בדיקות בקיעת ביצים פשוטות ונגישות ב-Caenorhabditis elegans: פורמטים מותאמים לסקר סמים

סיכום

מחקר זה מציג פלטפורמת בדיקה גמישה וסטנדרטית לבקיעת ביצים ב-Caenorhabditis elegans המשלבת מספר פורמטים ניסיוניים. הגישה משפרת את השחזוריות, ההרחבה והנגישות, ומאפשרת הערכה מעמיקה של השפעות התרופות ותהליכי ההתפתחות, תוך שמירה על חסכונית וגמישה הן ליישומי מחקר והן לסביבות חינוכיות.

תקציר

בדיקות בקיעת ביצים (EHA) משמשות באופן נרחב להערכת השפעות התרכובות הכימיות על שלבי ההתפתחות המוקדמים של נמטודות, במיוחד במחקר אנטילמינטי. עם זאת, המתודולוגיות הקיימות משתנות במידה ניכרת בפורמט, במורכבות ובשחזוריות, ולעיתים מוצגות כפרוטוקולים קבועים ולא כמסגרות ניסוי גמישות. במחקר זה, אנו מקימים פלטפורמה פשוטה, נגישה וגמישה לבדיקות בקיעת ביצים ב-Caenorhabditis elegans על ידי שילוב והשוואה ישירה של שלוש תצורות ניסויות: (i) דגירה מבוקרת בצינורות מיקרוצנטריפוגות ואחריה זריעה על לוחות אגר, (ii) חשיפה ישירה על לוחות אגר המכילות תרופות, ו-(iii) בדיקות נוזליות מבוססות בארות מרובות. שתי תרכובות מייצגות שימשו להמחשת הבדיקה: אחת שמעכבת בקיעת ביצים ואחת שאין לה השפעה ניתנת לזיהוי. כל תצורה מספקת יתרונות ייחודיים מבחינת שליטה ניסיונית, קצב העברה ונגישות. הגישה המבוססת על צינורות מיקרוצנטריפוגה מאפשרת שליטה מדויקת בחשיפה לתרופות ותומכת בניתוחים פרמקולוגיים כמותיים. בדיקות מבוססות אגר מציעות אלטרנטיבה פשוטה וזולה, המתאימה לחשיפה מתמשכת ולסביבות חינוכיות. פורמטים של Multiwell מאפשרים סינון סטנדרטי וניתן להרחבה, בהתאם לצינורות גילוי תרופות מודרניים. על ידי השוואה ישירה בין פורמטים אלו, אנו מראים כיצד בחירות מתודולוגיות משפיעות על שחזור הבדיקות, דינמיקת חשיפה לתרופות ופרשנות ביולוגית, במיוחד ביחס לגורמים ספציפיים לשלב כמו תפקיד ההגנה של קליפת הביצה והשונות ההתפתחותית בביטוי המולקולרי של מטרות. בסך הכול, עבודה זו מבססת מבחני בקיעת ביצים ב-C. elegans כפלטפורמה גמישה וניתנת להרחבה, המותאמת ליישומים מגוונים, כולל סקר אנטילמינטי, הערכה טוקסיקולוגית, מחקרים התפתחותיים ומעבדות הוראה, ובכך מאפשרת שימוש רחב ורציונלי יותר בשיטה זו.

מבוא

בדיקות בקיעת ביצים (EHA) הוכחו מזה זמן רב כמתודולוגיית יסוד בנמטולוגיה להערכת פעילות הרג ביבית והשפעות התפתחותיות מוקדמות של תרכובות כימיות. במקור פותחו עבור נמטודות טפיליות, בדיקות אלו מכימות את עיכוב העובר או הופעת הזחלים בתנאי מבחנה מבוקרים, ומספקות נקודות סיום עמידות ורלוונטיות ביולוגית כגון אחוז ביעה או ניתוח ריכוז-תגובה (למשל, EC₅₀ או IC₅₀)1,2,3,4,5,6,7.

גישות קלאסיות מבוססות ביצים בנמטודות טפיליות כמו Haemonchus contortus ו-Trichostrongylus colubriformis שימשו רבות להערכת יעילות התרופות הסינתטיות ומוצרים טבעיים, וכן למעקב אחר עמידות לאנטילמנטים 1,2,6,8,9,10 . מתודולוגיות אלו כוללות מגוון קריאות, החל מהערכה ישירה של כשירות הביצים והבקיעה ועד להערכת התפתחות הזחלים לאחר תרבית צואה. ביחד, הם מילאו תפקיד מרכזי בקישור חשיפה לסמים לתפוקת הרבייה של הטפילים ולפוטנציאל ההעברה. עם זאת, גישות אלו דורשות לעיתים קרובות הכנת דגימות מורכבות ממארחים נגועים, תקופות דגירה ממושכות ותשתיות מיוחדות, מה שעלול להגביל את הנגישות, היכולת להרחבה ולשחזור בין מעבדות.

השימוש ב-Caenorhabditis elegans כאורגניזם מודל הפך לאסטרטגיה עוצמתית להתגבר על מספר מגבלות הקשורות לנמטודות טפיליות. מחזור החיים הקצר שלה, היכולת הגנטית שלה, קלות הגידול ושימור מטרות מולקולריות מרכזיות המשותפות למינים טפיליים הופכים אותה למתאימה במיוחד למחקרים פרמקולוגיים, טוקסיקולוגיים והתפתחותיים. חשוב לציין שהתפתחות עוברית ב-C. elegans היא מהירה וניתנת לשחזור גבוה, ומאפשרת להשתמש בבדיקות של חיוניות ביציות ובקיעה כקריאות כמותיות ואמינות של תהליכי התפתחות מוקדמים וההפרעה שלהם על ידי זנוביוטיקה 11,12,13,14,15,16,17.

