ציר ה-miR-21-5p-Cell Adhesion Molecule 1 בהתקדמות ובפרוגנוזה של סרטן ריאותה לא תאיים קטנים

Li Hu; Qijun Xing; Hongyan Yang; Musheng Xu

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

ציר ה-miR-21-5p-Cell Adhesion Molecule 1 בהתקדמות ובפרוגנוזה של סרטן ריאותה לא תאיים קטנים

130 צפיות

⸱

11 בספטמבר 2026

Li Hu^*¹ , Qijun Xing^*² , Hongyan Yang³ , Musheng Xu⁴

¹Department of Operation Room, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, ²Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Shihezi People's Hospital, ³School of Stomatology, Sichuan University, ⁴Department of Respiratory Medicine, Quzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מעריך את ביטוי ה-miR-21-5p, את הקשר שלו למולקולת היצמדות תאים 1 (cell adhesion molecule 1), ואת מערכות היחסים שלו עם נדידה, פרוליפרציה, ביטוי של סמני דלקת והישרדות ברקמות ובקווי תאים של סרטן ריאות מסוג שאינו תאי קטנות.

תקציר

ראיות מצביעות על כך ש-miR-21-5p הוא ווסת מולקולרי חשוב בסרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC). מולקולת הדבקת תאים 1 (CADM1) היא מדכא גידול פוטנציאלי, אך הקשר הרגולטורי בין miR-21-5p לבין CADM1 בהתקדמות של NSCLC נותר לא ברור. נעשה שימוש ב-Quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR) כדי לזהות את הביטוי של miR-21-5p ו-CADM1 ברקמות ובתאים של NSCLC; קישור מטרה של miR-21-5p ו-CADM1 אומת באמצעות בדיקת גן דגלים של לוקיפראז כפול; יכולת נדידת התאים נבדקה באמצעות בדיקת Transwell; נתונים קליניקה-פתולוגיים ואנליזת הישרדות שולבו כדי לבחון את המשמעות הקלינית של miR-21-5p; העשרה תפקודית של גני מטרה של miR-21-5p נותחה באמצעות ביואינפורמטיקה. הביטוי של miR-21-5p ברקמות NSCLC היה גבוה משמעותית מאשר ברקמות נורמליות סמוכות, ולחולים עם ביטוי גבוה של miR-21-5p הייתה הישרדות כוללת קצרה יותר. ביטוי גבוה של miR-21-5p הוא גורם סיכון עצמאי להישרדות של חולי NSCLC; ביטוי יתר של miR-21-5p קידם נדידת תאים בתאי NSCLC והגביר את הביטוי של גורמים דלקתיים; בדיקת גן דגלים של לוקיפראז כפול אישרה ש-miR-21-5p מכוון באופן ישיר ל-CADM1; ביטוי יתר של CADM1 עיכב נדידת תאים בתאי NSCLC והפחית את הביטוי של גורמים דלקתיים; אנליזה ביואינפורמטית הראתה שגני מטרה של miR-21-5p היו עשירים במסלולי איתות מרובים הקשורים להיווצרות ולהתפתחות גידולים. miR-21-5p מקדם את התקדמות ה-NSCLC על ידי התמקדמות ועיכוב של CADM1 ועשוי לשמש כסמן פרוגנוסטי וכמטרה טיפולית.

מבוא

ברחבי העולם, סרטן הריאה מדורג כאחת הסיבות המובילות לתמותה מסרטן, כאשר שכיחותו עולה באופן עקבי¹^,². בקרב אוכלוסיות ממזרח אסיה, שכיחות סרטן הריאה והתמותה ממנו מגיעות ל-222.1 ו-155.5 ל-100,000 גברים, לעומת 158.1 ו-87.3 ל-100,000 נשים, בהתאמה. סרטן ריאה מסוג שאינו תאי קטנים (NSCLC) מהווה כ-80% מכלל גידולי הריאה הזמיריים וכולל שלושה תתי-סוגים היסטולוגיים עיקריים³. בהשוואה לסרטן ריאה בעל תאים קטנים (SCLC), שהוא אגרסיבי מאוד, NSCLC מתקדם ומפיץ גרורות לאט יותר; עם זאת, תסמינים קליניים מוקדמים מעורפלים גורמים לכך שמעל 75% מהחולים מאובחנים בשלבים ביניים או בשלבים מתקדמים, מה שמוביל להישרדות כוללת נמוכה בעקביות למשך 5 שנים⁴. תהליך התווריגנזה בריאה מונע על ידי הפעלה אונקוגנית והשתקה של גנים מדכאי גידולים⁵, מה שמדגיש את הצורך הדחוף בניתוח הבסיס המולקולרי של NSCLC כדי לפתח טיפולים חדשניים⁶.

