ל-30010. - יש לנרמל את נתוני ה-H-score למספר התאים הכולל לכל שדה, שנקבע על ידי ספירה ידנית של כל התאים הנראים בכל שדה תחת מיקרוסקופ בניגוד מופע (phase contrast) לפני דימוי אימונופלואורסצנטי, וזאת כדי להביא בחשבון הבדלים בצפיפות התאים בין הבארים.
- חשבו ודווחו על מדדי H-score באופן נפרד עבור RANKL (נקודת קצה אוסטאוגנית) ועבור DMP-1 (נקודת קצה אודונטוגנית), כדי לאפשר השוואה ישירה בין שני מסלולי ההבדלה.
6. הערכת ת proliferation וחיות
- בצעו ספירת תאים באמצעות המוציטומטר וצביעה ב-Trypan blue כדי להבחין בין תאים חיוניים לתאים שאינם חיוניים. חשבו את המספר הכולל של התאים החיוניים ל-mL של תרבית. ספרו לפחות 100 תאים לדגימה לצורך מהימנות סטטיסטית.
- בצעו את בדיקת ה-MTT למדידת פעילות מטבוליטית מיטוכונדריאלית8,10.
- הוסיפו תמיסת MTT בריכוז סופי של 0.5 mg/mL (טבלת החומרים) לתאים והדגירו למשך 4 h ב-37 °C. הסירו את התמיסה, הוסיפו חומר הממיס (למשל, SDS-HCl; ראו טבלת החומרים), ומדדו את הצפיפות האופטית ב-570 nm באמצעות ספקטרופוטומטר (אורך גל ייחוס: 630–650 nm).
- חשבו את חיוניות התאים באופן הבא: Viability (%) = (Absorbance of treated cells / Absorbance of untreated control cells) × 100. ערכים >100% מעידים עלהשראה פרוליפרטיבית ביחס לבקרת השלילה. כללו באר ריקה לתיקון רקע.
- נרמלו את התוצאות למספר התאים באמצעות ספירת Trypan blue מקבילה. בצעו את כל הבדיקות בשלוש חזרות (n = 3 בארות/קבוצה, ≥3 חזרות ביולוגיות).
זהירות: בופר ההמסה SDS-HCl הוא חומר מאכל. טפלו בו תוך שימוש בציוד הגנה אישי (PPE) מתאים. השליכו פסולת המכילה פורמזאן בהתאם להנחיות המוסדיות.
תוצאות
כל התוצאות המוצגות כאן מותאמות ממחקרי לוויה4,8,9,10 שנערכו על ידי אותה קבוצת מחקר תחת אישור אתי מוסדי מאוחד (FDASU-Rec IM112105).
אפיון ננו-חומרים ובידוד תאי גזע
תהליך העבודה הסטנדרטי מספק תחילה אישור כמותי של תכונות הפיגום (scaffold) והפנוטיפים של תאי הגזע. לאחר הסינתזה, הננו-חומרים שהוכנו מאושרים באמצעות TEM ו-XRD ברזולוציה גבוהה כדי לאמת את גודל החלקיקים והגבישיות (איור 1A,B). במקביל, תאי DPSCs או SCAPs שבודדו באמצעות עיכול אנזימטי מראים היצמדות ושגשוג חסונים במצע גידול מלא. ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה מאמת את האימונו-פנוטיפ של התאים שנאספו במעבר 3 (passage 3), ומראה ביטוי גבוה של סמני מזנכימליים (CD44, CD43) ומאשר את מקורם הבלתי-המטופויטי על ידי היעדר CD45 (איור 1C).
קביעת ריכוז חומר בטוח ושגשוג
באמצעות גידול של תאי גזע בדילולים סדרתיים של הננו-חומרים (50–1.56 µg/mL) למשך 72 h, רגרסיה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים של ספירת תאים חיוניים מניבה ערך EC₅₀ מהימן (מודל תגובה למינון סיגמואידי לא-ליניארי, כמתואר בשלב 4.1). ערכי חיוניות של MTT העולים על 100% מעידים על גירוי של שגשוג ביחס לבקרת הביקורת שלא טופלה, שכן הערכים מנורמלים לקבוצת הביקורת השלילית (תאים שלא טופלו נקבעו כ-100%). ערך של ~196% עבור Nano-NeoMTA2, לדוגמה, משקף גירוי ביו-אקטיבי של פעילות מיטוכונדריאלית ולא הישרדות תאים מוחלטת של >100%9.
במספר מחקרים שבהם יושם פרוטוקול סטנדרטי זה, נקבעו ערכי EC₅₀ של 7.9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 ו-9.92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10 באמצעות המודל הלוגיסטי בעל ארבעת הפרמטרים (שלב 4.1), מה שמאשר ריכוזי עבודה בטוחים לשימוש במבחני הדיפרנציאציה המתוארים בפרוטוקול זה. ערכים אלו משולבים בטבלה 1 כמדדי תיקוף מייצגים.
