מחקר זה מעריך את ביטוי ה-miR-21-5p, את הקשר שלו למולקולת היצמדות תאים 1 (cell adhesion molecule 1), ואת מערכות היחסים שלו עם נדידה, פרוליפרציה, ביטוי של סמני דלקת והישרדות ברקמות ובקווי תאים של סרטן ריאות מסוג שאינו תאי קטנות.
מאמר מחקר
ציר ה-miR-21-5p-Cell Adhesion Molecule 1 בהתקדמות ובפרוגנוזה של סרטן ריאותה לא תאיים קטנים
28 צפיות
⸱
11 בספטמבר 2026
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ראיות מצביעות על כך ש-miR-21-5p הוא ווסת מולקולרי חשוב בסרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC). מולקולת הדבקת תאים 1 (CADM1) היא מדכא גידול פוטנציאלי, אך הקשר הרגולטורי בין miR-21-5p לבין CADM1 בהתקדמות של NSCLC נותר לא ברור. נעשה שימוש ב-Quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR) כדי לזהות את הביטוי של miR-21-5p ו-CADM1 ברקמות ובתאים של NSCLC; קישור מטרה של miR-21-5p ו-CADM1 אומת באמצעות בדיקת גן דגלים של לוקיפראז כפול; יכולת נדידת התאים נבדקה באמצעות בדיקת Transwell; נתונים קליניקה-פתולוגיים ואנליזת הישרדות שולבו כדי לבחון את המשמעות הקלינית של miR-21-5p; העשרה תפקודית של גני מטרה של miR-21-5p נותחה באמצעות ביואינפורמטיקה. הביטוי של miR-21-5p ברקמות NSCLC היה גבוה משמעותית מאשר ברקמות נורמליות סמוכות, ולחולים עם ביטוי גבוה של miR-21-5p הייתה הישרדות כוללת קצרה יותר. ביטוי גבוה של miR-21-5p הוא גורם סיכון עצמאי להישרדות של חולי NSCLC; ביטוי יתר של miR-21-5p קידם נדידת תאים בתאי NSCLC והגביר את הביטוי של גורמים דלקתיים; בדיקת גן דגלים של לוקיפראז כפול אישרה ש-miR-21-5p מכוון באופן ישיר ל-CADM1; ביטוי יתר של CADM1 עיכב נדידת תאים בתאי NSCLC והפחית את הביטוי של גורמים דלקתיים; אנליזה ביואינפורמטית הראתה שגני מטרה של miR-21-5p היו עשירים במסלולי איתות מרובים הקשורים להיווצרות ולהתפתחות גידולים. miR-21-5p מקדם את התקדמות ה-NSCLC על ידי התמקדמות ועיכוב של CADM1 ועשוי לשמש כסמן פרוגנוסטי וכמטרה טיפולית.
מבוא
ברחבי העולם, סרטן הריאה מדורג כאחת הסיבות המובילות לתמותה מסרטן, כאשר שכיחותו עולה באופן עקבי1,2. בקרב אוכלוסיות ממזרח אסיה, שכיחות סרטן הריאה והתמותה ממנו מגיעות ל-222.1 ו-155.5 ל-100,000 גברים, לעומת 158.1 ו-87.3 ל-100,000 נשים, בהתאמה. סרטן ריאה מסוג שאינו תאי קטנים (NSCLC) מהווה כ-80% מכלל גידולי הריאה הזמיריים וכולל שלושה תתי-סוגים היסטולוגיים עיקריים3. בהשוואה לסרטן ריאה בעל תאים קטנים (SCLC), שהוא אגרסיבי מאוד, NSCLC מתקדם ומפיץ גרורות לאט יותר; עם זאת, תסמינים קליניים מוקדמים מעורפלים גורמים לכך שמעל 75% מהחולים מאובחנים בשלבים ביניים או בשלבים מתקדמים, מה שמוביל להישרדות כוללת נמוכה בעקביות למשך 5 שנים4. תהליך התווריגנזה בריאה מונע על ידי הפעלה אונקוגנית והשתקה של גנים מדכאי גידולים5, מה שמדגיש את הצורך הדחוף בניתוח הבסיס המולקולרי של NSCLC כדי לפתח טיפולים חדשניים6.
מיקרו-RNA (miRNAs, באורך של 18–25 נוקלאוטידים) מתווכים דיכוי גנים לאחר השעתוק על ידי קישור לאזור ה-3′ אזור לא מתורגם (3' UTR)′-UTR) של mRNA מטרה, ובכך גורם לדיכוי תרגום או לפירוק ה-mRNA7ביוגנזה של miRNAs מתחילה בשעתוק על ידי RNA polymerase II ליצירת תמלילי miRNA ראשוניים, אשר נחתכים לאחר מכן על ידי אנזימי RNase III ליצירת pre-miRNAs (miRNAs מקדימים) בעלי מבנה של לולאת שער (hairpin).8בעוד שרוב ה-miRNAs מדכאים ביטוי גנים באמצעות קומפלמנטריות רצפית חלקית או מלאה ל-mRNA 3'′במקרי UTRs מסוימים, miRNAs מסוימים יכולים להגביר את תרגום ה-mRNA בהקשרי מחזור תא ספציפיים9עד כה זוהו מאות miRNAs אנושיים, השולטים בתהליכים ביולוגיים מרכזיים, כולל שגשוג תאים, דיפרנציאציה ואפופטוזיס.10בעבר, זיהוי של miRNAs שהובעו באופן חריג נותר מאתגר מבחינה טכנית; הופעתם של ריצוף בthroughput גבוה אפשרה פרופיל מהיר ובלתי מוטה של miRNAs עם ביטוי משובש ברקמות מחולה.11כאן אנו מתמקדים ב-miR-21-5p, אחד מה-miRNAs המוקדמים ביותר שאופיינו, אשר מתבטא באמצעות RNA polymerase II, ותפקודיו הרגולטוריים האונקוגניים נמצאים תחת חקירה אינטנסיבית.12.