בנוסף, הזמינות של זנים מוטנטיים מאופיינים היטב אפשרה תובנות מכניות לגבי פעולת התרופות ועמידותן. מחקרים קודמים הראו כי עמידות לתרכובות ביואקטיביות יכולה להופיע באופן תלוי בשלבים, כאשר שלבי העובר והזחל מציגים רגישות שונה. לדוגמה, שינויים באיתות גלוטמטרגי נקשרו לפנוטיפים עמידים בזחלים, בעוד שהבקיעת ביצים נותרה ללא השפעה 14,18,19,20. דבר זה מדגיש את אופיו הספציפי של הרגישות לתרופות לשלב ומרמז ששלבים עובריים עשויים לכלול מטרות שונות או נגישות שונה בהשוואה לשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר.

מעבר לפרזיטולוגיה, בדיקות חיוניות ביציות ב-C. elegans הפכו לרלוונטיות יותר ויותר בטוקסיקולוגיה ובגילוי תרופות מוקדם. בדיקות אלו יושמו לא רק להערכת פעילות אנטילמינטית אלא גם להערכת רעילות התפתחותית וליקויים עובריים שנגרמו על ידי תרופות, עם תוצאות שיכולות להיות קשורות לפרופילי רעילות אורגניזמים גבוהים^{יותר 15,16}. במקביל, נוכחות קליפת הביצה מציבה מגבלות ביולוגיות חשובות, שכן היא פועלת כמחסום חדירות מגן וסלקטיבי סביב העובר ^21,22. כתוצאה מכך, חלק מהמולקולות הביואקטיביות עשויות להיכשל להגיע לעובר למרות שהן מראות פעילות בשלבים התפתחותיים מאוחרים 14,19,23,24. לכן, הגישה לעובר תלויה ככל הנראה בתכונות הפיזיקוכימיות של כל תרכובת, כולל גודל מולקולרי וקוטביות. דבר זה עשוי לתרום להבדלים בין הפעילות שנצפתה בבדיקות בקיעת ביצים לבין זו שבשלבים ההתפתחותיים המאוחרים. הבחנה זו מדגישה את החשיבות של הגדרה ברורה הן של ההקשר הניסויי והן נקודת הסיום הביולוגית הנמדדת.

מתודולוגית, בדיקות בקיעת ביצים ב-Caenorhabditis elegans יושמו במגוון רחב של פורמטים ניסיוניים, כולל דגירה נוזלית של ביצים מסונכרנות, חשיפה ישירה לצלחות אגר המכילות תרופות, ובדיקות רב-בארות המותאמות לסינון בקצב בינוני עד גבוה 11,13,14,16,19,23,24.

פורמטים מבוססי נוזלים ומיקרופלטות אומצו באופן נרחב במחקרי סקר פרמקולוגיים, שכן הם מספקים תנאי חשיפה הומוגניים, מאפשרים שליטה מדויקת בריכוזי התרופות ומאפשרים ניתוח כמותי של יחסי ריכוז–תגובה. במקביל, פותחו אסטרטגיות דומות מבוססות בארות מרובות בארות בנמטודות טפילות, החל מבדיקות לוחות 96 בארות קונבנציונליות ועד פלטפורמות בעלות תפוקה גבוהה במיוחד המשתמשות בפורמטים של 384 בארות ^4,5. יחד, גישות אלו מדגישות את הרב-גוניות והיכולת להרחבת בדיקות בקיעת ביצים בין מיני נמטודות שונים ואת היכולת להסתגל לסביבות ניסוי מגוונות, החל ממחקרים מכניים בקנה מידה קטן ועד סקר תרכובות בקנה מידה גדול.

לכל פורמט יתרונות ומגבלות מובחנים מבחינת שליטה ניסיונית, שחזוריות, קצב העברה ונגישות. בדיקות מבוססות נוזל מספקות תנאי חשיפה הומוגניים ומתאימות היטב לניתוחים פרמקולוגיים כמותיים, בעוד שבדיקות מבוססות אגר מאפשרות חשיפה רציפה לאורך כל ההתפתחות אך מוסיפות שונות הקשורה לדיפוזיה של תרופות וזמינות ביולוגית. פורמטים של Multiwell, בתורם, מאפשרים מקביליות והפחתת צריכת מגיבים, בהתאם לאסטרטגיות סינון מודרניות.

למרות השימוש הנרחב, מבחני בקיעת ביצים מוצגים לעיתים קרובות כפרוטוקולים קבועים ולא כמסגרת מתודולוגית גמישה. השוואות ישירות בין פורמטים נדירות, וההנחיות לבחירת התצורה המתאימה ביותר ליישומים ספציפיים, החל ממחקרים מכניים ועד סביבות סינון או הוראה בקצב גבוה, נותרות מוגבלות.

במחקר זה, אנו מציעים פלטפורמה פשוטה, נגישה וגמישה לבדיקות בקיעת ביצים ב-C. elegans, תוך שילוב והשוואה בין שלוש תצורות ניסיוניות: (i) דגירה מבוקרת בצינורות מיקרוצנטריפוגות ואחריה זריעה על לוחות אגר, (ii) חשיפה ישירה על לוחות אגר המכילות תרופות, ו-(iii) בדיקות נוזל מבוססות בארות מרובות.

על ידי הערכה שיטתית של תצורות אלו, אנו שואפים להקים מסגרת מעשית המדגישה את הפשרות בין שליטה ניסויית, פשטות ויכולת הרחבה. פרספקטיבה משולבת זו מגשרת בין מתודולוגיות פרזיטולוגיות קלאסיות לגישות סינון מודרניות מבוססות מודלים, וממקמת את בדיקות בקיעת הביצים לא כשיטה סטנדרטית אחת, אלא כפלטפורמה רב-שימושית המותאמת להקשרים מחקריים מגוונים, כולל גילוי אנטילמינטים, הערכה טוקסיקולוגית, ביולוגיה התפתחותית ויישומים חינוכיים.