כימות שלהבניה ואודונטוגנזה (הערכה באמצעות סממנים כפולים)
גישת האימונופלורסצנציה הכפולה מניבה שני מדדי תוצאה נפרדים ומשלימים מאותה הכנה תאית. להערכה אוסטאוגנית, ציוני H של RANKL הבדילו בין כל ארבע הקבוצות במובהקות סטטיסטית: תאים שגודלו עם Nano-NeoMTA2 הראו ביטוי גבוה משמעותית של RANKL מאשר הביקורת השלילית, באופן העולה עם הפעלה מוגברת של תאים דמויי אוסטבלאסטים (איור 2A, טבלה 1)8,9. להערכה אודונטוגנית, ציוני H של DMP-1 חשפוהבניה חזקה של תאים דמויי אודונטובלסטים ב-DPSCs שגודלו עם Nano-NeoMTA2, עם ציוני H גבוהים משמעותית מאלו של קבוצות הננו-הידרוקסיאפטיט והביקורת השלילית, מה שמאשר התמחות מועדפת לדנטינוגנזה (איור 3A, טבלה 1)10. זהות התאים אובחנה באמצעות מיקרוסקופיית ניגוד מופע (phase contrast) וקריטריונים מורפולוגיים אופייניים (מורפולוגיה בצורת כישמים או פוליגונית) לפני מתן הציונים.
פעילות ALP הובחנה באופן ספקטרופוטומטרי בין כל הקבוצות באורך גל של 405 nm, ושימשה כסמן אנזימטי מוקדם להתחייבות אוסטאוגנית ואודונטוגנית כאחד (טבלה 1). ניתוח MTT ספקטרופוטומטרי אישר כי כל הננו-חומרים בריכוזים בטוחים שנגזרו מה-EC₅₀ שמרו על חיות תא גבוהה ביחס לבקרת השלילה, בהתאם לערכים המייצגים המוצגים (טבלה 1).
תוצאות ניסוייות תת-אופטימליות ולא מוצלחות
תוצאות תת-אופטימליות מסוכמות בטבלה 2. חיוניות תאים נמוכה במבחן MTT מעידה בדרך כלל על כך שריכוז הננו-חומר עולה על סף ה-EC₅₀ או שהסטריליזציה ב-UV הייתה בלתי מספקת. בליעה לא עקבית של ALP (CV > 20%) מעידה בדרך כלל על צפיפות זריעה לא אחידה או הומוגניזציה חלקית של בופר הליזיס. אות אימונופלואורסצנציה חלש או חסר עבור RANKL או DMP-1 נובע לרוב מאינאקטיבציה של הנוגדן, פרמיאביליזציה לא מספקת או קיבוע יתר; שימוש בפורמאלדהיד 4% טרי ובמנות (aliquots) של נוגדנים לשימוש חד-פעמי פותרים בעיה זו. יש לשלול תגובת צלב בין הערוצים של RANKL ו-DMP-1 על ידי סקירת תמונות ביקורת של נוגדן שני בלבד לפני הדירוג.
איור 1: אפיון סטנדרטי של ננו-חומרים ותיקוף של פנוטיפ תאי גזע. (A) ספקטרום XRD המאשר את הפאזה הגבישית ואת השלמות המבנית של הננו-חלקיקים. (B) תמונות TEM מייצגות המדגימות את גודל החלקיקים בננו-קנה מידה, את המורפולוגיה ואת הפיזור ההומוגני של הביו-חומרים שהסונתזו; השוואה בין NeoMTA2 לבין hydroxyapatite. תצפיות בהגדלה נמוכה מוצגות עבור (a) NeoMTA2 ו-(b) hydroxyapatite, בעוד שתצפיות בהגדלה גבוהה מפורטות ב-(c) NeoMTA2 ו-(d) hydroxyapatite. סרגלי קנה מידה מוצגים בפינה השמאלית התחתונה. (C) פרוטוקול gating של ציטומטריה זרימתית לאפיון תאי גזע. תרשימי נקודות (dot plots) רב-פרמטריים מייצגים מראים תאים שצבעו עבור CD44, CD73 (מסומן כ-CD43 PE בתרשימים המקוריים) ו-CD45. תתי-האוכלוסיות CD44+ ו-CD73+ סווגו (gated) בהתאם לביטוי CD45. פאנלים A ו-C עובדו מתוך Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA) ופאנל B עובד מתוך Habib et al.10 (CC BY-NC). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכה כמותית וחלקית-כמותית של התמיינות אוסטאוגנית באמצעות אימונופלורסצנציה של RANKL. (A) מיקרוגרפים מייצגים של אימונופלורסצנציה ברזולוציה גבוהה הלוכדים את הביטוי של סממני חלבון אוסטאוגניים קריטיים, RANKL, בתוך מיקרו-סביבת פיגום דו-ממדית (2D scaffold): (a) תאי ביקורת שלילית יוצרים מושבות קטנות עם ביטוי RANKL קלוש וממברנתי, בעוד ש-(b) תאי ביקורת חיובית מראים מספר מוגבר של מושבות דמויות-אוסטאובלסטים עם ביטוי דחוס והומוגני. תאי גזע שטופלו ב-(c) NHAP, (d) NHAP/chitosan, ו-(e) ננו-חלקיקי זכוכית ביו-אקטיבית מראים התמיינות מתקדמת, המאופיינת במושבות גדולות וממוזגות של תאים דמויי-אוסטאובלסטים עם לוקליזציה אינטנסיבית והומוגנית של RANKL הן בממברנה והן בגרעין; עובד מ: Elshahat et al.4. (B) תרשימי עמודות המייצגים כימות של H-score לביטוי RANKL לאורך המחקרים השונים. יישום של מתודולוגיית ה-H-score לנורמליזציה של נתוני אימונופלורסצנציה. באמצעות אינטגרציה מתמטית של עוצמת הצביעה החזותית (בדירוג 0–3) עם אחוז התאים שנצבעו באופן חיובי, ה-H-score מתרגם מיקרוסקופיה איכותית למדד חצי-כמותי חסון, המפחית משמעותית את הטיית הצופה הסובייקטיבית. (a) השוואה בין Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) וננו-חלקיקי זכוכית ביו-אקטיבית (NBG; 500 µg/mL) אל מול ביקורת חיובית של מצע אוסטאוגני (OM-PC) וביקורת שלילית של DMEM (DMEM-NC). NBG עורר את פרופיל הביטוי הגבוה ביותר (p < 0.001). עובד מ-Abdelaziz et al. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) הערכה של ננו-הידרוקסיאפטיט (NHAP; 10µg/mL), קומפוזיט NHAP/Chitosan (10 µg/mL), ו-NBG (500 µg/mL) ביחס לביקורות, כאשר NHAP/Chitosan מראה את ערכי ה-H-scores הגבוהים ביותר. עובד מ-Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (c) הערכה של Nano- NeoMTA2 (7.9 µg/mL) לעומת NHAP (10 µg/mL) וביקורות, המדגימה ביטוי RANKL מוגבר משמעותית ב-Nano-NeoMT, עובד מ-Zaki et al.8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות אימונופלורסצנציה מייצגות וניתוח H-Score. (A) הערכת ביטוי של Dentin Matrix Protein (DMP-1) באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה בקרב קבוצות הניסוי; פלואורסצנציה ירוקה מעידה על צביעה חיובית לנוגדנים פוליקלונליים נגד DMP-1. (a) ביקורת שלילית: תאי גזע מפולפה של שן אנושית (hDPSCs) במצע לא מבדל (UM) מראים אגרגטים תאיים קטנים עם ביטוי DMP-1 חלש ואחיד (+). (b) ביקורת חיובית: hDPSCs במצע אודונטוגני (OM) מראים התרחבות של מושבות המתאפיינות באותות DMP-1 דחוסים והומוגניים (++). (c) Nanohydroxyapatite (10 μg/mL) ו-(d) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL): hDPSCs מובדלים יוצרים מושבות גדולות וממוזגות של תאים דמויי אודונטובלסטים המראים ביטוי DMP-1 חזק והומוגני הממוקם בממברנות ובגרעינים. הגדלה: ×10. עיגולים צהובים מציינים מושבות דמויות אודונטובלסטים; חצים צהובים מציינים ביטוי DMP-1 אינטנסיבי. (B) תרשים עמודות המייצג כימות H-score של ביטוי Dentin Matrix Protein בין קבוצות המחקר. נצפתה הבדל משמעותי מאוד בין קבוצות ההערכה, כאשר ה-H-score הגבוה ביותר נצפה בקבוצת ה-Nano-NeoMTA2 (169.33 ± 4.04), ואחריה nanohydroxyapatite (140.33 ± 2.52) והביקורת השלילית (15.33 ± 1.53). פאנלים A ו-B עובדו מתוך Habib et al.10 (CC BY-NC). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| בדיקה / פרמטר | ננו-חומר / סוג תא | ערך מייצג (ממוצע ± סטיות תקן (SD) | נרמול | נא לספק את טקסט המקור באנגלית כדי שאוכל לתרגם אותו לעברית בהתאם להנחיות המקצועיות שלך. |
| חיוניות תאים (בדיקת MTT) | ||||
| בדיקת חיוניות MTT | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1.56 ± 0.24) | נורמל לביקורת שלא טופלה (DMEM-NC = 100%) | עבד אל-עזיז ואח'.⁹ |
| חיוניות MTT | קיטוזן-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99.97% | נורמל לסקרת ביקורת שלא טופלה (DMEM-NC = 100%) | אלשהאת ואח'.⁴ |
| בדיקת חיות MTT — ביקורת חיובית | OM-PC / SCAPs | 113.46% (OD = 0.93) ± 0.03) | נורמל לבקרת ביקורת לא מטופלת (DMEM-NC = 100%) | עבדאלעזיז ואח'.⁹ |
| בדיקת חיות בתנאי MTT — בקרת שלילה | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0.82 ± 0.02) — קו בסיס לייחוס | DMEM-NC המוגדר כ-100% ביקורת עבור כל הקבוצות | עבד אל-עזיז ושות'⁹ |
| פעילות אלקלין פוספטאז (ALP) | ||||
| פעילות ALP | ננו-חלקיקי זכוכית ביו-אקטיבית (500 µg/mL) / SCAPs | 69.86 ± 0.98 U/L | נורמל לתכולת החלבון הכוללת (U/מ"ג חלבון, בדיקת Bradford/BCA) | עבד אל-עזיז ושות'.⁹ |
| פעילות ALP — בקרת חיובית | OM-PC / SCAPs | 77.68 ± 1.28 U/L | נורמל לסך תכולת החלבון (U/מ"ג חלבון, בדיקת Bradford/BCA) | עבדאלעזיז ועמיתיו⁹ |
| פעילות ALP — ביקורת שלילית | DMEM-NC / SCAPs | 55.81 ± 1.6 U/L | נורמליזציה לתכולת החלבון הכוללת (U/מ"ג חלבון, בדיקת Bradford/BCA) | עבדאלעזיז ושות'⁹ |
| ריכוז חומר בטוח (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7.9 µg/mL | מודל לוגיסטי בעל ארבעה פרמטרים (תגובה לדוזה סיגמואידית לא-ליניארית, GraphPad Prism 9) | זאקי וחב'⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9.92 µg/mL | מודל לוגיסטי בעל ארבעה פרמטרים (תגובה למינון סיגמואידית לא-ליניארית, (GraphPad Prism 9) | חביב ואח'.10 |
| H-Score — ביטוי חלבון RANKL (סמן אוסטאוגני) | ||||