miR-21-5p מקודד בתוך אינטרון של הגן TMEM49 ומוסדר באופן עקבי כבעיר של ביטוי-יתר במגוון גידולים ממאירים בבני אדם, כולל סרטן הוושט, סרטן המעי הגס והמעי הדק, וסרטן הריאה13. נתונים פרה-קליניים קיימים עבור NSCLC מאשרים את פעילותו האונקוגנית: רמות גבוהות של miR-21-5p מאיצות פרוליפרציה של הגידול, מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי (EMT) וגרורות רחוקות על ידי השתקה של מטרות אנטי-אונקוגניות כגון PTEN ו-PDCD414. עם זאת, עבודות קודמות התמקדו בעיקר באותות אפופטוטיים ופרוליפרטיביים המונעים על ידי miR-21, ומספר מעט של דיווחים בחנו באופן שיטתי את ציר הבקרה miR-21-5p/CADM1 ב-NSCLC15. מולקולת היצמדות לתאים 1 (CADM1) היא מדכא גידולים מוכר בסרטנים אפיתליאליים16; היא משמרת היצמדות בין-תאית כדי למנוע ניתוק של תאי גידול והפצה גרורית, והורדה בביטויה קשורה לשלב מתקדם של הגידול ולהישרדות פחותה בקוהורטות של חולי NSCLC. מבחינה מכניסטית, CADM1 גם מרסן את אותות הדלקת הפרו-גידוליים של הגורם הגרעיני קאפה B (NF-κB), המעצירים גרורות על ידי השראת הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים ועיצוב מחדש של סביבת הגידול המיקרוסקופית17. למרות תיעוד נפרד של האונקוגניות של miR-21-5p וההשפעות המדכאות גידולים של CADM1, נותרו שלושה פערים קריטיים בידע לגבי ציר miR-21-5p/CADM1 ב-NSCLC: ראשית, קישור ישיר ודיכוי של CADM1 על ידי miR-21-5p חסרים תיקוף ניסיוני בתאי סרטן ריאה; שנית, לא הוגדר האם ציר זה מניע פנוטיפים ממאירים באמצעות מסלולי דלקת במורד הזרם; שלישית, היכולת הפרוגנוסטית של חתימות ביטוי משולבות של miR-21-5p/CADM1 לא נבחנה בדגימות קליניות של NSCLC.
על בסיס שאלות פתוחות אלו, אנו מציעים השערה מכניסטית מרכזית: ביטוי מוגבר של miR-21-5p ב-NSCLC נקשר באופן ישיר ל-3′-UTR של CADM1 כדי לדכא את ביטוי CADM1, ובכך משחרר מעכבה של סיגנלינג דלקתי מטאסטטי המעוכב על ידי CADM1, דבר המאיץ את נדידת תאי NSCLC ומוביל לפרוגנוזה קלינית נמוכה יותר. מחקר זה שואף לשלוש מטרות מחקר שהוגדרו מראש: (1) אימות של התמקדות מולקולרית ישירה של miR-21-5p ב- CADM1 והערכת נדידה בקווי תאי NSCLC מסוג A549 ו-H1299; (2) הבהרה אם ציר ה-miR-21-5p/CADM1 מושפע מהפוטנציאל המטאסטטי באמצעות העברה של אותות דלקתיים; (3) הערכת הערך הפרוגנוסטי הקליני של חתימת הביטוי של miR-21-5p/CADM1 במטרה לזהות סמני אבחון חדשים ומועמדים טיפוליים עבור NSCLC מטאסטטי.
פרוטוקול
מחקר רטרוספקטיבי זה נסקר ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לרפואה סינית מסורתית בקוז'ו (מספר אישור 202402208). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל מטופל שנכלל במחקר או מאפילו החוקי לפני איסוף הדגימות.