מיקרו-RNA (miRNAs, באורך של 18–25 נוקלאוטידים) מתווכים דיכוי גנים לאחר השעתוק על ידי קישור לאזור ה-3′ אזור לא מתורגם (3' UTR)′-UTR) של mRNA מטרה, ובכך גורם לדיכוי תרגום או לפירוק ה-mRNA⁷ביוגנזה של miRNAs מתחילה בשעתוק על ידי RNA polymerase II ליצירת תמלילי miRNA ראשוניים, אשר נחתכים לאחר מכן על ידי אנזימי RNase III ליצירת pre-miRNAs (miRNAs מקדימים) בעלי מבנה של לולאת שער (hairpin).⁸בעוד שרוב ה-miRNAs מדכאים ביטוי גנים באמצעות קומפלמנטריות רצפית חלקית או מלאה ל-mRNA 3'′במקרי UTRs מסוימים, miRNAs מסוימים יכולים להגביר את תרגום ה-mRNA בהקשרי מחזור תא ספציפיים⁹עד כה זוהו מאות miRNAs אנושיים, השולטים בתהליכים ביולוגיים מרכזיים, כולל שגשוג תאים, דיפרנציאציה ואפופטוזיס.¹⁰בעבר, זיהוי של miRNAs שהובעו באופן חריג נותר מאתגר מבחינה טכנית; הופעתם של ריצוף בthroughput גבוה אפשרה פרופיל מהיר ובלתי מוטה של miRNAs עם ביטוי משובש ברקמות מחולה.¹¹כאן אנו מתמקדים ב-miR-21-5p, אחד מה-miRNAs המוקדמים ביותר שאופיינו, אשר מתבטא באמצעות RNA polymerase II, ותפקודיו הרגולטוריים האונקוגניים נמצאים תחת חקירה אינטנסיבית.¹².

miR-21-5p מקודד בתוך אינטרון של הגן TMEM49 ומוסדר באופן עקבי כבעיר של ביטוי-יתר במגוון גידולים ממאירים בבני אדם, כולל סרטן הוושט, סרטן המעי הגס והמעי הדק, וסרטן הריאה¹³. נתונים פרה-קליניים קיימים עבור NSCLC מאשרים את פעילותו האונקוגנית: רמות גבוהות של miR-21-5p מאיצות פרוליפרציה של הגידול, מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי (EMT) וגרורות רחוקות על ידי השתקה של מטרות אנטי-אונקוגניות כגון PTEN ו-PDCD4¹⁴. עם זאת, עבודות קודמות התמקדו בעיקר באותות אפופטוטיים ופרוליפרטיביים המונעים על ידי miR-21, ומספר מעט של דיווחים בחנו באופן שיטתי את ציר הבקרה miR-21-5p/CADM1 ב-NSCLC¹⁵. מולקולת היצמדות לתאים 1 (CADM1) היא מדכא גידולים מוכר בסרטנים אפיתליאליים¹⁶; היא משמרת היצמדות בין-תאית כדי למנוע ניתוק של תאי גידול והפצה גרורית, והורדה בביטויה קשורה לשלב מתקדם של הגידול ולהישרדות פחותה בקוהורטות של חולי NSCLC. מבחינה מכניסטית, CADM1 גם מרסן את אותות הדלקת הפרו-גידוליים של הגורם הגרעיני קאפה B (NF-κB), המעצירים גרורות על ידי השראת הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים ועיצוב מחדש של סביבת הגידול המיקרוסקופית¹⁷. למרות תיעוד נפרד של האונקוגניות של miR-21-5p וההשפעות המדכאות גידולים של CADM1, נותרו שלושה פערים קריטיים בידע לגבי ציר miR-21-5p/CADM1 ב-NSCLC: ראשית, קישור ישיר ודיכוי של CADM1 על ידי miR-21-5p חסרים תיקוף ניסיוני בתאי סרטן ריאה; שנית, לא הוגדר האם ציר זה מניע פנוטיפים ממאירים באמצעות מסלולי דלקת במורד הזרם; שלישית, היכולת הפרוגנוסטית של חתימות ביטוי משולבות של miR-21-5p/CADM1 לא נבחנה בדגימות קליניות של NSCLC.

על בסיס שאלות פתוחות אלו, אנו מציעים השערה מכניסטית מרכזית: ביטוי מוגבר של miR-21-5p ב-NSCLC נקשר באופן ישיר ל-3′-UTR של CADM1 כדי לדכא את ביטוי CADM1, ובכך משחרר מעכבה של סיגנלינג דלקתי מטאסטטי המעוכב על ידי CADM1, דבר המאיץ את נדידת תאי NSCLC ומוביל לפרוגנוזה קלינית נמוכה יותר. מחקר זה שואף לשלוש מטרות מחקר שהוגדרו מראש: (1) אימות של התמקדות מולקולרית ישירה של miR-21-5p ב- CADM1 והערכת נדידה בקווי תאי NSCLC מסוג A549 ו-H1299; (2) הבהרה אם ציר ה-miR-21-5p/CADM1 מושפע מהפוטנציאל המטאסטטי באמצעות העברה של אותות דלקתיים; (3) הערכת הערך הפרוגנוסטי הקליני של חתימת הביטוי של miR-21-5p/CADM1 במטרה לזהות סמני אבחון חדשים ומועמדים טיפוליים עבור NSCLC מטאסטטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר רטרוספקטיבי זה נסקר ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לרפואה סינית מסורתית בקוז'ו (מספר אישור 202402208). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל מטופל שנכלל במחקר או מאפילו החוקי לפני איסוף הדגימות.