| מדד H-Score (RANKL) סמן אוסטאוגני | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (סולם 0–300) | סך מספר התאים הנראים לשדה (מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה) | זאקי ואח׳⁸ |
| מדד H-Score (RANKL) סמן אוסטאוגני | nHA (הידרוקסיאפטיט ננו-גבישי)10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (סולם 0–300) | סך מספר התאים הנראים לשדה (מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה) | זאקי ושותפיו⁸ |
| מדד H-Score (RANKL) ביקורת חיובית | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (סולם 0–300) | סך מספר התאים הנראים לשדה (מיקרוסקופיה בניגודיות פאזה) | זקי ועמיתיו⁸ |
| ציון H (RANKL) ביקורת שלילית | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (סולם 0–300) | סך מספר התאים הנראים לשדה (מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה) | זקי וחב'.⁸ |
| מדד H-Score — ביטוי חלבון DMP-1 (סמן אודונטוגני) | ||||
| H-Score (DMP-1) סמן אודונטוגני | Nano-NeoMTA2 (9.92 µg/mL) / תאי גזע מפולקול השערה (DPSCs) | 169.33 ± 4.04 (סולם 0–300) | סך מספר התאים הגלויים לכל שדה ראייה (מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה) | חביב ואח'.10 |
| מדד H-Score (DMP-1) סמן אודונטוגני | nHA (הידרוקסיאפטיט ננו-מבני)10 µg/mL) / תאי גזע מהשן (DPSCs) | 140.33 ± 2.52 (סולם 0–300) | סך מספר התאים הנראים לשדה (מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה) | .Habib et al10 |
| מדד H-Score (DMP-1) ביקורת שלילית | DMEM-NC / DPSCs | 15.33 ± 1.53 (סולם 0–300) | סך מספר התאים הנראים לשדה (מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה) | Habib וחב'.10 |
| מדד H-score (DMP-1) סמן אודונטוגני [ביקורת חיובית -OM-PC] | תאי גזע פולפתיים / תאי גזע פולפתיים מהחלטורה | ~103 H-score (סקאלה 0–300) | ספירת תאים כוללת לשדה (מיקרוסקופיה בניגודיות פאזה) | חביב ואחרים. Eur Endod J, 202610 |
| ציון H = Σ(i × Pi): i = עוצמת צביעה (1, 2, או 3); Pi = אחוז התאים בכל רמת עוצמה (0–100%); טווח 0–300. חיוניות MTT מבוטאת ביחס לקבוצת ה-DMEM-NC שהוגדרה כנקודת ייחוס של 100%. פעילות ALP המבוטאת ביחידות U/L מהדה-פוספורילציה אנזימטית של p-nitrophenyl phosphate; לאחר מכן נורמלה לתוכן החלבון הכולל (U/mg חלבון). OM-PC = מצע השראה אוסטאוגני/אודונטוגני (ביקורת חיובית). DMEM-NC = מצע איגל המשופר של דולבקו (ביקורת שלילית). | ||||
טבלה 1: תוצאות מייצגות מזרימת העבודה הסטנדרטית להערכה in vitro.תוצאות כמותיות מייצגות ממחקרים שפורסמו בעבר המדגימות proliferace של תאים, פעילות של alkaline phosphatase ואנליזות immunofluorescence שבוצעו באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי.
| הבעיה שנצפתה | סיבה פוטנציאלית | הפתרון המומלץ |
| חיוניות תאים נמוכה במבחן MTT (OD < ביקורת לא מטופלת) | ריכוז הננו-חומר עולה על ה-EC₅₀, או סטריליזציה לא מספקת ב-UV, או פיזור לא מספק של ננו-חלקיקים. | הרצה חוזרת של EC₅₀ קביעה (סעיף 4). האריכו את סטריליזציית ה-UV ל-30 דקות. ודאו את הומוגניות השסעון של הננו-חלקיקים באמצעות סוניקציה עם פרוב (40 W, 30 שניות פעיל/כבוי, 3 מחזורים ב- 4 °C) מיד לפני השימוש. |
| מקדם וריאציה (CV) של חיות תאים במבחן MTT >15% בין חזרות | שגיאת פיפטינג, זריעה לא אחידה של תאים, או זמן/טמפרטורת אינקובציה משתנים של MTT. | השתמשו בפיפט רב-ערוצי מכויל עבור כל ההוספות. ראשו את צפיפות הזריעה באמצעות המוציטומטר לפני הפריסה. שמרו על דגירה קפדנית למשך 4 שעות ב- 37 °C ב-CO2 מוצמד בלחות₂ אינקובטור. כלול באר ריקה לתיקון רקע. |
| קריאות בליעה לא עקביות של ALP (מקדם השונות (CV >(20% בין הבארות) | צפיפות זריעה לא אחידה של תאים, ליזיס תאי חלקי, או חוסר עקביות בפיפטור במהלך הוספת התשתית. | היצמד בקפידה ל-1 × 10⁴ תאים לבאר בלוחיות בעלות 24 בארות. יש לערבל את תמיסת הליסיס ב-Vortex ביסודיות לפני השימוש. שמרו על זמן דגירה עקבי לליסיס (10 דקות, 4 °C, ניעור עדין). בדוק את בליעת הרקע באמצעות באר ביקורת (blank) ללא תאים. |