פרוטוקול

1. זנים ותרבות Caenorhabditis elegans

1. השתמשו בזן הפראי N2 (בריסטול) ו/או בזן הטרנסגני PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) כדי לפתח ולאמת את המתודולוגיה^25,26. PD4251 מבטא GFP, ומקל על ויזואליזציה ויישומי דימות פוטנציאליים בעת הצורך, תוך הצגת תגובות בקיעת ביצים והתפתחות שאינן ניתנות להבחנה מזו שנצפו בזן הפראי N2 בתנאים הניסיוניים ששימשו במחקר^{זה 27}.
2. השגת זנים (למשל, זן N2 מסוג פראי) ממרכז הגנטי Caenorhabditis (CGC), בתמיכת משרד תוכניות התשתיות המחקריות של המכון הלאומי לבריאות (P40 OD010440).
3. לשמור על תולעים בתנאי מעבדה סטנדרטיים בטמפרטורה של 18–25 מעלות צלזיוס על לוחות אגר טריים של מדיום הצמיחה של נמטודה (NGM) שזרעו ב-Escherichia coli OP50 כמקור מזון. הכינו NGM על ידי המסה של 16 גרם אגר, 3 גרם NaCl ו-2.5 גרם בקטופטון במים מזוקקים או אולטרה-טהורים בנפח 975 מ"ל. לחטא על ידי אוטוקלב. לאחר קירור המדיום ל-55 מעלות צלזיוס, מוסיפים תמיסות סטריליות של בופר פספט אשלגן (25 מ"ל, 1 מ', pH 6.0), CaCl₂ (1 מ"ל, 1 מ'), MgSO₄ (1 מ"ל, 1 מ'), וכולסטרול (1 מ"ל, 5 מ"ג/מ"ל באתנול אבסולוטי). ערבבו היטב ושפכו צלחות בתנאים סטריליים.
4. לבצע טיפול, הפצה ותחזוקה שגרתית בהתאם לנהלים שנקבעו כפי שמתואר ב-WormBook ובמחקרים קשורים 24,26,28,29. שמרו על תולעים בתנאי לא רעב על ידי הבטחת זמינות רציפה של מזון חיידקי והימנעות מצלחות צפופות. שמרו על תרביות בטווח הטמפרטורות המומלץ (18–25 מעלות צלזיוס) והימנעו מתנאים יבשים מדי, שכן אלו עלולים להאיץ את התייבשות האגר.
5. שיקולים כלליים לפני תחילת הבדיקה
   1. הגדר מראש את כל הפרמטרים הניסיוניים, כולל טמפרטורה (18–25 מעלות צלזיוס), זמן דגירה (4–8 שעות), לחות (50–70%) ונהלי טיפול.
   2. הכינו את כל החומרים לפני תחילת הבדיקה כדי להבטיח תזמון נכון ותיאום זרימת עבודה.
   3. לשמור על תנאי ניסוי עקביים בכל השכפולים כדי למזער שונות.

2. הכנת תרכובות בדיקה ובקרות

1. הכינו מחדש את כל התרכובות ביום הניסוי. המסה במאגרים בבופר M9 (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) או במים מזוקקים סטריליים, בהתאם לתאימות התרכובת ותנאי הבדיקה^30,31.
   הערה: בחירת התווך המימי יכולה להשפיע על פעילות התרכובות במבחני C. elegans . לדוגמה, תרכובות כמו סרוטונין עשויות להציג ריכוזים יעילים שונים כאשר הן מוכנות במים מזוקקים סטריליים לעומת בופר M9. לכן, יש להעריך אמפירית גם את תאימות הרכב וגם את התגובה הביולוגית במהלך אופטימיזציית הבדיקה. כמו כן, עבור תרכובות בעלות מסיסות מימית נמוכה, ניתן להשתמש בחומרים מתאימים כמו דימתיל סולפוקסיד (DMSO) או אתנול. ריכוזי הממס הסופיים צריכים להישאר נמוכים (בדרך כלל מתחת ל-0.2% v/v) כדי למנוע רעילות. מחקרים קודמים ב-C. elegans דיווחו כי ריכוזי DMSO עד 0.5% גורמים להשפעות מינימליות^בתנאי מעבדה סטנדרטיים.
2. הכינו לפחות חמישה ריכוזים לכל תרכובת כדי לאפשר בניית עקומות ריכוז–תגובה והערכת ערכי IC₅₀ או IC₉₀ . השתמש בדילול סדרתי עם ריכוז של פי 2 עד 3 כנקודת התחלה, והתאם את טווח הריכוז הסופי בהתאם לעוצמה, מסיסות ותגובת ניסוי צפויה של כל תרכובת.
   הערה: אם תרכובות הבדיקה רגישות לאור, יש לבצע את כל שלבי ההכנה תחת אור עמום כדי למנוע התדרדרות. זה כולל הכנת תמיסות מלאי, דילול וצלחות אגר המכילות תרופות. ככל האפשר, יש לכסות את הלוחות בנייר אלומיניום ולאחסן בחושך. באופן דומה, יש לשמור על לוחות רב-בארים מכוסים (למשל, עם נייר כסף או מכסים אטומים) במהלך הדגירה. מומלץ להשתמש במיכלים סגורים או תאים לחים שמגבילים חשיפה לאור כדי לשמור על יציבות התרכובות לאורך כל הניסוי.
3. כלול את הבקרות הבאות בכל ניסוי: בקרת בופר בלבד (M9 או מים) ובקרת רכב (למשל, DMSO או אתנול בריכוז זהה לטיפולים).
   הערה: בחירת הממס היא קריטית. DMSO ואתנול משמשים לעיתים קרובות משום שהם ממיסים תרכובות הידרופוביות תוך שמירה על ביוקואמיות בריכוזים נמוכים. גישות חלופיות, כמו טווין 20 או ציקלודקסטרינים, עשויות להיחשב כמשפרות את המסיסות. יש להשתמש בתמיסות תרופתיות מיד לאחר ההכנה, שכן יציבות לאורך זמן עשויה להשתנות ויכולה להשפיע על השכפול.

3. השגת ביצי C. elegans מסונכרנות

הערה: הבידוד של ביצי C. elegans תואר בהרחבה במחקרים קודמים^29,32. כאן מסוכמים השלבים העיקריים, הכוללים שינויים קלים למקסימום שיקום ביצים נקיות, נטולות פסולת, המתאימות לבדיקות בקיעה.