איסוף דגימות
רקמות גידול ראשוניות של NSCLC הוסרו בניתוח ממטופלים שהשתתפו במחקר, בעוד שרקמות ריאה נורמליות סמוכות תואמות נאספו באופן רטרוספקטיבי מהמרכז הלאומי למחקר הנדסי בביופסיה קלינית (Quzhou City, Zhejiang Province, China). בסך הכל נכללו במחקר עוקבה זה 157 דגימות של חולי NSCLC שגויסו ברצף בין ינואר 2019 לדצמבר 2024. גודל המדגם של 157 זוגות דגימות הוצדק סטטיסטית על סמך מחקרי פרוגנוזה של miRNA ב-NSCLC שפורסמו בעבר: בהנחה של גודל אפקט בינוני של 0.5, α = 0.05, ועוצמה סטטיסטית של 80%, גודל המדגם המינימלי הנדרש חושב כ-122 מקרים. בהתחשב באובדן פוטנציאלי של דגימות, נמק רקמות חמור ומטופלים שאיבדו מעקב, גייסנו ברצף 157 מטופלים מתאימים מינואר 2019 עד דצמבר 2024 כדי להבטיח עוצמה סטטיסטית מספקת. כל רקמות הגידול ורקמות הריאה הנורמליות הסמוכות והתואמות הוסרו מאותו מטופל במהלך כריתה כירורגית, ובכך נוצרו דגימות זוגיות לניתוחים השוואתיים עוקבים.
קריטריוני ההכללה היו: (1) חולים שאובחנו פתולוגית עם NSCLC ראשוני באמצעות ביופסיה לאחר ניתוח; (2) נתונים קליניים מלאים של קו הבסיס, שלב היסטופתולוגי ונתוני הישרדות במעקב ארוך טווח; (3) ללא טיפול קרינתי, כימותרפיה או טיפול ממוקד לפני דגימת הרקמה; (4) זמינות של דגימות זוגיות מלאות של גידול ורקמה פארא-סרטנית.
קריטריוני ההדרה היו: (1) גידולים ממאירים משניים משולבים באיברים אחרים; (2) מטופלים שאבדו למעקב בתוך 3 חודשים לאחר הניתוח; (3) דגימות עם נמק חמור או נפח רקמה בלתי מספיק לזיהוי מולקולרי עוקב.
כל דגימות הרקמה הטריות הוכנסו לחנקן נוזלי בתוך 15 min לאחר כריתה כירורגית, הועברו למקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד, ואוחסנו בטמפרטורה של −80 °C לצורך מיצוי RNA וחלבונים. מעקב קליני בוצע באופן סדיר, והישרדות כוללת נמדדה בחודשים מרגע האבחנה הפתולוגית ועד המוות או נקודת החיתוך של המעקב האחרון.
שכובה של רמות הביטוי של miR-21-5p
ערכי הביטוי היחסי של miR-21-5p של כל 157 המטופלים מוינו בסדר עולה, והקוהורט חולק לשכבות לפי נקודת חיתוך של חציון הביטוי. בשל ערכים כפולים רבים סביב החציון, מטופלים עם ביטוי נמוך מהחציון שויכו לקבוצת הביטוי הנמוך (n = 61); מטופלים עם ביטוי השווה או גבוה מהחציון, כולל כל התצפיות הכפולות בחציון, סווגו לקבוצת הביטוי הגבוה (n = 96). כלל הקצאה זה לערכים כפולים נקבע מראש לפני החלוקה לקבוצות כדי לפתור קריאות חציון כפולות, ותוצאת החלוקה אומתה מול נתוני הכמות הגולמיים של ה-qRT-PCR.
תרבית תאים
קווי תאי NSCLC אנושיים A549 ו-H1299 התקבלו מספק מסחרי (ראו טבלת חומרים). תאי A549 תוחזקו במצע RPMI-1640, ותאי H1299 תורגבשו במצע DMEM. שני מצעי תרבית התאים הועשרו ב-10% סרום בקר עוברי (FBS) שעבר נטרול חום, פניצילין (100 U/mL) וסטליפטומייצין (100 µg/mL). התאים תורגבשו בתנאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO₂.
ביצוע פרופילי חזרות טנדם קצרות (STR) שימש לאימות זהותן של תאי השורות A549 ו-H1299 לפני כל הניסויים הפונקציונליים. בדיקות לזיהוי זיהום במיקופלסמה בוצעו מדי חודש באמצעות ערכה מסחרית לגילוי מיקופלסמה מבוססת PCR, ורק תאים שהיו שליליים למיקופלסמה שימשו לבדיקות ההמשך.
תאים בשלב צמיחה לוגריתמי עם מורפולוגיה תקינה נאספו לצורך טרנספקציה זמנית. נעשה שימוש בריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. בדיקות תאיות המשך בוצעו 50 h לאחר הטרנספקציה.
טרנספקציית תאים
עבור הטרנספקציה, תאים בשלב צמיחה לוגריתמי עם מורפולוגיה תקינה נזרעו בצלחות תרבית 24 שעות מראש כדי להגיע ל-60%–70% התמזגות (confluence). הטרנספקציה בוצעה באמצעות ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. נעשה שימוש בארבע קבוצות ניסוי: בקרת mimic שלילית (mimic-NC), mimic של miR-21-5p, בקרת inhibitor שלילית (inhibitor-NC), ו-inhibitor של miR-21-5p. רצפי הנוקליאוטידים מופיעים ב-קובץ משלים 1.