איסוף דגימות
רקמות גידול ראשוניות של NSCLC הוסרו בניתוח ממטופלים שהשתתפו במחקר, בעוד שרקמות ריאה נורמליות סמוכות תואמות נאספו באופן רטרוספקטיבי מהמרכז הלאומי למחקר הנדסי בביופסיה קלינית (Quzhou City, Zhejiang Province, China). בסך הכל נכללו במחקר עוקבה זה 157 דגימות של חולי NSCLC שגויסו ברצף בין ינואר 2019 לדצמבר 2024. גודל המדגם של 157 זוגות דגימות הוצדק סטטיסטית על סמך מחקרי פרוגנוזה של miRNA ב-NSCLC שפורסמו בעבר: בהנחה של גודל אפקט בינוני של 0.5, α = 0.05, ועוצמה סטטיסטית של 80%, גודל המדגם המינימלי הנדרש חושב כ-122 מקרים. בהתחשב באובדן פוטנציאלי של דגימות, נמק רקמות חמור ומטופלים שאיבדו מעקב, גייסנו ברצף 157 מטופלים מתאימים מינואר 2019 עד דצמבר 2024 כדי להבטיח עוצמה סטטיסטית מספקת. כל רקמות הגידול ורקמות הריאה הנורמליות הסמוכות והתואמות הוסרו מאותו מטופל במהלך כריתה כירורגית, ובכך נוצרו דגימות זוגיות לניתוחים השוואתיים עוקבים.

קריטריוני ההכללה היו: (1) חולים שאובחנו פתולוגית עם NSCLC ראשוני באמצעות ביופסיה לאחר ניתוח; (2) נתונים קליניים מלאים של קו הבסיס, שלב היסטופתולוגי ונתוני הישרדות במעקב ארוך טווח; (3) ללא טיפול קרינתי, כימותרפיה או טיפול ממוקד לפני דגימת הרקמה; (4) זמינות של דגימות זוגיות מלאות של גידול ורקמה פארא-סרטנית.

קריטריוני ההדרה היו: (1) גידולים ממאירים משניים משולבים באיברים אחרים; (2) מטופלים שאבדו למעקב בתוך 3 חודשים לאחר הניתוח; (3) דגימות עם נמק חמור או נפח רקמה בלתי מספיק לזיהוי מולקולרי עוקב.

כל דגימות הרקמה הטריות הוכנסו לחנקן נוזלי בתוך 15 min לאחר כריתה כירורגית, הועברו למקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד, ואוחסנו בטמפרטורה של −80 °C לצורך מיצוי RNA וחלבונים. מעקב קליני בוצע באופן סדיר, והישרדות כוללת נמדדה בחודשים מרגע האבחנה הפתולוגית ועד המוות או נקודת החיתוך של המעקב האחרון.

שכובה של רמות הביטוי של miR-21-5p
ערכי הביטוי היחסי של miR-21-5p של כל 157 המטופלים מוינו בסדר עולה, והקוהורט חולק לשכבות לפי נקודת חיתוך של חציון הביטוי. בשל ערכים כפולים רבים סביב החציון, מטופלים עם ביטוי נמוך מהחציון שויכו לקבוצת הביטוי הנמוך (n = 61); מטופלים עם ביטוי השווה או גבוה מהחציון, כולל כל התצפיות הכפולות בחציון, סווגו לקבוצת הביטוי הגבוה (n = 96). כלל הקצאה זה לערכים כפולים נקבע מראש לפני החלוקה לקבוצות כדי לפתור קריאות חציון כפולות, ותוצאת החלוקה אומתה מול נתוני הכמות הגולמיים של ה-qRT-PCR.

תרבית תאים
קווי תאי NSCLC אנושיים A549 ו-H1299 התקבלו מספק מסחרי (ראו טבלת חומרים). תאי A549 תוחזקו במצע RPMI-1640, ותאי H1299 תורגבשו במצע DMEM. שני מצעי תרבית התאים הועשרו ב-10% סרום בקר עוברי (FBS) שעבר נטרול חום, פניצילין (100 U/mL) וסטליפטומייצין (100 µg/mL). התאים תורגבשו בתנאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO₂.

ביצוע פרופילי חזרות טנדם קצרות (STR) שימש לאימות זהותן של תאי השורות A549 ו-H1299 לפני כל הניסויים הפונקציונליים. בדיקות לזיהוי זיהום במיקופלסמה בוצעו מדי חודש באמצעות ערכה מסחרית לגילוי מיקופלסמה מבוססת PCR, ורק תאים שהיו שליליים למיקופלסמה שימשו לבדיקות ההמשך.

תאים בשלב צמיחה לוגריתמי עם מורפולוגיה תקינה נאספו לצורך טרנספקציה זמנית. נעשה שימוש בריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. בדיקות תאיות המשך בוצעו 50 h לאחר הטרנספקציה.

טרנספקציית תאים
עבור הטרנספקציה, תאים בשלב צמיחה לוגריתמי עם מורפולוגיה תקינה נזרעו בצלחות תרבית 24 שעות מראש כדי להגיע ל-60%–70% התמזגות (confluence). הטרנספקציה בוצעה באמצעות ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. נעשה שימוש בארבע קבוצות ניסוי: בקרת mimic שלילית (mimic-NC), mimic של miR-21-5p, בקרת inhibitor שלילית (inhibitor-NC), ו-inhibitor של miR-21-5p. רצפי הנוקליאוטידים מופיעים ב-קובץ משלים 1.