1. אוסף תולעי הריון
   1. התחל עם 3–5 לוחות NGM המכילים תרביות משולבות של בוגרים^{בהריון 25,26}. מעדיף לוחות עם מספר רב של תולעי הריון וביצים נראות, מה שמעיד על רבייה פעילה, תוך הימנעות מתרבויות צפופות או רעבות. ספירות מדויקות של התולעים בדרך כלל אינן נקבעות בשלב זה, שכן פרוטוקולי בידוד הביצים ב-C. elegans מסתמכים בדרך כלל על תרביות רבייה מתאחדות ולא על ספירות מדויקות של בעלי חיים. כהפניה כללית, כל לוח בגודל 60 מ"מ אמור להכיל כמה מאות בוגרים בהריון.
   2. הוסף מים מזוקקים לכל צלחת ושוטף בעדינות את התולעים לצינור קוני של 15 מ"ל. הימנעו מגרד משטח האגר כדי למזער פסולת.
   3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 266 × גרם ל-3 דקות (18–25 מעלות צלזיוס) כדי לפרוק את התולעים. הסר את החיידקים המכילים את הסופרנטנט.
   4. הסר את הסופרנטנט וחזר על שלב הכביסה שלוש פעמים. החזירו את הכדור בעדינות בכל פעם כדי לשפר את הסרת החיידקים שנותרו.
2. בידוד ביציות באמצעות הלבנה
   1. החזירו את כדור התולעת לתמיסת הלבנה טרייה (1.2% NaOCl ו-0.5 M NaOH; נפח סופי 5 מ"ל). הכינו את התמיסה מיד לפני השימוש כדי להבטיח פעילות.
      הערה: דגימות שהולבנו נכון הוגדרו כהכנות שבהן גופות בוגרות הופרעו או מעוכלות בעוד שהביצים השלמות נשארו תקינות וחיוניות מבחינה מורפולוגית. דגימות מובינות יתר זוהו על ידי ביצים פגועות או מעופרות, מורפולוגיית ביצים לא תקינה, ירידה בקצב הבקיעה, או היעדר זחלים חיים לאחר דגירה²⁵.
   2. מערבל בחוזקה את הצינור כדי לעודד התמוססות גופים בוגרים ושחרור ביצים. ערבבו ברציפות במהלך הדגירה כדי להבטיח חשיפה אחידה.
   3. עקוב מקרוב אחרי התגובה ואל תעלה על 5 דקות. בדוק ויזואלית: גופו של הבוגרים אמור להיות מומס ברובו בעוד הביצים נשארות שלמות.
   4. יש לעקוב מקרוב אחרי התגובה ולעצור אותה ב-5 דקות על ידי הוספת מים מזוקקים קרים וסטריליים (רצוי בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס) עד לנפח סופי של 14 מ"ל. אל תאפשר לדגירה לעבור את הזמן הזה כדי למנוע נזק לביצים.
   5. סגרו את הצינור והפכו בעדינות מספר פעמים כדי לדלל במהירות את תמיסת ההלבנה. בצע שלב זה ללא עיכוב כדי לשמור על חיוניות הביציות.
   6. צנטריפוגה ב-266 × גרם למשך 3 דקות (18–25 מעלות צלזיוס) וזרקו בזהירות את הסופרנאנט.
   7. שטפו את כדור הביצה שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים כדי להסיר לחלוטין את שאריות האקונומיקה. ודאו תלייה מחדש יסודית בין השטיפות האלה. החזירו את הביצים ל-5 מ"ל של בופר M9 או מים סטריליים.
      הערה: הלבנת הרמפרודיטים בהריון מניבה הכנת ביצים סטרילית המתאימה לבדיקות מסונכרנות. בהיעדר מזון, הזחלים שבקעו נכנסים לעצירת התפתחות L1 ומחדשים להתפתחות סינכרונית.
3. שלב הטיהור (ציפה של סוכרוז)
   1. בצע שלב זה אם ניתן לראות שאריות תולעים לאחר ההלבנה.
   2. הכינו תמיסת סוכרוז של 30% על ידי דילול תמיסת סוכרוז סטרילית של 60% (למשל, ערבבו נפחים שווים: 5 מ"ל סוכרוז 60% עם 5 מ"ל מים מזוקקים).
   3. הוסיפו את תמיסת הסוכרוז לכדור וערבבו בעדינות באמצעות היפוך. הימנע ממערבולת.
      הערה: מכיוון ששלב הטיהור קצר ואחריו שלבי שטיפה מיידיים להסרת שאריות סוכרוז, לא נצפו השפעות ניתנות לזיהוי על חיוניות הביציות בתנאים בהם נעשה שימוש במחקר זה. לעומת זאת, הסרת שאריות התולעת משפרת משמעותית את הוויזואליזציה של הביצים, דיוק הספירה ואחידות החשיפה לתרופות בין הדגימות.
   4. צנטריפוגה ב-266 × גרם למשך 5 דקות (18–25 מעלות צלזיוס).
   5. זהה את שכבת הביצה כחוג לבן דק בחלק העליון של התמיסה. אספו מיד 4 מ"ל של ביצים המכילות את הסופרנטנט על ידי הזזת קצה הפיפטה בזהירות לאורך הטבעת.
   6. בצע את השלב הזה במהירות, כאשר הביצים מתחילות לשקוע זמן קצר לאחר הצנטריפוגה בגלל כוח הכבידה.
   7. העבר את הסופרנטנט שנאסף לצינור נקי המכיל מים מזוקקים סטריליים. שטפו את הביצים פעמיים במים קרים סטריליים כדי להסיר את שאריות הסוכרוז.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי אך מומלץ בחום. הסרת פסולת משפרת את הדמיית הביצים ואת דיוק הספירה, ומבטיחה חשיפה אחידה יותר לתרכובות בדיקה על ידי מניעת לכידת ביצים בתוך חומר תולעת שאריתי.
4. הכנת תמיסת ציר ביצים
   1. ערבבו את תליית הביצים בעדינות לפני הדגימה, שכן הביצים משתקעות במהירות.
   2. הנח שלוש טיפות של 20 מיקרוליטר על שקופית וספור ביצים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   3. מחשב את הממוצע והתאמת הריכוז ל-50–100 ביצים ל-100 מיקרוליטר באמצעות בופר M9. ערבב שוב לפני ההעברה כדי לשמור על חלוקה אחידה.
   4. קבע את נפח ההשעיה הנדרש לכל תנאי ניסוי בהתאם לפרוטוקול הנבחר.