RNA כולל הוצא 50 h לאחר transfection, ובוצע PCR כמותי עם שעתוק הפוך (qRT-PCR) כדי למדוד את הביטוי היחסי של miR-21-5p ולאמת את יעילות ה-transfection. בדיקות נדידה תאית בוצעו 50 h לאחר ה-transfection. עבור transfection זמני, התאים טופלו ב-miR-21-5p mimic או בביקורת שלילית (mimic-NC) בריכוז סופי של 50 nM, בעוד שה-miR-21-5p inhibitor וביקורת שלילית למעכב (inhibitor-NC) הוחדרו בריכוז של 100 nM. כדי למנוע השפעות מתערבות הנובעות מהבדלים בכמות חומצות הגרעין שהוכנסו, הכמות הכוללת של חומצות הגרעין שעברו transfection נשמרה זהה בכל ארבע קבוצות הטיפול.
שגשוג התאים הוערך באמצעות בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8). תאים שעברו טרנספקציה יציבה נזרעו בלוחות 96-בארים בריכוז של 3 × 103 תאים/באר, כאשר עבור כל קבוצה הוקמו שש חזרות טכניות. 24, 48 ו-72 שעות לאחר הזריעה, הוספו 10 µL של ריאגנט CCK-8 לכל באר, ולאחר מכן בוצעה אינקובציה ב-37 °C למשך 2 שעות. שגשוג התאים נמדד על ידי מדידת הבליעה ב-450 nm באמצעות קורא לוחות מיקרופלט.
כל ניסויי התעתוק הזמני (transient transfection), ה-CCK-8 והנדידה בוצעו עם לא פחות משלוש חזרות ביולוגיות עצמאיות, וכל חזרה ביולוגית כללה 3–6 חזרות טכניות כפי שתואר לעיל.
PCR עם שעתוק הפוך כמותי
RNA כולל מתאי NSCLC וממרקמות גידול קליניות ומרקמות נורמליות סמוכות להן בודד באמצעות ריאגנט להפקת RNA מבוסס פנול/גואנידין (ראו טבלת חומרים). טוהר וריכוז ה-RNA נקבעו באמצעות ספקטרופוטומטריה של ultraviolet; רק דגימות עם יחסי צפיפות אופטית (OD) 260/280 ו-OD 260/230 של 1.8–2.1 עברו שעתוק הפוך. רצפי הפריימרים מופיעים ב-קובץ משלים 1. מערכת השעתוק ההפוך הכילה 500 ng של RNA כולל, 2 µL של בופר לשעתוק הפוך, 1 µL של תערובת dNTP, 0.5 µL של reverse transcriptase, 1 µL של פריימר stem-loop ספציפי עבור miRNA או פריימר oligo(dT) עבור mRNA, ומים נקיים מ-RNase עד לנפח כולל של 20 µL. מערכת ההגברה של ה-qRT-PCR (נפח כולל של 20 µL) כללה 10 µL של SYBR Green qPCR master mix, 0.4 µL של פריימר קדמי (10 µM), 0.4 µL של פריימר אחורי (10 µM), 2 µL של תבנית cDNA מדוללת, ו-7.2 µL של מים נקיים מ-RNase.
RNA שליח עבור CADM1 ו- GAPDH עבר תעתוק הפוך באמצעות ערכה לתעתוק הפוך, בעוד ש-miR-21-5p עבר תעתוק הפוך באמצעות פריימרים מסוג לולאה-גבע (stem-loop) ו-cel-miR-39 אקסוגני כבקרת spike-in. cel-miR-39 אקסוגני הוסף לכל דגימת RNA מיד לאחר בידוד ה-RNA הכולל ולפני התעתוק ההפוך. כמרכיב סינתטי C. elegans cel-miR-39, microRNA ללא רצף הומולוגי בתמלילים אנושיים, יכול לתקן את הסטייה הנגרמת מיעילות שונה של מיצוי RNA, אובדן עקב פירוק RNA ושינויים ביעילות השעתוק ההפוך בין דגימות רקמה קליניות שונות, ובכך לשמש כבקר נורמליזציה אוניברסלי חיצוני לכמות miRNA. ביצוע qRT-PCR בוצע באמצעות תערובת מאסטר המבוססת על צבע DNA פלואורסצנטי נקשב במערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלת חומרים): 95 °C במשך 3 דקות, ולאחריהם 40 מחזורים ב- 95 °C למשך 10 שניות, 60 °C במשך 30 שניות, ו- 72 °C במשך 20 שניות, עם אנליזה של עקומת התכה (melting-curve analysis) כדי לאשר הגברה ספציפית. לכל דגימה היו שלוש חזרות ביולוגיות עם שלוש חזרות טכניות לכל אחת, והביטוי היחסי חושב באמצעות שיטת ה-2⁻ΔΔCt שיטה. רצפי פריימרים מלאים עבור CRP (חלבון C ראקטיבי), TNF-αו- IL-6 הגברה של mRNA מפורטת ב- קובץ משלים 1 לצד CADM1, GAPDH, ורצפי הפריימרים של miR-21-5p.
הקמה של ביטוי יציב של miR-21-5p בתיווך לנטי-ויראלי
וקטורים לנטי-ויראליים מסחריים LV-miR-21-5p ובקרת LV-NC ריקה נארזו בתאי 293T. רצף המקדימה (precursor) של miR-21-5p הוכנס לתוך שלד לנטי-ויראלי הנושא גנים לעמידות לפומיקומין ולדיווח GFP. על-נוזלים לנטי-ויראליים נאספו 48 שעות ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה, רוכזו וטוהרו לצורך הדבקת תאים.