| אימונופלורסצנציה חלשה או חסרה של RANKL אות (שלב 5.4a) | נטרול נוגדנים עקב אחסון שגוי, קיבוע יתר המפחית את נגישות האפיטופ, או חדירות (permeabilization) לא מספקת. | הכינו פורמלהיד 4% טרי רגע לפני השימוש. הוסיפו 0.1% Triton X-100 לחדירה (10 דקות, בטמפרטורת החדר) לפני החסימה. בצעו תיחור של דילול הנוגדן הראשוני (התחילו ביחס של 1:200). כללו סגמנט רקמה כביקורת חיובית. חלקו את מלאי הנוגדנים לאליקוטים כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים. |
| פלוורסצנציית אימונו-DMP-1 חלשה או חסרה אות (שלב 5.4ב) | נטרול נוגדנים עקב מחזורי הקפאה והפשרה, דילול לא אופטימלי של הנוגדן הראשוני, או מין מאכסן לא תואם של הנוגדן המשני. | חלק את הנוגדן anti-DMP-1 לאליקוטים כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה. בצע טיטרציה של הדילול החל מ-1:200. ודא תאימות של מין המארח בין הנוגדן הראשוני (DMP-1) לנוגדן המשני. הוסף נתח רקמת דנטין כביקורת חיובית עבור DMP-1. |
| תגובה צולבת בין RANKL ל-DMP-1 ערוצי פלואורסצנציה | חפיפה ספקטרלית בספקטרומי פליטה במקרה שבו נעשה שימוש באותו פלואורוכרום עבור שני הנוגדנים המשניים, או הפרדה לא מספקת בין הערוצים במיקרוסקופ הפלואורסצנציה. | השתמשו פלואורו chromospheric של נוגדנים שניים המובחנים ספקטרלית עבור RANKL ו-DMP-1 (למשל, Alexa Fluor 488 עבור סמן אחד ו-Alexa Fluor 594 עבור השני). סקרו את תמונות הביקורת של נוגדנים שניים בלבד עבור כל ערוץ באופן נפרד לפני הדירוג. רכשו תמונות של RANKL ו-DMP-1 בנפרד באמצעות מצב רכישה סדרתי (sequential acquisition mode). |
| רקע לא ספציפי גבוה ב- צביעה אימונופלואורסצנטית | חסימת חלבון לא מספקת, ריכוז גבוה מדי של נוגדן שני, או שלבי שטיפה לא מספיקים בין דגירות. | הארך את דגירת החסימה ל-2 שעות בטמפרטורת החדר. הגדל את הדילול של הנוגדן המשני ל-1:1000. אשר את הסגוליות באמצעות בקרת נוגדן משני בלבד (ללא נוגדן ראשוני). ודא שכל שטיפות ה-PBS הושלמו (3 × 5 דקות כל אחת). |
| שונות בין-צופים ב-H-score (מדד הקאפה של כוהן <0.7, שלב 5.6) | יישום לא עקבי של סולם עוצמת הצביעה בעל ארבעה דרגות (0, +1, +2, +3+) בין צופים, או כיול לא מספיק לפני מפגשי הדירוג. | בצעו סשן כיול משותף באמצעות תמונות אימון מייצגות לפני הניקוד הרשמי. השתמשו בהגדרות תצוגת תמונה זהות (בהירות, ניגודיות) עבור כל הצופים. נקדו לפחות חמישה שדות במיגדילה גבוהה (high-power fields) לכל באר, וחשבו את מדד הקאפה (kappa) לאחר כל 10 שדות כדי לנטר סטיות (drift). |
| EC₅₀ העקומה אינה מתכנסת או שההתאמה אינה טובה (שלב 4.1) | מספר נקודות נתונים לא מספיק, טווח ריכוזים צר, או תליה הומוגנית שלא הושגה לפני הזריעה. | הרחב את טווח הדילול הסדרתי כך שיכלול לפחות 6 ריכוזים המקיפים את הטווח 50–1.56 µg/mLיש לוודא כי הסוניקציה באמצעות מתמר (probe sonication) תבוצע מיד לפני כל שלב של דילול. חזור על הפעולה עם לפחות 3 חזרות ביולוגיות בלתי תלויות. אשר את מקדם השונות (CV). <15% בין חזרות. |
טבלה 2: פרמטרים קריטיים ומדריך לפתרון בעיות. בעיות טכניות נפוצות שנתקלנו בהן במהלך הפרוטוקול, הגורמים הפוטנציאליים להן, ופתרונות מומלצים לשיפור השחזוריות הניסויית ואיכות הנתונים. קיצורים: CV = coefficient of variation; RT = room temperature.
דיון
השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה כוללים קביעה מדויקת של EC₅₀, השגה של סספנסיית ננו-חומרים הומוגנית ונורמליזציה של תוצרי הבדיקה הביולוגית. חישוב EC₅₀ באמצעות רגרסיה לא-ליניארית (מודל לוגיסטי בעל ארבעה פרמטרים) מספק אומדן תגובה-מנה מדויק יותר מאשר אינטרפולציה ליניארית, ויש להעדיפו כאשר זמינים מספיק נקודות נתונים13,14. הבטחת סספנסיית ננו-חלקיקים הומוגנית באמצעות סוניקציה עם פרוב (probe sonication) מיד לפני החשיפה לתאים היא קריטית; סספנסיות שאינן מפוזרות כראוי מניבות עקומות תגובה-מנה לא אמינות ומטעות את אומדני ה-EC₅₀. עבור חומרים חדשניים כגון NeoMTA2, טחינה לננו-קנה מידה היא שלב ראשוני חיוני, מכיוון שגודל החלקיקים במצבם הגולמי משנה באופן משמעותי את התגובתיות של הפני השטח ואת הביו-אקטיביות העוקבת13,14. אם נצפתה חיוניות תאים נמוכה בריכוזים שצפויים להיות בטוחים, על החוקרים לאמת את פרוטוקול הסטריליזציה ב-UV ולבחון מחדש את נהלי הטחינה והפיזור לפני חזרתו על בדיקת ה-EC₅₀10.