4. פורמטים של בדיקת בקיעת ביצים

1. חשיפה קצרה לביצים בצינורות מיקרוצנטריפוגות (פורמט בקרה גבוהה)
   הערה: תצורת הניסוי מבוססת על פרוצדורות²⁵ שתוארו קודם, עם התאמות לשיפור השליטה בתנאי חשיפה ויכולת השחזור.
   1. הכנת לוחות אגר לבדיקות בקיעת ביצים
      1. הכינו לוחות אגר ללא תרופות באמצעות אגר ומים מזוקקים בלבד (1.7 גרם אגר במים של 100 מ"ל). אין להוסיף חומרים מזינים או חיידקים, שכן המטרה היא להעריך את בקיעת הביצים ללא התערבות ממקורות המזון. שפוך כ-3 מ"ל אגר לכל צלחת פטרי 35 מ"מ כדי לשמור על עומק אגר עקבי לאורך הניסויים.
      2. הכינו את הצלחות 12–24 שעות לפני השימוש. הימנעו מחריגה מחלון הזמן הזה, שכן ייבוש מופרז מפחית את חיוניות הביצים ומשפיע על תנועת הזחלים.
      3. חלק כל צלחת לארבעה רבעים לאחר ההתגבשות כדי להקל על הספירה.
      4. יש לאחסן צלחות בטמפרטורה של 8–10 מעלות צלזיוס בתנאים אטומים כדי למנוע התייבשות. תן לצלחות להתאזן לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   2. העבר 500 מיקרוליטר של תליית ביצים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לכל מצב. ערבבו בעדינות בין שלבי הפיפטינג כדי למנוע שקיעת ביצים, שכן הביצים שוקעות במהירות על ידי כוח הכבידה. שמירה על תלייה הומוגנית היא קריטית להבטחת מספר ביצים דומה בתנאים שונים.
   3. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת טיפול או בקרה מתאימה לתליית הביצים של 500 מיקרוליטר. דגרו בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 4–8 שעות. הגדר מראש את זמן הדגירה ושמור עליו קבוע בין ניסויים (למשל, 6 שעות), שכן שינויים בזמן זה משפיעים ישירות על החשיפה לתרופות.
      הערה: יש להכין תמיסות טיפול בריכוז הסופי פי 2 מהריכוז הסופי הרצוי, כך שדילול לאחר ערבוב עם תליית הביצים יניב את הריכוז הסופי המיועד.
   4. שמרו על ערבוב עדין רציף במהלך הדגירה באמצעות רוטטור צינורות (למשל, סיבוב אנכי 5–20 סל"ד) או פלטפורמת נדנדה. ודאו שהצינורות נשארים בתנועה קבועה כדי למנוע שקיעת ביצים ולקדם חשיפה אחידה. שלב זה קריטי, שכן תנאים סטטיים מובילים להצטברות ביציות ולחשיפה לתרופות הטרוגניות.
   5. צנטריפוגה את הצינורות בעוצמה של 3,420 × גרם למשך 3 דקות (18–25 מעלות צלזיוס) לאחר הדגירה. זהה את הכדור, שמופיע כמשקע לבן קטן על דופן הצינור. צינורות אוריינט מסמנים בעקביות (למשל, מסמנים צד אחד) לפני הצנטריפוגה, כדי להקל על מיקום מהיר של הכדורים ולמנוע אובדן מקרי במהלך הסרת הסופרנטנט.
   6. הסר את הסופרנטנט בזהירות מבלי להפריע לכדור. שטפו את הביצים שלוש פעמים עם בופר M9 כדי להסיר תרכובות שנותרו. החזירו את הכדור האחרון ל-240 מיקרוליטר של בופר M9.
   7. ציפוי את המתלים על לוחות אגר על ידי חלוקת 20 מיקרוליטר לרבע. השתמש בשלוש פלטות לכל תנאי. אפשר לטיפות להתייבש לחלוטין לפני הזזת או הפיכת הצלחות כדי למנוע הזזת ביצים על פני השטח.
      הערה: התחילו בנפח כולל גדול יותר של תליית ביצים מהנדרש כדי לפצות על אובדן ביצים במהלך שלבי השטיפה ולהבטיח גודל דגימה סופי מספק לצליחה ולספירה. כדי לפשט את ההליך ולהפחית את השימוש בלוחות האגר, במיוחד בסביבות הוראה, העבר את הביצים התלויות ישירות ללוח רב-באר במקום לפלטות אגר. כוון את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטר לבאר ומלא בארות לא בשימוש במים סטריליים כדי למזער את ההתאדוי.
2. חשיפה ישירה לביציות על לוחות אגר המכילות תרופות
   1. הכינו תמיסת אגר המכילה רק אגר ומים מזוקקים סטריליים (1.7 גרם אגר ב-100 מ"ל). חממו עד שהתמיסה מומסת לחלוטין ושמרו על התמיסה בצורת נוזל. אפשרו לאגר להתקרר ל-50–55 מעלות צלזיוס לפני הוספת תרכובת, ועקוב אחרי הטמפרטורה באמצעות מדחום מעבדה. שלב זה קריטי לשמירה על יציבות התרכובות ולהבטחת שילוב הומוגני, כפי שתואר קודם²⁸. יש להכין לפחות חמישה ריכוזים לכל תרכובת כדי לאפשר ניתוח ריכוז–תגובה והערכת IC₅₀ .