תאי A549 ותאי H1299 נזרעו 24 שעות לפני ההדבקה כדי להגיע ל-50–60% התלכדות (confluence). התאים הודבקו ב-MOI = 10 (עבור A549) וב-MOI = 15 (עבור H1299) עם 5 µg/mL polybrene לשיפור יעילות הטרנספקציה. המצע הוחלף 24 שעות לאחר ההדבקה, והתאים תורגלו למשך 48 שעות נוספות לפני מיון באמצעות puromycin.
בדיקה לבחירת תאים יציבים בוצעה עם 5 µg/mL puromycin למשך 10 ימים רצופים; תאי ביקורת שאינם מזוהמים שימשו כדי לוודא סילוק מלא של תאים שאינם עברו טרנסדוקציה בתוך 7 ימים. שיבובים בודדים חיוביים ל-GFP בודדו והורחבו כדי להפיק את קווי התאים המונוקלונליים היציבים LV-21 ו-LV-NC.
עבור בדיקות הצלה (rescue assays) של CADM1, הוכנו לנטי-וירוסים מסחריים לביטוי יתר של LV-CADM1 ולהשתקה של sh-CADM1. הוקמו ארבע קבוצות ניסוי: LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1, וקבוצת הצלה של LV-miR-21-5p + LV-CADM1. הדבקה בלנטי-וירוסים של CADM1 בוצעה באותו MOI ובתנאי סינון של puromycin כפי שבוצע עבור וקטורי miR-21-5p. כל ניסויי השגשוג והנדידה של ההצלה חזרו בשלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות.
תיקוף של ביטוי יתר יציב של miR-21-5p
RNA כולל הוצא מהשיקולים של שיבוטי תאים יציבים מסוג LV-21 ו-LV-NC. בוצע qRT-PCR כדי לזהות את רמת הביטוי היחסית של hsa-miR-21-5p תוך שימוש ב-cel-miR-39 כרפרנס חיצוני. שיבוטי תאים עם עלייה של פי 8 ומעלה בביטוי של miR-21-5p ביחס לקבוצת ה-LV-NC נשמרו לכל הבדיקות התפקודיות העוקבות, מה שאישר את הבנייה המוצלחת של שורות תאים עם ביטוי יתר יציב של miR-21-5p.
בדיקת נשוא לוקידאזה כפולה (Dual-luciferase reporter assay)
הוכנו פלסמיד נשוא ל-3'-UTR של CADM1 מסוג פראי (WT-CADM1) המכיל את רצף הקישור החזוי של miR-21-5p, ופלסמיד נשוא ל-3'-UTR של CADM1 מוטנטי (MUT-CADM1) עם אזור זרע (seed region) של קישור מוטנטי. תאי A549 נזרעו בלוחות בעלי 24 בארות 24 שעות לפני הטרנספקציה כדי להגיע ל-60%–70% התמזגות (confluence). לכל בארה בוצע טרנספקציה משולבת (co-transfection) של 500 ng של פלסמיד הנשוא WT/MUT, 50 nM של miR-21-5p mimic או mimic-NC, ופלסמיד ייחוס פנימי של Renilla luciferase ביחס מסות קבוע. לאחר דגירה של 48 שעות לאחר הטרנספקציה, התאים עברו ליזיס מלא, ואותי הלומנסנס של לוקידאזה מסוג firefly ו-Renilla גולו באופן רצופי באמצעות ערכה לגילוי לוקידאזה כפולה. הפעילות היחסית של הלוקידאזה חושבה כיחס בין ערך הלומנסנס של firefly לערך הלומנסנס של Renilla. כל קבוצת ניסוי כללה שלושה שחזורים ביולוגיים עצמאיים, עם שלושה שחזורים טכניים לכל שחזור ביולוגי, ובדיקת t-test לדגימות עצמאיות עם שתי קבוצות שימשה להשוואה סטטיסטית של הפעילות היחסית של הלוקידאזה בין קבוצות ה-mimic-NC ל-miR-21-5p mimic.
בדיקת נדידה בשיטת Transwell
עבור בדיקת הנדידה בשיטת Transwell, תאים שעברו טרנספקציה יציבה הושעו במצע ללא סרום והוחדרו למאגרי המבחנה העליונים בריכוז של 4 × 104 תאים לבאר. התאים התחתונים מולאו במצע גידול מלא בתוספת 10% FBS כדי ליצור מדרג כימוטקטי. לאחר דגירה של 48 h בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂, הוסרו בזהירות התאים שנותרו על פני השטח העליון של הממברנה. תאים שנדדו לצד התחתון של הממברנה קובעו במתנול ונצבעו ב-crystal violet. הנדידה כומתה על ידי ספירת תאים בחמישה שדות מיקרוסקופיים שנבחרו באופן אקראי לכל מאגר. כל ניסוי בוצע באמצעות שלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, כאשר לכל חזרה ביולוגית נספו שלוש חזרות טכניות.