אבן יסוד של פרוטוקול זה היא השימוש בשני סממנים משלימים של אימונופלואורסצנציה המשקפים מסלולי התמיינות נפרדים אך חופפים. עלייה בביטוי RANKL בתאים דמויי-אוסטאובלסטים משקפת איתות אוסטאוגני המונע על ידי יוני סידן והיא פרופורציונלית למספר התאים האוסטאוגניים8,9, בעוד שביטוי DMP-1 משמש כאינדיקטור ספציפי להתמיינות דמוית-אודונטובלסטים ופעילות דנטינוגנית, מה שהופך אותו לרלוונטי במיוחד כאשר אוכלוסיית התאים המטרה היא DPSCs10. באמצעות כימות של שני הסממנים באמצעות מתודולוגיית H-score, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להבחין בין מחויבות לשושלת אוסטאוגנית לשושלת אודונטוגנית בתוך מערכת בדיקה סטנדרטית אחת, התקדמות לעומת גישות של סממן בודד שאינן יכולות להבחין בין מחויבות ליצירת עצם למחויבות ליצירת דנטין. יש לדווח על ערכי ה-H-scores של RANKL ו-DMP-1 בכל הפרסומים המשתמשים בפרוטוקול זה כדי לשמור על יכולת השוואה בין מחקרים. על החוקרים להשתמש בצבעים פלואורוצרומיים נפרדים ספקטרלית עבור שני הנוגדנים המשניים כדי למנוע חפיפה בין הערוצים, ויש לבחון את תמונות הביקורת של נוגדן משני בלבד לפני הדירוג.
ייתכן שיהיה צורך במספר התאמות מתודולוגיות בעת התאמת פרוטוקול זה לביומטריאלים או למודלים תאיים חלופיים. עבור פיגומים (scaffolds) בעלי עכירות גבוהה או צבע, הפרעה לבליעת ה-MTT ב-570 nm עשויה להצריך שימוש במבחן חיוניות חלופי, כגון CellTiter-Glo (לומינסנציה) או PrestoBlue (רדוקציה של רזאזורין), אשר פחות רגישים להפרעות אופטיות מחומרי הפיגום. חוקרים המשתמשים ב-SCAPs במקום ב-DPSCs צריכים לשים לב כי SCAPs נוטים להראות ביטוי חזק יותר של RANKL, מה שמשקף את נטייתם הגבוהה יותר להבדלה אוסטאוגנית, בעוד ש-DPSCs מראים ביטוי בולט יותר של DMP-1, המשקף את נטייתם החזקה יותר לשושלת אודונטוגנית/דנטינוגנית. מספר המעברים (passage number) הוא משתנה קריטי: יש להימנע מתאים שחרגו ממעבר 6, שכן הם עלולים להפגין יכולת הבדלה מופחתת וביטוי שונה של סממני שטח.
מגבלות מסגרת מתודולוגית זו כוללות חלון הערכה קצר טווח (72 h), אשר עשוי שלא ללכוד אירועי מינרליזציה בשלב מאוחר הדורשים בדרך כלל 14–21 ימים. היעדר תיקוף in vivo מהווה פער תרגומי משמעותי. השימוש ב-H-score מציג שונות פוטנציאלית בין צופים; יש לכלול בכל התוצאות המפורסמות את מהימנות בין-צופים (Cohen's kappa) שדווחה בסעיף 5.10.
מסגרת עבודה זו מציעה מספר יתרונות לעומת גישות קיימות המתבססות על נקודת קצה בודדת. בדיקות אוסטאוגניות קונבנציונליות מסתמכות לעיתים קרובות אך ורק על צביעת alizarin red או על פעילות ALP בנקודת זמן אחת. השילוב של סריקת חיוניות MTT, כימות פעילות ALP, ודירוג H-scoring של אימונופלואורסצנציה כפולה ל-RANKL + DMP-1 בתוך זרימת עבודה אחת, מספק פלט רב-פרמטרי המאפשר השוואה סטטיסטית ישירה בין סוגי פיגומים שונים תחת תנאים ניסיוניים זהים. אסטרטגיות הנורמליזציה המתוארות – ביטוי פעילות ALP לכל mg חלבון, תוצאות MTT כאחוז מהביקורת ללא טיפול, ו-H-score מנורמל למספר התאים הכולל בשדה – מבטלות השפעות של משתנים מתערבים הנובעים משונות בין בארות4,8.