      הערה: אין להוסיף מקורות מזון חיידקיים. בהיעדר מזון, הזחלים שבקעו נכנסים לעצירת התפתחות מסונכרנת של L1, מה שמונע התקדמות לשלבים מאוחרים יותר של הזחל במהלך תקופת הבדיקה^26,33.
   2. הוסף את נפח הפתרון המתאים של תמיסת התרופה או בקרת הרכב לאגר המקורר. ערבבו בעדינות על ידי היפוך איטי כדי להבטיח הפצה הומוגנית. הימנעו ממערבות או רעידות חזקות כדי למנוע היווצרות בועות.
   3. שופכים מיד כ-3 מ"ל אגר לתוך צלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ. עבוד בעקביות לשמור על טמפרטורה ועובי צלחת אחידים. הכינו לפחות 3–5 צלחות לכל תנאי.
   4. אחסון וטיפול בלוחות כדלקמן: לאפשר לפלטות להתגבש בטמפרטורת החדר על משטח שטוח. לוחות אחסון הפוכים כדי למנוע עיבוי מלהגיע לפני השטח של האגר.
   5. הכינו את הניסוי: זרעו 50–100 ביצים ישירות על לוחות האגר. שמור על פרמטרים ניסיוניים קבועים, כולל טמפרטורה, זמן דגירה, לחות ותזמון הכנת הצלחות. השתמש לפחות בחמישה ריכוזים לניתוח ריכוז–תגובה.
      הערה: יש להכין את הצלחות 12–24 שעות לפני השימוש. הימנעו מייבוש יתר, שכן זה עלול להשפיע על חיוניות הביצים ותנועת הזחלים. עטוף לוחות להפחתת התייבשות והגנה מפני אור בעת עבודה עם תרכובות רגישות לאור. אחסן את הצלחות בסביבה נקייה, רצויה עם לחות (למשל, מיכל אטום עם נייר לח) כדי למזער את השונות.
3. בדיקת בקיעת ביצים בלוחות רב-בארים (פורמט בינוניים עד גבוהים)
   הערה: פורמט זה נמצא בשימוש נרחב הן במחקרי C. elegans והן במחקרי נמטודות טפיליות לסקר בתפוקה בינונית עד גבוהה, ומאפשר הערכה מקבילה של תרכובות וריכוזים שונים בתנאים סטנדרטיים.
   1. הכנת לוחות באר ועיצוב ניסוי: השתמש בלוחות 96 בארות (או בפורמט חלופי בהתאם לצרכי התפוקה). הכינו מראש את פריסת הלוחות והגדירו ריכוזי תרופות (מסודרים על פני עמודות), שכפולים (בשורות), ובקרות, כולל בופר בלבד (M9 או מים) ובקרות רכב (למשל, DMSO או אתנול בריכוז סופי שבו משתמשים בטיפולים).
      הערה: השתמש בלוחות מולטיבאר שקופים עם תחתית שטוחה כדי לאפשר ויזואליזציה ישירה וספירה בכל באר תחת תאורת LED מועברת באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. ביצים וזחלים L1 שבקעו נמדדים ישירות בבארות ללא שלבי העברה, מה שממזער אובדן דגימה ומטפל בארטיפקטים.
   2. טען כל באר מראש בנפח מתאים של תמיסת תרופה או בקרה. השתמש בנפחים שווים בכל הבארות.
   3. הוספת תליית ביצים
      1. הכינו תליית ביצים הומוגנית היטב בריכוז מוגדר (ראו סעיף 2).
      2. הוסיפו נפח שווה של תליון ביצים לכל באר המכילה את תמיסת התרופה. השתמש בנפח סופי של 200 מיקרוליטר לכל באר.
      3. כוון את צפיפות הביצים לפחות ל-30 ביצים בכל באר (רצוי 30–100). אל תעלה על 100 ביצים לבאר, שכן צפיפות יתר מסבכת משמעותית את הכימות הידני. ביצים בודדות הופכות לקשות להבחנה, בעוד זחלים ניידים מסוג L1 שוחים באופן פעיל ברחבי הבאר, מה שמפחית את דיוק הספירה ומגביר את השונות הניסיונית.
      4. ערבבו בעדינות את תליית הביצים לפני הזרקה כדי להבטיח פיזור אחיד.
   4. טען את הצלחת בזהירות. הימנעו מהחדרת בועות אוויר. מבצע פיפט באופן עקבי ומחליף את הקצוות בין התנאים כדי למנוע זיהום צולב. טפחו בעדינות על הצלחת כדי לוודא שכל התכולה שוקעת בתחתית הבארות.
   5. תנאי הדגירה: דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 20–22 מעלות צלזיוס בתנאים מבוקרים ולחים, בסך הכל 24 שעות מבידוד ביצים.
      הערה: מזעור שונות על ידי הימנעות משימוש בבארות חיצוניות או מילוי בבופר כדי להפחית את האידוי. דגירה של לוחות בתא לח (למשל, מיכל אטום עם נייר לח) והגנה מפני אור בעת עבודה עם תרכובות רגישות לאור. הימנעו מתנועות מיותרות במהלך הדגירה. שמור על תזמון עקבי של הכנת הביציות וחשיפה לתרופות בכל השכפולים, שכן שינויים עשויים להשפיע על שלב ההתפתחות ופרשנות הנתונים.