ניתוחים סטטיסטיים
כל ניסויי ה-in vitro נערכו עם לפחות שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, כאשר כל אחת מהן לווה בחזרות טכניות תואמות. התפלגות הנתונים הוערכה תחילה באמצעות מבחן נורמליות של Shapiro-Wilk כדי להנחות את הניתוח הסטטיסטי. להשוואות מזווגות בין גידולי גידול לרקמות נורמליות סמוכות, הוחל מבחן t מזווג או מבחן הדרגות המחתומות של Wilcoxon מזווג, בהתאם להתפלגות הנתונים. השוואות בין שתי קבוצות בלתי תלויות נותחו באמצעות מבחן t בלתי תלוי או מבחן Mann-Whitney U. הבדלים בין מספר קבוצות, כולל ניסויי הצלה (rescue), הוערכו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחריו תיקון post hoc של Bonferroni, בעוד ש-ANOVA למדידות חוזרות שימש לניתוח מערכי נתונים לאורכיים, כגון בדיקות השכפול של CCK-8 ובדיקות ריפוי פצעים. קשרים בין משתנים קליניים קטגוריאליים נבחנו באמצעות מבחן χ2, והקשר בין ביטוי miR-21-5p לבין CADM1 הוערך באמצעות ניתוח מתאם של פירסון. הישרדות מטופלים נותחה באמצעות עקומות Kaplan-Meier עם השוואות שבוצעו באמצעות מבחן log-rank. גורמים פרוגנוסטיים בלתי תלויים זוהו באמצעות ניתוחי רגרסיה של סיכוני קוקס (Cox proportional hazards regression) חד-משתניים ורב-משתניים. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-P < 0.05. רגרסיית קוקס רב-משתנית הותאמה לגיל, מין, סוג היסטולוגי, רמת miR-21-5p ומצב קשרי לימפה (נקודת ייחוס: גיל ≤ 60, נקבה, קרצינומה סקוואמוזית, miR-21-5p נמוך, ללא מעורבות קשרי לימפה); שאריות Schoenfeld שימשו לבדיקת הנחת הסיכונים הפרופורציונליים, ומשתנים עם P < 0.10 בניתוח חד-משתני נכללו באמצעות בחירת enter.
תוצאות
מתאם בין ביטוי miR-21-5p למאפיינים קליניקו-פתולוגיים של חולי NSCLC
סך של 157 דגימות גידול של NSCLC חולקו לקבוצות של ביטוי נמוך של miR-21-5p (n = 61) וביטוי גבוה (n = 96) על בסיס רמות החציון של miR-21-5p, ואנליזות chi-square העלו כי אין מתאמים מובהקים בין ביטוי miR-21-5p לגיל המטופל (χ2 = 1.36, P = 0.2435), מין (χ2 = 1.06, P = 0.3032), סוג היסטולוגי (χ2 = 1.09, P = 0.2965) או גודל הגידול (χ2 = 5.623, P = 0.0601), בעוד שביטוי גבוה של miR-21-5p היה קשור באופן מובהק לדרגת גידול מתקדמת (χ2 = 16.25, P = 0.00006), גרורות חיוביות בקשרי לימפה (χ2 = 12.17, P = 0.00049) ושלב T גבוה יותר (χ2 = 4.30, P = 0.117), מה שמעיד על כך ש-miR-21-5p מפעיל השפעות אונקוגניות המקבלות את התקדמות ה-NSCLC (Table 1).
ניתוח רגרסיה של מודל הסיכונים היחסיים של קוקס (Cox proportional hazards regression) רב-משתני לגורמים פרוגנוסטיים בלתי תלויים של NSCLC
ניתוח רגרסיה רב-משתני של קוקס, שכלל גיל, מין, סוג היסטולוגי, ביטוי של miR-21-5p וגרורות בקשרי לימפה, העלה כי ביטוי גבוה של miR-21-5p (יחס סיכון [HR] = 3.066; רווח בר-סמך [CI] של 95%: 1.412–6.659; P = 0.005) וגרורות חיוביות בקשרי לימפה (HR = 22.295; 95% CI: 3.039–163.588; P = 0.002) היוו גורמי סיכון פרוגנוסטיים בלתי תלויים ושליליים להישרדות כוללת נמוכה של חולי NSCLC, בעוד שגיל המטופל, מינו וסוג היסטולוגי לא הפעילו השפעות פרוגנוסטיות בלתי תלויות מובהקות (כל ה-P > 0.05) (Table 2).
מאפייני הביטוי הקליני של miR-21-5p והמתאם שלו עם CADM1 וגורמים דלקתיים
בדיקת qRT-PCR של גידולים מזווגים של NSCLC ורקמות נורמליות סמוכות הראתה רמות יחסיות גבוהות משמעותית של miR-21-5p ברקמות הסרטניות בהשוואה לביקרים נורמליים (איור 1A, P < 0.001). עקומות הישרדות של קפלן-מייר (Kaplan-Meier) הראו כי למטופלים עם ביטוי גבוה של miR-21-5p הייתה הישרדות כוללת גרועה באופן משמעותי מזו של מטופלים עם ביטוי נמוך של miR-21-5p (איור 1B, P = 0.0027). רמות ה-mRNA של המתווכים הדלקתיים C-reactive protein (CRP), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), ו-interleukin-6 (IL-6) היו כולן מוגברות באופן ניכר בדגימות NSCLC (איור 1C, P < 0.01, P < (0.001). ניתוח מתאם פירסון (Pearson correlation) חשף מתאם שלילי מובהק מאוד בין miR-21-5p לבין CADM1 ביטוי mRNA בדגימות קליניות (r = -0.7773, 95% CI: -0.8325 עד -0.7076, P < 0.0001, איור 1D).