RNA כולל הוצא 50 h לאחר transfection, ובוצע PCR כמותי עם שעתוק הפוך (qRT-PCR) כדי למדוד את הביטוי היחסי של miR-21-5p ולאמת את יעילות ה-transfection. בדיקות נדידה תאית בוצעו 50 h לאחר ה-transfection. עבור transfection זמני, התאים טופלו ב-miR-21-5p mimic או בביקורת שלילית (mimic-NC) בריכוז סופי של 50 nM, בעוד שה-miR-21-5p inhibitor וביקורת שלילית למעכב (inhibitor-NC) הוחדרו בריכוז של 100 nM. כדי למנוע השפעות מתערבות הנובעות מהבדלים בכמות חומצות הגרעין שהוכנסו, הכמות הכוללת של חומצות הגרעין שעברו transfection נשמרה זהה בכל ארבע קבוצות הטיפול.

שגשוג התאים הוערך באמצעות בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8). תאים שעברו טרנספקציה יציבה נזרעו בלוחות 96-בארים בריכוז של 3 × 10³ תאים/באר, כאשר עבור כל קבוצה הוקמו שש חזרות טכניות. 24, 48 ו-72 שעות לאחר הזריעה, הוספו 10 µL של ריאגנט CCK-8 לכל באר, ולאחר מכן בוצעה אינקובציה ב-37 °C למשך 2 שעות. שגשוג התאים נמדד על ידי מדידת הבליעה ב-450 nm באמצעות קורא לוחות מיקרופלט.

כל ניסויי התעתוק הזמני (transient transfection), ה-CCK-8 והנדידה בוצעו עם לא פחות משלוש חזרות ביולוגיות עצמאיות, וכל חזרה ביולוגית כללה 3–6 חזרות טכניות כפי שתואר לעיל.

PCR עם שעתוק הפוך כמותי
RNA כולל מתאי NSCLC וממרקמות גידול קליניות ומרקמות נורמליות סמוכות להן בודד באמצעות ריאגנט להפקת RNA מבוסס פנול/גואנידין (ראו טבלת חומרים). טוהר וריכוז ה-RNA נקבעו באמצעות ספקטרופוטומטריה של ultraviolet; רק דגימות עם יחסי צפיפות אופטית (OD) 260/280 ו-OD 260/230 של 1.8–2.1 עברו שעתוק הפוך. רצפי הפריימרים מופיעים ב-קובץ משלים 1. מערכת השעתוק ההפוך הכילה 500 ng של RNA כולל, 2 µL של בופר לשעתוק הפוך, 1 µL של תערובת dNTP, 0.5 µL של reverse transcriptase, 1 µL של פריימר stem-loop ספציפי עבור miRNA או פריימר oligo(dT) עבור mRNA, ומים נקיים מ-RNase עד לנפח כולל של 20 µL. מערכת ההגברה של ה-qRT-PCR (נפח כולל של 20 µL) כללה 10 µL של SYBR Green qPCR master mix, 0.4 µL של פריימר קדמי (10 µM), 0.4 µL של פריימר אחורי (10 µM), 2 µL של תבנית cDNA מדוללת, ו-7.2 µL של מים נקיים מ-RNase.

RNA שליח עבור CADM1 ו- GAPDH עבר תעתוק הפוך באמצעות ערכה לתעתוק הפוך, בעוד ש-miR-21-5p עבר תעתוק הפוך באמצעות פריימרים מסוג לולאה-גבע (stem-loop) ו-cel-miR-39 אקסוגני כבקרת spike-in. cel-miR-39 אקסוגני הוסף לכל דגימת RNA מיד לאחר בידוד ה-RNA הכולל ולפני התעתוק ההפוך. כמרכיב סינתטי C. elegans cel-miR-39, microRNA ללא רצף הומולוגי בתמלילים אנושיים, יכול לתקן את הסטייה הנגרמת מיעילות שונה של מיצוי RNA, אובדן עקב פירוק RNA ושינויים ביעילות השעתוק ההפוך בין דגימות רקמה קליניות שונות, ובכך לשמש כבקר נורמליזציה אוניברסלי חיצוני לכמות miRNA. ביצוע qRT-PCR בוצע באמצעות תערובת מאסטר המבוססת על צבע DNA פלואורסצנטי נקשב במערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלת חומרים): 95 °C במשך 3 דקות, ולאחריהם 40 מחזורים ב- 95 °C למשך 10 שניות, 60 °C במשך 30 שניות, ו- 72 °C במשך 20 שניות, עם אנליזה של עקומת התכה (melting-curve analysis) כדי לאשר הגברה ספציפית. לכל דגימה היו שלוש חזרות ביולוגיות עם שלוש חזרות טכניות לכל אחת, והביטוי היחסי חושב באמצעות שיטת ה-2⁻^ΔΔCt שיטה. רצפי פריימרים מלאים עבור CRP (חלבון C ראקטיבי), TNF-αו- IL-6 הגברה של mRNA מפורטת ב- קובץ משלים 1 לצד CADM1, GAPDH, ורצפי הפריימרים של miR-21-5p.