5. הערכה וספירה

1. הערך את בקיעת הביצים 24 שעות לאחר בידוד הביצים, כדי לוודא שתנאי הבקרה הגיעו לבקיעה מלאה תחת הטמפרטורה המוגדרת. חשב את נקודת הזמן הזו מרגע איסוף הביציות כדי לאפשר התפתחות עוברית מספקת. חשבו על כל ביצה שעדיין לא בקעה בשלב זה כמושפעת מהטיפול.
2. בדקו דגימות תחת מיקרוסקופ סטריאו. לכל מצב (לוחות אגר או לוחות רב-בארים), כמת את מספר הביצים שלא בקעו ואת מספר הזחלים L1 שבקעו.
3. סרקו את כל אזור התצפית, כולל קצוות הלוחות וגבולות הבאר, שכן זחלי L1 ניידים עלולים להתפזר בצורה לא אחידה ולהצטבר באזורים אלו.
   הערה: בצע ספירה ישירה תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ להערכה מהירה ללא ציוד נוסף. לשמור על צפיפות ביציות עקבית בין תנאים, להשתמש לפחות ב-3–5 שכפולים טכניים לכל תנאי, ולבצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים עם הכנות ביציות שונות כדי להבטיח השוואות אמינות.

6. רכישת תמונות ותיעוד

1. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמה דיגיטלית. ללוחות אגר, יש לרשום כל רבע; עבור לוחות רב-בארים, יש לתעד כל אחד היטב בנפרד. ודאו שכל האזורים נתפסים, כולל קצוות הלוחות וגבולות הבאר, שבהם הזחלים עלולים להצטבר.
   הערה: עיניות ואובייקטים סטנדרטיים בגודל 10x, הנעים בין 0.6x ל-5x (הגדלה כוללת של פי 6 עד 50), נמצאים בשימוש נרחב ומאפשרים חזות ברורה של הביצים ושל זחלי L1 בתוך אזור הספירה. השתמש בתאורת LED מועברת. שמור על הגדרות רכישת מצלמה קבועות (בהירות, חשיפה וניגודיות) בכל תנאי הניסוי כדי להבטיח איכות תמונה עקבית והשוואה אמינה בין הדגימות.
2. השתמשו בתוכנות רכישה מתאימות ללכידת תמונות. עיבוד וניתוח תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. לשמור על פרמטרי ניתוח זהים בכל תנאי הניסוי, כולל בהירות, ניגודיות, הגדלה, אותו שטח/שדה רכישה, וקריטריוני ספירה.
3. כמת את מספר הביצים שטרם בקעו וזחלי L1 מהתמונות שנרכשו. תחשוב על הזחלים כבוקעים רק כאשר הם יצאו לחלוטין מקליפת הביצה. ביצים המכילות זחלים שצמחו חלקית צריכות להיות מסווגות כלא בקיעות. החלו קריטריוני סיווג זהים על כל תנאי הניסוי.
4. לוחות דגירה או לוחות רב-בארים למשך 12–24 שעות נוספות בטמפרטורה של 16–18 מעלות צלזיוס כדי לבדוק האם העיכוב הנצפה של בקיעת הביצים הפיך. בתנאים ניסיוניים מוגדרים, ביצים שנותרו לא בקעו בשלב זה נחשבות מושפעות מהטיפול.

7. ניתוח נתונים

1. חשב עיכוב בקיעת ביצים כך:
   שבר הביצים שלא בקעו = (מספר הביצים שלא בקעו) / (מספר הביצים הכולל + הזחלים)
2. בצע לפחות 3–5 ניסויים עצמאיים עם קבוצות ביצים שונות. הנתונים מבטאים כסטיית תקן ממוצעת ± (ממוצע SD ±).
3. יצירת עקומות ריכוז–תגובה באמצעות רגרסיה לא ליניארית וקביעת ערכי IC₅₀ .
4. לבצע השוואות סטטיסטיות בין תנאים באמצעות מבחן t של סטודנט ולהגדיר מובהקות סטטיסטית ב-p < 0.05.
5. נתח נתונים באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה.

8. יישום בדיקות בקיעת ביצים באמצעות טרנס-סינמלדהיד ולינליל אצטט

הערה: מחקר זה אינו מתמקד בתרכובת מסוימת, אלא משתמש בסוכנים מייצגים כדי להמחיש כיצד ניתן ליישום, לשלוט ולפרש כל פורמט ניסויי בתנאים דומים. טרנס-צינמלדהיד (TCA) נבחר כתרכובת המחשה משום שהוא כבר אופיין בעבר ומייצר בעקביות עיכוב חזק וניתן לשחזור של בקיעת ביצים בשלוש תצורות הבדיקה המוצגות כאן. חשוב לציין, שמטרת הכללת TCA הייתה להדגים יישום פרוטוקול והתנהגות מייצגת של ריכוז-תגובה, ולא לקבוע עוצמה יחסית או ביצועים יחסיים בין פורמטים.

1. הקמה ניסיונית והכנת תרכובות
   1. הכינו צלחות אגר (3 מ"ל לכל צלחת 35 מ"מ) 12–24 שעות מראש באמצעות מדיום אגר בלבד (1.7% במים מזוקקים). תייג את הצלחות, חלק אותן לארבעה רבעים כדי להקל על הספירה, אחסן אותן בתנאים אטומים כדי למנוע התייבשות, ואזן אותן לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   2. הכינו תמיסות טריות של טרנס-סינמלדהיד (TCA) ב-DMSO ודיללו אותן במים סטריליים או אגר כדי לקבל שמונה ריכוזים סופיים (0.05–0.7 מ"מ). שמרו על ריכוז ה-DMSO הסופי מתחת ל-0.2% בכל התנאים. כלול מים, אגר ו/או DMSO כשלילי ובקרת רכב, בהתאמה.
   3. בדקו אצטט לינליל ב-5 מ"מ כבקרה שלילית לתרכובת כדי להעריך את יכולת הבדיקה להבחין בין תרכובות פעילות ולא פעילות בתנאים ניסיוניים זהים.
   4. הכינו תליות ביצים מסונכרנות כפי שתואר לעיל והתאימו את הצפיפות ל-50–100 ביצים ל-100 מיקרוליטר. השתמשו בנפחים שווים ובמספר ביצים דומים בכל הפורמטים כדי להבטיח עקביות בין התנאים.
2. יישום פורמטים ניסיוניים באמצעות תרכובת ייחוס
   1. חשיפה קצרה בצינורות מיקרוצנטריפוגות (פורמט בקרה גבוהה)
      1. מערבבים 500 מיקרוליטר של תליית ביצים עם 500 מיקרוליטר של תמיסת טיפול המכילה 0.05–0.7 מ"מ TCA. דגרו את הצינורות במשך 6 שעות בטמפרטורה של 18–20 מעלות צלזיוס ושמרו על זמן הדגירה באופן עקבי בכל הניסויים.
      2. שמור על הצינורות תחת ערבוב עדין ורציף באמצעות רוטטור במהלך הדגירה.
      3. צנטריפוגה את הצינורות בעוצמה של 3,420 × גרם למשך 3 דקות (18–25 מעלות צלזיוס) לאחר החשיפה והסירו בזהירות את הסופרנאנט. שטפו את הביצים שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר תרכובות שנותרו ולהגביל חשיפה במהלך תקופת הדגירה המוגדרת.
      4. החזירו את הכדור הסופי למים מזוקקים בנפח 240 מיקרוליטר וצלחו את המתלה על לוחות אגר בעוצמה של 20 מיקרו ליטר לרבע, תוך שימוש בשלוש פלטות לכל תנאי. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 16–18 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לאחר בידוד הביצים.
   2. חשיפה ישירה לצלחות אגר המכילות תרופות
      1. הכינו לוחות אגר המכילות תרופות על ידי הוספת תמיסות TCA לאגר מקורר ל-50–55 מעלות צלזיוס וערבוב עדין כדי להבטיח הפצה הומוגנית. שופכים כ-3 מ"ל אגר לכל צלחת והכינו את הצלחות 12–24 שעות לפני השימוש.
      2. ביצי זרעים ישירות על פני הלוחות בצפיפויות דומות לאלו שבפורמטים אחרים (50–100 ביצים ל-100 מיקרוליטר). אל תבצע שלבי כביסה במצב זה.
      3. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 16–18 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לאחר בידוד הביצים.
   3. בדיקת לוחות רב-בארים (פורמט בתפוקה בינונית עד גבוהה)
      1. טעין מראש לוחות 96 בארות בתמיסות תרופות ובקרות. מוסיפים תליות ביצים כדי להגיע לנפח סופי של 200 מיקרוליטר לבאר וצפיפות של 50–100 ביצים לבאר.
      2. להבטיח הפצה הומוגנית במהלך הטעינה על ידי הימנעות מבועות ושמירה על נפחים אחידים בין הבארות. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 20–22 מעלות צלזיוס בתנאים לחים במשך 24 שעות לאחר בידוד הביצים.
3. רכישת תמונה וכימות
   1. העריכו את בקיעת הביצים 24 שעות לאחר בידוד הביצים, לאחר סיום הבקיעה בתנאי בקרה. ספירו את מספר הביצים שטרם בקעו וזחלי L1 תחת מיקרוסקופ סטריאו-מיקרוסקופ לכל מצב. בדקו היטב את קצוות הלוחות ואת גבולות הבארות, שכן זחלים עלולים להצטבר באזורים אלו.
   2. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמה דיגיטלית לצורכי תיעוד. הקלט כל רבע עבור לוחות אגר וצלם באופן שיטתי כל באר עבור לוחות רב-בארים. השתמש בתוכנות ניתוח תמונות כאשר נדרש כדי לתמוך בכמות.
   3. הדגר את הלוחות למשך 12–24 שעות נוספות לאחר קבלת התמונה כדי להעריך האם העיכוב הנצפה של הבקיעה הפיך.
   4. בצע את כל הניסויים באמצעות לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