מחקרים עתידיים עשויים להחיל מתודולוגיה זו להערכת ההשפעות של ביו-חומרים על סמנים דלקתיים, תגובות אנגיוגניות או מודלים חלופיים של תאי גזע. סדר הבדיקות ניתן להתאמה גם לפורמטים של פיגומים תלת-ממדיים (3D scaffolds). בסופו של דבר, אימוץ המסגרת הסטנדרטית הזו במעבדות בלתי תלויות יקל על השוואות מטא-אנליטיות משמעותיות של ביצועי הפיגומים במחקרי רפואת שיניים רגנרטיבית פרה-קלינית15.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגש interests.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פלטות תרבית בעלות 24 בארות | Corning | 3527 | משמש לבדיקות ALP |
| פלטות 96 בארות | Corning | 3596 | משמש לקריאות ספיגה של ALP ולבדיקות MTT |
| ערכה לבדיקת ALP | Abcam | ab83369 (או מקבילו) | משמש למדידת פעילות עיקר פוספטאזה בסיסית |
| בופר סובסטרט ל-ALP (2-אמינו-2-מתיל-1-פרופנול) | Sigma-Aldrich | מכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, נא לספק את התוכן באנגלית שברצונך לתרגם לעברית. | משמש להפעלת התגובה הקטליטית של ALP |
| אמוניום הידרוקסיד (NH4OH) | לא רלוונטי | לא רלוונטי | משמש לוויסות ה-pH במהלך סינתזה של ננו-הידרוקסאפטיט. חומר מאכל |
| נוגדן ראשוני Anti-DMP-1 | לא רלוונטי | לא רלוונטי | סמן אודונטוגני; דילול של 1:200 בתמיסת חסימה; למשך לילה ב- 4 °C |
| נוגדן אנטי-CD44 אנושי (CD44-FITC) | Beckman Coulter | לא רלוונטי | משמש לזרימה ציטומטרית; סמן חיובי לתאי גזע מזנכיים |
| נוגדן אנטי-CD45 אנושי (CD45-PC5) | Beckman Coulter | לא רלוונטי | משמש לציטומטריה של זרימה; סמן שלילי לשושלת המטופואטית |
| נוגדן אנטי-CD73 אנושי (CD73-PE) | Beckman Coulter | לא רלוונטי | משמש לציטומטריה של זרימה; סמן חיובי לתאי גזע מזנכימליים |
| אוטוקלייב (כור הידרותרמי) | Tuttnauer | לא רלוונטי | משמש לטיפול הידרותרמי של ננו-הידרוקסיאפטיט ב- 140 °C, 0.3 MPa |
| ערכה לבדיקת חלבון BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 (או מקבילו) | משמש לקביעת ריכוז חלבון כולל לצורך נורמליזציה של פעילות ALP |
| CO2 אינקובטור | Thermo Fisher Scientific | לא רלוונטי | הגדר ל- 37 °C ו-5% CO22 עבור כל שלבי תרבית התאים |
| קולגנאז מסוג I | Sigma-Aldrich | C0130 | משמש לעיכול אנזימטי של רקמות שיניים במהלך בידוד תאי גזע |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | תווך תרבית בסיסי; משמש גם כקבוצת ביקורת שלילית |
| סרום עוברי בקר (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | תוסף למצע גידול מלא; FBS מאושר ל-MSC המשמש למצע דיפרנציאציה |
| ציטומטר זרימה (Navios) | Beckman Coulter | Navios | משמש לאימונופנוטיפיקציה של תאי גזע |
| תוכנה לניתוח ציטומטריה זרימה (Navios) | Beckman Coulter | לא רלוונטי | משמש עבור בחירת אוכלוסיות (gating) וניתוח נתונים של פאנלים של ציטומטריה זרימה |
| מיקרוסקופ פלואורסצנציה | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | משמש לדימוי אימונופלואורסצנציה ולדירוג H-score |
| מייבש בהקפאה (ליופיליזטור) | Labconco | לא רלוונטי | משמש לייבוש משקעי ננו-חומרים ב- −50 °C |
| נוגדן משני עיזים נגד IgG של ארנב (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | נוגדן שני פלואורסצנטי; דילול 1:500; שעה אחת בטמפרטורת החדר |
| נוגדן משני Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (או מקביל לו) | A-11012 (או מקבילו) | נוגדן שני בעל ספקטרום נפרד המשמש לאימונופלואורסצנציה של DMP-1 כאשר מבוצע צביעה מרובת רכיבים (multiplex staining) |
| תוכנת GraphPad Prism | תוכנת GraphPad | גרסה 9 | בשימוש עבור EC50 חישוב וניתוח סטטיסטי |
| המוציטומטר | נויבאוור | לא רלוונטי | משמש לספירת תאים ידנית ולספירת תאים כוללת לצורך נורמליזציה של H-score |
| מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך | Olympus | לא רלוונטי | משמש לניטור יומי של צמיחת תאים ומורפולוגיה |
| תוסף קיבוע, למניעת דהייה (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | משמש להרכבת זקוכית כיסוי לאחר צביעה אימונופלואורסצנטית |
| ריאגנט MTT | Invitrogen | M6494 | משמש להערכת הפעילות המטבולית של תאים; 0.5 mg/mL, למשך 4 שעות ב- 37 °C |
| ננו-הידרוקסיאפטיט (NHAP) | Nanogate, קהיר, מצרים | לא רלוונטי | סונתז על ידי שיקוע רטוב או נרכש מסחרית; נעשה בו שימוש ב- 10 µg/mL |
| אבקת NeoMTA2 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | נא לספק את טקסט המקור באנגלית לתרגום. | חומר התחלתי להכנת Nano-NeoMTA2 באמצעות טחינת כדורים פלנטרית |
| סרום עיזים נורמלי | לא רלוונטי | לא רלוונטי | משמש לחסימה (5% ב-PBS) לפני יישום הנוגדן הראשוני |
| מדיום בידול אוסטאוגני/אודונטוגני | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | לא רלוונטי | מצע ביקורת חיובית; מכיל DMEM, FBS, אסקורבט, בטא-גליצרופוספט ודקסמתזון |
| פאראפורמלדהיד (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | משמש לקיבוע תאים לפני אימונופלואורסצנציה. רעיל — יש להשתמש במנדף כימיים |
| PBS (סליין במאזן פוספטים, pH 7.4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | משמש לשטיפת תאים, לדילול נוגדנים ולהשעיה של ננו-חומרים |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | תוסף אנטיביוטי; בשימוש בריכוז של 1% בתווך גידול מלא |