הקמה של ביטוי יציב של miR-21-5p בתיווך לנטי-ויראלי
וקטורים לנטי-ויראליים מסחריים LV-miR-21-5p ובקרת LV-NC ריקה נארזו בתאי 293T. רצף המקדימה (precursor) של miR-21-5p הוכנס לתוך שלד לנטי-ויראלי הנושא גנים לעמידות לפומיקומין ולדיווח GFP. על-נוזלים לנטי-ויראליים נאספו 48 שעות ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה, רוכזו וטוהרו לצורך הדבקת תאים.

תאי A549 ותאי H1299 נזרעו 24 שעות לפני ההדבקה כדי להגיע ל-50–60% התלכדות (confluence). התאים הודבקו ב-MOI = 10 (עבור A549) וב-MOI = 15 (עבור H1299) עם 5 µg/mL polybrene לשיפור יעילות הטרנספקציה. המצע הוחלף 24 שעות לאחר ההדבקה, והתאים תורגלו למשך 48 שעות נוספות לפני מיון באמצעות puromycin.

בדיקה לבחירת תאים יציבים בוצעה עם 5 µg/mL puromycin למשך 10 ימים רצופים; תאי ביקורת שאינם מזוהמים שימשו כדי לוודא סילוק מלא של תאים שאינם עברו טרנסדוקציה בתוך 7 ימים. שיבובים בודדים חיוביים ל-GFP בודדו והורחבו כדי להפיק את קווי התאים המונוקלונליים היציבים LV-21 ו-LV-NC.

עבור בדיקות הצלה (rescue assays) של CADM1, הוכנו לנטי-וירוסים מסחריים לביטוי יתר של LV-CADM1 ולהשתקה של sh-CADM1. הוקמו ארבע קבוצות ניסוי: LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1, וקבוצת הצלה של LV-miR-21-5p + LV-CADM1. הדבקה בלנטי-וירוסים של CADM1 בוצעה באותו MOI ובתנאי סינון של puromycin כפי שבוצע עבור וקטורי miR-21-5p. כל ניסויי השגשוג והנדידה של ההצלה חזרו בשלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות.

תיקוף של ביטוי יתר יציב של miR-21-5p
RNA כולל הוצא מהשיקולים של שיבוטי תאים יציבים מסוג LV-21 ו-LV-NC. בוצע qRT-PCR כדי לזהות את רמת הביטוי היחסית של hsa-miR-21-5p תוך שימוש ב-cel-miR-39 כרפרנס חיצוני. שיבוטי תאים עם עלייה של פי 8 ומעלה בביטוי של miR-21-5p ביחס לקבוצת ה-LV-NC נשמרו לכל הבדיקות התפקודיות העוקבות, מה שאישר את הבנייה המוצלחת של שורות תאים עם ביטוי יתר יציב של miR-21-5p.

בדיקת נשוא לוקידאזה כפולה (Dual-luciferase reporter assay)
הוכנו פלסמיד נשוא ל-3'-UTR של CADM1 מסוג פראי (WT-CADM1) המכיל את רצף הקישור החזוי של miR-21-5p, ופלסמיד נשוא ל-3'-UTR של CADM1 מוטנטי (MUT-CADM1) עם אזור זרע (seed region) של קישור מוטנטי. תאי A549 נזרעו בלוחות בעלי 24 בארות 24 שעות לפני הטרנספקציה כדי להגיע ל-60%–70% התמזגות (confluence). לכל בארה בוצע טרנספקציה משולבת (co-transfection) של 500 ng של פלסמיד הנשוא WT/MUT, 50 nM של miR-21-5p mimic או mimic-NC, ופלסמיד ייחוס פנימי של Renilla luciferase ביחס מסות קבוע. לאחר דגירה של 48 שעות לאחר הטרנספקציה, התאים עברו ליזיס מלא, ואותי הלומנסנס של לוקידאזה מסוג firefly ו-Renilla גולו באופן רצופי באמצעות ערכה לגילוי לוקידאזה כפולה. הפעילות היחסית של הלוקידאזה חושבה כיחס בין ערך הלומנסנס של firefly לערך הלומנסנס של Renilla. כל קבוצת ניסוי כללה שלושה שחזורים ביולוגיים עצמאיים, עם שלושה שחזורים טכניים לכל שחזור ביולוגי, ובדיקת t-test לדגימות עצמאיות עם שתי קבוצות שימשה להשוואה סטטיסטית של הפעילות היחסית של הלוקידאזה בין קבוצות ה-mimic-NC ל-miR-21-5p mimic.