תיקוף תפקודי תאי של miR-21-5p בתאי NSCLC
בדיקת qRT-PCR אישרה יעילות טרנספקציה מוצלחת של miR-21-5p mimic בתאי A549 ו-H1299 (איור 2A). בדיקות Transwell הראו כי ביטוי יתר של miR-21-5p הגביר באופן משמעותי את יכולת ההגירה היחסית ואת מספר התאים המהגרים בשני קווי התאים (איור 2B,C). זיהוי של ציטוקינים דלקתיים באמצעות qRT-PCR חשף רמות mRNA מוגברות בולטות של CRP, TNF-α, ו-IL-6 לאחר טרנספקציה של miR-21-5p mimic, בעוד שטיפול במעכב (inhibitor) של miR-21-5p הפך את העלייה זו (איור 2D). ניסויי הצלה (Rescue experiments) אישרו כי miR-21-5p mimic דיכא באופן דרסטי את השעתקת CADM1, וכי טרנספקציה משולבת של LV-CADM1 השקמה באופן מלא את ביטוי ה-mRNA של CADM1 בתאי A549 ו-H1299 (איור 2E,F). יחד, נתונים תאיים אלו הדגימו כי miR-21-5p מקדם הגירה של תאי NSCLC ותגובה דלקתית באמצעות דיכוי של CADM1.
השפעות של miR-21-5p על שגשוג תאי NSCLC
עקומות שגשוג CCK-8 ב-24 h, 48 h ו-72 h הראו כי טרנספקציית mimic של miR-21-5p העלתה באופן ניכר את ערכי ה-OD ב-450 nm הן בתאי A549 והן בתאי H1299, בעוד שמעכב (inhibitor) של miR-21-5p דיכא באופן משמעותי את חיוניות התאים, כאשר הבדלים מובהקים סטטיסטית נצפו ב-72 h (איור 3A,B; P < 0.001). נתונים אלו הוכירו כי miR-21-5p מפעיל השפעה מעודדת שגשוג על תאי NSCLC.
תיקוף של CADM1 כמטרה ישירה של miR-21-5p באמצעות חיזוי ביו-אינפורמטי וניסוי נשאי לוסיפראז כפול (dual-luciferase reporter assay)
שלושה מאגרי נתונים מקוונים לחיזוי מטרות של miRNA (miRWalk, StarBase, TargetScan) נחפפו כדי לסנן גנים מועמדים במורד הזרם של miR-21-5p, והתקבלו 95 גני מטרה חופפים (איור 4Aניתוח העשרה של אונטולוגיית גנים (GO) העיד כי גנים מועמדים אלו היו מועשרים בעיקר בתהליכים ביולוגיים, רכיבים תאיים ותפקודי מולקולריים הקשורים למטבוליזם של תאים, תגובה למעקה (stress response) ובקרה על תעתוק (איור 4B). העשרה של נתיבים באמצעות מאגר Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) חשפה עוד העשרה בולטת של רשראות סיגנלינג הקשורות לגידולים, כולל נתיבי Ras ו-mitogen-activated protein kinase (MAPK) (איור 4C). בדיקת דואל-לוציפראז (Dual-luciferase reporter assay) הדגימה כי מימיק (mimic) של miR-21-5p דיכא באופן משמעותי את פעילות הלוציפראז היחסית של הטיפוס הפראי (wild-type) CADM1 מדד (reporter) של '3-UTR, בעוד שלא נצפתה השפעה מעכבת במוטנט CADM1 קבוצת ה-3'-UTR (איור 4D, P < 0.01, ns: לא מובהק), מה שמאשר את הקישור הישיר בין miR-21-5p ל- CADM1.
קידום פנוטיפים ממאירים של NSCLC באמצעות דיכוי של CADM1 בניסויי הצלה
בדיקת qRT-PCR איששה את יעילות הטרנספקציה של מימיק ומעכב של miR-21-5p בתאי A549 ו-H1299 (איור 5A). ביטוי יתר של CADM1 (LV-CADM1) הפחית את רמות ה-mRNA של הגורמים הפרו-דלקתיים CRP, TNF-α ו-IL-6, בעוד ששקיטת CADM1 באמצעות RNA מפריע קטן (si-CADM1) העלתה באופן ניכר את ביטוים (איור 5B). בדיקות נדידה ב-Transwell הראו כי טרנספקציית LV-CADM1 דיכאה באופן משמעותי את יכולת הנדידה של שתי השורות התאיות של NSCLC (איור 5C,D). זיהוי proliferacion באמצעות CCK-8 הדגים עוד כי ההשפעה הפרו-פרוליפרטיבית המתווכת על ידי LV-21 קוזזה במלואה על ידי טרנספקציה משולבת של LV-CADM1, בעוד שהאצה של צמיחת תאים שנתוכה על ידי si-CADM1 הוחזרה למצב תקין על ידי מעכב miR-21-5p (איור 5E,F). יחד, נתוני הצלה אלו תיקפו כי CADM1 פועל כמתווך תפקודי במורך הזרם האחראי לפרוליפרציה, נדידה והפעלה דלקתית המגורות על ידי miR-21-5p ב-NSCLC.