| טחנת כדורים פלנטרית | Retsch (או מקבילו) | PM 400 | משמש לננו-מימד של אבקת NeoMTA2; 350 סל"ד, 10 שעות |
| תמיססות סטנדרט של p-ניטרופנול | Sigma-Aldrich | כיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, נא לספק את התוכן באנגלית כדי שאוכל להמיר אותו לעברית בהתאם להנחיות המקצועיות שסופקו. | משמש להפקת עקומת כיול לפעילות ALP |
| נוגדן ראשוני ארנב נגד RANKL | Abcam | ab9957 | סמן אוסטאוגני; דילול 1:200; לילה שלם ב- 4 °C |
| נוגדן בקרה איזוטייפ Rabbit IgG | לא רלוונטי | ביקורת שלילית לאימונופלורסצנציה; ריכוז תואם של נוגדן ראשוני | |
| תמיסת המסה SDS-HCl | Sigma-Aldrich | לא רלוונטי | משמש להמסה של גבישי MTT formazan. חומר מאכל (CORROSIVE) |
| פלטות תרבית רקמה בעלות שש בארות | Corning | 3516 | משמש לבדיקות דיפרנציאציה |
| נתרן הידרוקסיד (NaOH), בריכוז 0.5 M | Sigma-Aldrich (או מקבילו) | לא רלוונטי | משמש לסיום תגובת ה-ALP לפני מדידת הבליעה; חומר מאכל |
| סוניקטור (פרוב / אמבט אולטרסוני) | Branson Ultrasonics | לא רלוונטי | משמש לפיזור ננו-חלקיקים לפני בדיקות ביולוגיות |
| בקבוקי תרבית T-75 | Corning | 430641 | משמש להרחבת תאי גזע |
| TEOS (טטרהאתיל אורתוסיליקט) | לא רלוונטי | לא רלוונטי | חומר מוצא סיליקה עבור סינתזת סול-ג'ל של זכוכית ביו-אקטיבית 45S5. דליק |
| מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) | JEOL Ltd. | JEM-2100 | משמש לאפיון גודל ומורפולוגיה של ננו-חומרים |
| Triton X-100 (0.1% ב-PBS) | לא רלוונטי | לא רלוונטי | משמש לחדירות תאים (cell permeabilization) לפני אימונופלורסצנציה |
| תמיסת Trypan blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | משמש להערכת חיוניות תאים |
| דיפראקטומטר של קרני רנטגן (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | משמש לניתוח קריסטלוגרפי של ננוחלקיקים |
מקורות
- Sui B et al. Dental pulp stem cells: from discovery to clinical application. J Endod. 2020;46(9 Suppl):S46-S55. doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.
- Zhang W, Yelick PC. Vital pulp therapy: current progress of dental pulp regeneration and revascularization. Int J Dent. 2010;2010:856087. doi:10.1155/2010/856087.
- Zhang W et al. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials. 2006;27(33):5658-68. doi:10.1016/j.biomaterials.2006.07.013.
- Elshahat S, Elgendy AA, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using chitosan-coated nanohydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. Eur J Dent. 2024;18(2):665-71. doi:10.1055/s-0043-1777044.
- Huang M, Dissanayaka WL, Yiu CKY. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):626. doi:10.1186/S13287-025-04705-8.
- Tran N, Webster TJ. Nanotechnology for bone materials. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009;1(3):336-51. doi:10.1002/wnan.23.
- Ding F, Guo S, Pan G. Emerging biomimetic materials with micro/nanostructure-dependent biological effects. Rev Mater Res. 2025;1(2):100040. doi:10.1016/j.revmat.2025.100040.
- Zaki NT, El-Helbawy M, Mahran AH, Elsewefy T. Effect of Neo-MTA and hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and osteogenic differentiation of apical papilla stem cells (SCAPs) (in vitro study). J Pharm Negat Results. 2023;14. doi:10.47750/pnr.2023.14.02.344.
- Abdelaziz H, Mahran AH, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using nanoparticles of Neo MTA and bioactive glass. Saudi Dent J. 2024;36(1):134-39. doi:10.1016/j.sdentj.2023.10.018.
- Habib N, Elgendy A, Elsewify T, Yehia T. The effect of Nano-NeoMTA2 and nanohydroxyapatite on the human dental pulp stem cells odontogenic differentiation and proliferation. Eur Endod J. 2026;11(4):158-65. doi:10.65717/eej.2026.25165.
- Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: a review of preparation methodologies. J Appl Biomater Biomech. 2004;2(2):74-80.
- Xu F, Li Y, Wang X, Wang J, Yang A. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/poly(vinyl alcohol) hydrogel biocomposite. J Mater Sci. 2004;39:5669-72. doi:10.1023/B:JMSC.0000040074.64787.b3.
- Tanomaru-Filho M et al. Biocompatibility and mineralized nodule formation of Neo MTA Plus and an experimental tricalcium silicate cement containing tantalum oxide. Int Endod J. 2017;50(Suppl 2):e31-e39. doi:10.1111/iej.12780.
- Rodríguez-Lozano FJ et al. Biomineralization potential and biological properties of a new tantalum oxide (Ta2O5)-containing calcium silicate cement. Clin Oral Investig. 2022;26(2):1427-41. doi:10.1007/s00784-021-04117-x.
- Okajcekova T et al. A comparative in vitro analysis of the osteogenic potential of human dental pulp stem cells using various differentiation conditions. Int J Mol Sci. 2020;21(7). doi:10.3390/ijms21072280.