בדיקת נדידה בשיטת Transwell
עבור בדיקת הנדידה בשיטת Transwell, תאים שעברו טרנספקציה יציבה הושעו במצע ללא סרום והוחדרו למאגרי המבחנה העליונים בריכוז של 4 × 10⁴ תאים לבאר. התאים התחתונים מולאו במצע גידול מלא בתוספת 10% FBS כדי ליצור מדרג כימוטקטי. לאחר דגירה של 48 h בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂, הוסרו בזהירות התאים שנותרו על פני השטח העליון של הממברנה. תאים שנדדו לצד התחתון של הממברנה קובעו במתנול ונצבעו ב-crystal violet. הנדידה כומתה על ידי ספירת תאים בחמישה שדות מיקרוסקופיים שנבחרו באופן אקראי לכל מאגר. כל ניסוי בוצע באמצעות שלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, כאשר לכל חזרה ביולוגית נספו שלוש חזרות טכניות.

ניתוחים סטטיסטיים
כל ניסויי ה-in vitro נערכו עם לפחות שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, כאשר כל אחת מהן לווה בחזרות טכניות תואמות. התפלגות הנתונים הוערכה תחילה באמצעות מבחן נורמליות של Shapiro-Wilk כדי להנחות את הניתוח הסטטיסטי. להשוואות מזווגות בין גידולי גידול לרקמות נורמליות סמוכות, הוחל מבחן t מזווג או מבחן הדרגות המחתומות של Wilcoxon מזווג, בהתאם להתפלגות הנתונים. השוואות בין שתי קבוצות בלתי תלויות נותחו באמצעות מבחן t בלתי תלוי או מבחן Mann-Whitney U. הבדלים בין מספר קבוצות, כולל ניסויי הצלה (rescue), הוערכו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחריו תיקון post hoc של Bonferroni, בעוד ש-ANOVA למדידות חוזרות שימש לניתוח מערכי נתונים לאורכיים, כגון בדיקות השכפול של CCK-8 ובדיקות ריפוי פצעים. קשרים בין משתנים קליניים קטגוריאליים נבחנו באמצעות מבחן χ², והקשר בין ביטוי miR-21-5p לבין CADM1 הוערך באמצעות ניתוח מתאם של פירסון. הישרדות מטופלים נותחה באמצעות עקומות Kaplan-Meier עם השוואות שבוצעו באמצעות מבחן log-rank. גורמים פרוגנוסטיים בלתי תלויים זוהו באמצעות ניתוחי רגרסיה של סיכוני קוקס (Cox proportional hazards regression) חד-משתניים ורב-משתניים. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-P < 0.05. רגרסיית קוקס רב-משתנית הותאמה לגיל, מין, סוג היסטולוגי, רמת miR-21-5p ומצב קשרי לימפה (נקודת ייחוס: גיל ≤ 60, נקבה, קרצינומה סקוואמוזית, miR-21-5p נמוך, ללא מעורבות קשרי לימפה); שאריות Schoenfeld שימשו לבדיקת הנחת הסיכונים הפרופורציונליים, ומשתנים עם P < 0.10 בניתוח חד-משתני נכללו באמצעות בחירת enter.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מתאם בין ביטוי miR-21-5p למאפיינים קליניקו-פתולוגיים של חולי NSCLC
סך של 157 דגימות גידול של NSCLC חולקו לקבוצות של ביטוי נמוך של miR-21-5p (n = 61) וביטוי גבוה (n = 96) על בסיס רמות החציון של miR-21-5p, ואנליזות chi-square העלו כי אין מתאמים מובהקים בין ביטוי miR-21-5p לגיל המטופל (χ² = 1.36, P = 0.2435), מין (χ² = 1.06, P = 0.3032), סוג היסטולוגי (χ² = 1.09, P = 0.2965) או גודל הגידול (χ² = 5.623, P = 0.0601), בעוד שביטוי גבוה של miR-21-5p היה קשור באופן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה אישר באופן שיטתי ביטוי מוגבר של miR-21-5p ברקמות קליניות של NSCLC, אשר נמצא במתאם עם שעתוק מוגבר של גורמים דלקתיים, ויכולת נדידה ושגשוג תאי גבוהה יותר; במקביל, ניסויי dual-luciferase, qRT-PCR וניסויי הצלה (rescue) זיהו את CADM1 כמטרה התפקודית הישירה שלו. חיזויים ביו-אינפורמטיים הצביעו עוד על כך שמטרות השלב הבא (downstream) של miR-21-5p הועשרו במסלולי האונקוגנים של MAPK ו-Ras, ובכך סיפקו ראיות ראשוניות לכך שציר ה-miR-21-5p/CADM1 עשוי להיות מעורב במסלולי איתות הקשורים להתקדמות ממאירה של הגידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים כספיים או בלתי כספיים רלוונטיים להצהרה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פורמלין ניטרלי בבופר בריכוז 10%	Fisher Scientific (Fisherbrand™)	SF100-4 (טיפוסי)	מקבע רקמות; רקמות שנחתכו ל- &עובי של פחות מ-5 מ"מ, קיבוע בטמפרטורת החדר למשך 14–26 שעות
פלטת תרביות תאים בעלת 24 בארות	Corning	3526	פיתח לזריעת תאים שעברו טרנספקציה ולביצוע בדיקת ריפוי פצעים (שריטה)
קו תאי A549	ATCC (או מרכז המשאבים של שנחאי)	CCL-185	קו תאים של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) באדם (אדנוקרצינומה)
ערכה לבדיקת CCK-8	Dojindo	CK04	גילוי שגשוג (פרוליפרציה)
מצע לתרבית תאים (לא צוין)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	שונים (למשל, RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022)	מצע בסיסי עבור שורות תאים של NSCLC; ההרכב המדויק תלוי בשורת התאים שבשימוש
cel-miR-39 (בקרת Spike-in חיצונית)	GenePharma (שנגחאי, סין)	מותאם אישית (למשל, B010302)	רפרנס חיצוני לנורמליזציה של ביטוי miRNA, שנוסף במהלך בידוד ה-RNA
CO₂ אינקובטור (מלביב/בעל לחות)	Thermo Fisher Scientific (Heracell)	Heracell 150i (50116047)	מספק 37°C, 5% CO2₂ולחות רוויה לתרביות תאים
CRP/TNF-αזוגי פריימרים ל-IL-6	Sangon Biotech	סינתזה מותאמת אישית	רצפים מלאים בקובץ המלווה 1