תוצאות

TCA יצר עיכוב ברור תלוי בריכוז של בקיעת ביצים בכל הפורמטים הניסיוניים, כפי שמוצג באיור 1. עקומות ריכוז–תגובה מייצגות מוצגות עבור כל תצורת מבחן: צינורות מיקרוצנטריפוגה (איור 1A), חשיפה ישירה על לוחות אגר (איור 1B), ולוחות רב-בארים (איור 1C).

ערכי IC₅₀ המוערכים היו 0.19 ± 0.0262 mM בצינורות מיקרוצנטריפוגה, 0.1758 ± 0.0463 mM בלוחות אגר, ו-0.226...

דיון

מחקר זה מציג פלטפורמה פשוטה וגמישה לבדיקות בקיעת ביצים ב-Caenorhabditis elegans, המבוססת על שלושה פורמטים ניסיוניים משלימים השונים בקרה, דינמיקת חשיפה ויכולת ההתרחבות. במקום להגדיר פרוטוקול אופטימלי יחיד, התוצאות שלנו תומכות בדעה שבדיקות בקיעת ביצים צריכות להיחשב כמסגרת מתודולוגית גמישה המותאמת למטרות ניסוי ספציפיות.

הפורמט המבוסס על צינורות מיקרוצנטריפוגה מספק סביבה מבוקרת מאוד לחשיפה לתרופות, ומאפשר הגדרה מדויקת של זמן הדגירה, ריכוז התרכובות ושלבי ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agar בקטריולוגי	בריטניה	B0101406	יש להכין טרי (1.7 גרם ב-100 מ"ל H2O)
תמיסת חומר הלבנה	N/A	N/A	1.2% (v/v) NaOH ו-0.5 M NaOH
צנטריפוגה	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
צנטריפוגה	BiofugePICO לאפנדורף צינורית	Heraeus 75003235
מצלמה דיגיטלית	ToupCam	TP605100A	מצלמה דיגיטלית תעשייתית. אורך מוקד מתכוונן USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalil אצטט	SIGMA	מספר CAS: 115-95-7	יש להכין טרי
מדיום מרק ליזוגני (LB)	N/A	N/A	10 גרם Bacto-tryptone, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם NaCl ל-1 ליטר מים מזוקקים
חיץ M9	N/A	N/A	3 גרם KH2PO4, 6 גרם Na2HPO4, 5 גרם  NaCl, 0,25 גרם MgSO4 ל-1 ליטר מים מזוקקים
מסובב רוטטור מיני	BioSan	Bio RS-24
מדיום גידול נמטודות (NGM)	N/A	N/A	3 גרם NaCl, 17 גרם אגר, 2.5 גרם  Bacto-Peptone ל-1 ליטר מים מזוקקים. לעקר באמצעות חיטוי. יש להוסיף 1 מ"ל כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל),  1 מ"ל CaCl2 (1 M), 25 מ"ל חיץ אשלגן פוספט (1 M, pH 6.0) ו-1 מ"ל  MgSO4 (1 M)
צלחת פטרי (3 - 5 מ"מ)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
צלחת פטרי (90 מ"מ x 15 מ"מ)	ExtraGene	1026160305	לשימוש מעבדתי בלבד, פוליסטירן.
פיפטה	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	גרסה 12.0
מיקרוסקופ סטריאוסקופי	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	מיקרוסקופ סטריאוסקופי טרינוקולרי (הגדלה כוללת 10x–40x; תאורת LED חודרת ומוחזרת)
סוכרוז	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60% (v/v) סוכרוז
צלחת תרבות רקמות 96 באר	Biofil	TCP 012096	פוליסטירן, מכסה אידוי נמוך.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
טרנסצינמאלדהיד (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	יש להכין טרי