תמיסת צביעה בקריסטל ויולט	Solarbio	G1062	צביעת תאים נודדים
מצע DMEM	Gibco	11965092	עבור תרבית H1299/293T
ערכה לבדיקת דאלי-לוסיפראז (Dual-luciferase reporter assay kit)	Promega	E1910	גילוי 3'UTR של CADM1 מסוג WT/MUT
cel-miR-39 אקסוגני	Qiagen	הוספה מותאמת אישית של תוכן פנימי (custom spike-in)	נוסף שלב לאחר בידוד ה-RNA לצורך נורמליזציה
סרום עוברי בקר (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10437028	תוסף המומס למצע גידול בריכוז סופי של 10% לתמיכה בצמיחת תאים
טיפ פטנט דק לפפיטה (למשל, 10 µL טיפ)	Axygen (Corning)	T-300	משמש לגרידה ידנית של שכבה אחת של תאים כדי ליצור "פצע" פער
GAPDH (בקרה אנדוגנית)	ספקים מרובים (למשל, Sangon Biotech, RiboBio; פריימרים בהתאמה אישית)	מותאם אישית	גן ייחוס לנורמליזציה של mRNA המשמש ב-qRT-PCR
GO/KEGG (הערות אנוטציה של clusterProfiler)	Bioconductor	בנייה 2026
GraphPad Prism	תוכנת GraphPad	v9.5.1	שרטוט גרפים & סטטיסטיקה in vitro
קו תאי H1299	ATCC (או מרכז המשאבים של שנחאי)	CRL-5803	קו תאים של סרטן ריאה מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) באדם, שנגזר מגרורה בבלוטת לימפה
FBS שעבר אינאקטיבציה בחום	Gibco	10099141	ריכוז עבודה של 10%
קו תאי HEK-293T	ATCC	CRL-3216	RRID:CVCL_0063; בדיקת STR מדי חודש, תוצאות בדיקת זיהוי מיקופלסמה שליליות
תערובת אריזה ללנטי-וירוס	Genecopoeia (או Takara Bio)	HPK-LvT-100 (Genecopoeia)	מספק פלסמידי אריזה (gag/pol, rev, vsv-g) לייצור לנטי-וירוס
וקטור Lentivirus-21 (LV-21)	GeneChem (שנגחאי, סין) או Genecopoeia	מותאם אישית	וקטור לנטי-ויראלי המכיל miR-21-5p ליצירת שורות תאים בעלות ביטוי יציב
וקטור Lentivirus-NC (LV-NC)	GeneChem (שנגחאי, סין) או Genecopoeia	מותאם אישית	וקטור לנטי-ויראלי של בקרת שלילה ללא השחלה של miR-21-5p
ריאגנט טרנספקציה ליפידי	Thermo Fisher	L3000015	עבור טרנספקציה זמנית
סוכן הטרנספקציה Lipofectamine 3000	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	L3000015 או L3000008	ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים; 50 שעות לאחר הטרנספקציה עבור ניסויים המשכיים
מתנול	Sinopharm	67-56-1	קיבוע תאים
מתנול (מקבע/מדלל צביעה)	Sigma-Aldrich	34860	משמש כחומר מקבע או כמדלל לצביעה ב-crystal violet
מעכב miR-21-5p/מעכב-NC	GenePharma	סינתזה מותאמת אישית	רצפים בקובץ המשלים 1
miR-21-5p mimic/mimic-NC	GenePharma	סינתזה מותאמת אישית	רצפים בקובץ המשלימים 1
miRDB	אוניברסיטת וושינגטון	גרסה 6.0
miRWalk	אוניברסיטת היידלברג	גרסה 3.0
המרכז הלאומי להנדסת ביופסיה	המרכז הלאומי להנדסת ביופסיות (סין)	לא רלוונטי	ספק מוסדי של דגימות רקמות של סרטן ריאה עם נתונים קליניים רשומים ואבחנה היסטופתולוגית
רקמת NSCLC (עבור תרבית ראשונית)	Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co.	הזמנה מותאמת אישית	מקור הרקמה; תורגדו במצע עם 10% FBS ב- 37°C; תאים בעלי מורפולוגיה טובה בשלב צמיחה לוגריתמי נבחרים לטרנספקציה
מכשיר PCR	Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific)	7500 Fast (4406984)	השגת תוצרי הגברה עבור qRT-PCR
פניצילין-סטרפטומייצין	Solarbio	P1400	100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטריפטומייצין
פיפטות (בודדות & רב-ערוצי	Eppendorf	סדרת Research Plus	לטיפול מדויק בנוזלים בכל הניסויים
פוליברן (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268	סופי 5 μg/mL להדבקה בלנטי-וירוס
פומסין (Puromycin)	InvivoGen	נמלה-פרוטוקול-1	5 μg/mL לסריקת תאי קו יציב
פיורומיצין דיהידרוכלוריד	Thermo Fisher Scientific (InvivoGen)	ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich)	אנטיביוטיקה לסלקציה, בשימוש בריכוז של 5 μg/mL להקמת שורות תאים שעברו טרנספקציה יציבה
R	R Foundation	v4.2.1	חבילות: clusterProfiler, ggplot2
ערכה לשעתוק הפוך	Takara	RR047	RT מסוג לולאה-גבעול (Stem-loop) עבור miRNA, oligo(dT) עבור mRNA
מבחנות EP נקיות מ-RNase	Axygen (Corning)	MCT-150-C	מבחנות בנפח 1.5 מ"ל נקיות מ-RNase לאחסון ועיבוד RNA
מצע RPMI-1640	Gibco	11875093	עבור תרבית A549
si-CADM1	GenePharma	סינתזה מותאמת אישית	רצפים בקובץ המשליים 1
si-NC	GenePharma	סינתזה בהתאמה אישית	רצפים בקובץ המשליים 1
SPSS	IBM	גרסה 26.0	ניתוח רגרסיה קלינית/Cox
תערובת מאסטר ל-qPCR עם SYBR Green	Roche	4913914001	הגברה באמצעות qRT-PCR
TargetScan	MIT	v8.2
ריאגנט למיצוי RNA כולל	Takara	9109	ליסיס מבוסס פנול/גואנידין
תא Trans-well	Corning (Costar)	3422 (24 בארות, 8.0 µm)	עבור טרנספקציית תאים בתוך מצע בטמפרטורת החדר; הוספת פריימרים כימיים ודגירה למשך 48 שעות
תאי נדידה מסוג Transwell	Corning	3422	8 μm גודל נקבוביות
ריאגנט TRIzol	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	15596026	מיצוי RNA כולל מדגימות רקמה; הערכת איכות ה-RNA באמצעות יחסי OD260/280 ו-OD260/230
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	25200072	לניתוק תאים מכלי תרבית לפני זריעה בלוחות בעלי 24 בארות

מקורות

Bautista-Sánchez D, et al. The promising role of miR-21 as a cancer biomarker and its importance in RNA-based therapeutics. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;20:409-20.
Zhou J, et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 2024;93:102693.
Nicholson AG, et al. The 2021 WHO classification of lung tumors: impact of advances since 2015. J Thorac Oncol. 2022;17(3):362-87.
The Lancet Regional Health – Europe. NSCLC: bridging the gap between clinical progress and real-world application. Lancet Reg Health Eur. 2024;38:100878.
Reyes J, et al. Oncogenic and tumor-suppressive forces converge on a progenitor niche at the benign-to-malignant transition. Cell. 2026;189(10):2875-97.e53.
Yu L, Yang R, Long Z, Tao Q, Liu B. Targeted therapy of non-small cell lung cancer: mechanisms and clinical trials. Front Oncol. 2024;14:1451230.
O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402.
Treiber T, Treiber N, Meister G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(1):5-20.
Ohno S, Kuroda M. Exosome-mediated targeted delivery of miRNAs. Methods Mol Biol. 2016;1448:261-70.
Ell B, Kang Y. MicroRNAs as regulators of bone homeostasis and bone metastasis. Bonekey Rep. 2014;3:549.
Dedeoğlu BG. High-throughput approaches for microRNA expression analysis. Methods Mol Biol. 2014;1107:91-103.
Qu K, et al. Circulating miRNA-21-5p as a diagnostic biomarker for pancreatic cancer: evidence from comprehensive miRNA expression profiling analysis and clinical validation. Sci Rep. 2017;7(1):1692.
Xu H, et al. Engineered exosomes transporting the lncRNA, SVIL-AS1, inhibit the progression of lung cancer via targeting miR-21-5p. Am J Cancer Res. 2024;14(7):3335-47.
Chawra HS, et al. MicroRNA-21's role in PTEN suppression and PI3K/AKT activation: implications for cancer biology. Pathol Res Pract. 2024;254:155091.
Huang Y, Feng G. MiR-423-5p aggravates lung adenocarcinoma via targeting CADM1. Thorac Cancer. 2021;12(2):210-7.
Hartsough EJ, et al. CADM1 is a TWIST1-regulated suppressor of invasion and survival. Cell Death Dis. 2019;10(4):281.
Li H, Gao J, Zhang S. Functional and clinical characteristics of cell adhesion molecule CADM1 in cancer. Front Cell Dev Biol. 2021;9:714298.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

CADM1 מדכא גידולים נדידת תאים בדיקת לוציפראז כפולה qRT-PCR סמן ביולוגי פרוגנוסטי ניתוח ביו-אינפורמטיקה