זמינות נתונים:
הנתונים המקוריים התומכים בממצאי מחקר זה מסופקים ב- קובץ משלים 2 וזמינים יחד עם המאמר שפורסם.
איור 1: פרופילי ביטוי של miR-21-5p, גורמים דלקתיים, והמתאם שלהם עם CADM1 בדגימות קליניות של NSCLC. (A) ביטוי יחסי של miR-21-5p ברקמות ריאה נורמליות וברקמות גידול של NSCLC. (B) עקומות הישרדות כללית של קפלן-מייר (Kaplan-Meier) עבור חולי NSCLC בחלוקה לפי רמת ביטוי של miR-21-5p. (C) ביטוי mRNA יחסי של הגורמים הדלקתיים CRP, TNF-α, ו-IL-6 ברקמות נורמליות וב-NSCLC. (D) תרשים פיזור של מתאם פירסון המראה מתאם ליניארי שלילי בין ביטוי miR-21-5p לביטוי mRNA של CADM1. **P < 0.01, ***P < 0.001. עבור פאנל C: השוואות סטטיסטיות בוצעו בין רקמות גידול מצומדות לרקמות נורמליות סמוכות עבור CRP, TNF-α, ו-IL-6, בהתאמה; **P < 0.01, ***P < 0.001 מציינים הבדלים מובהקים לעומת רקמות ריאה נורמליות תואמות. כל הפאנלים כוללים ≥3 חזרות ביולוגיות עצמאיות; נתוני qRT-PCR מציגים ממוצע ± סטיית תקן; למשם השוואה בין קבוצות נעשה שימוש במבחן t מצומד; לניתוח מתאם בתרשים הפיזור נעשה שימוש במבחן פירסון. קיצורים: CADM1 = cell adhesion molecule 1; CI = confidence interval; CRP = C-reactive protein; IL-6 = interleukin-6; NSCLC = non-small cell lung cancer; TNF-α = tumor necrosis factor alpha. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2פנוטיפים תאיים ו- CADM1 ביטוי המפוקח על ידי miR-21-5p בתאי NSCLC מסוג A549 ו-H1299. (A) גילוי ביטוי של miR-21-5p באמצעות qRT-PCR לאחר טרנספקציית mimic. (B(כימות סטטיסטי של נדידת תאים יחסית מבדיקות Transwell)C) כימות מספר התאים הנודדים לכל שדה מיקרוסקופי. (ד׳) ביטוי mRNA יחסי של CRP (חלבון מגיב C), TNF-αו- IL-6 תחת ביטוי יתר או עיכוב של miR-21-5p. (ה_(יחסי CADM1 ביטוי mRNA בקבוצות ההצלה של A549 (NC, miR-21-5p mimic, LV-CADM1, mimic+LV-CADM1). (פיחסי CADM1 ביטוי mRNA בקבוצות ההצלה של H1299. **P < 0.01, ***P < 0.001. כל הבדיקות התאיות חזרו בשלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, עם שלוש חזרות טכניות לכל אחת; פסי השגיאה מייצגים ממוצע ± SD; להשוואות בין-קבוצתיות נעשה שימוש במבחן ANOVA חד-כיווני עם תיקון בונפרוני; תוויות הקבוצות תואמות במדויק את קבוצות הטרנספקציה המתוארות בשיטות. קיצורים: CADM1 CAM = מולקולת היצמדות תאים 1; CRP = חלבון C ראקטיבי; IL-6 = אינטרלוקין-6; LV = וקטור לנטי-ויראלי; NC = ביקורת שלילית; NSCLC = סרטן ריאה מסוג שאינו תאי סרטנים קטנים; qRT-PCR = תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי; TNF-α = גורם נמק גידולי אלפא. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: עקומות proliferaton של CCK-8 המשקפות את חיוניות התאים לאחר ביטוי יתר או השתקה של miR-21-5p. (A) עקומות בליעה של OD₄₅₀ תלויות זמן של תאי A549 שעברו טרנספקציה עם mimic-NC, miR-21-5p mimic, inhibitor-NC, או miR-21-5p inhibitor. (B) עקומות בליעה של OD₄₅₀ תלויות זמן של תאי H1299 תחת ארבע קבוצות הטרנספקציה. ***P < 0.001. בדיקות CCK-8 הכילו שש חזרות טכניות לכל קבוצה על פני 3 חזרות ביולוגיות; הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; נעשה שימוש ב-ANOVA למדידות חוזרות להשוואות בין נקודות זמן. קיצורים: CCK-8 = Cell Counting Kit-8; NC = בקרה שלילית; OD = צפיפות אופטית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סריקה ביו-אינפורמטית ובדיקת לוסיפרז כפולה עבור הגן מטרה של miR-21-5p, הגן CADM1. (A) דיאגרמת ונ הממחישה את הגנים מטרה המשותפים של miR-21-5p שזוהו באמצעות מאגרי הניבוי miRWalk, StarBase ו-TargetScan. (B) תרשים בועות של ניתוח העשרה פונקציונלית של GO עבור הגנים מטרה החופפים. (C) תרשים עמודות של מסלולי השיגנול המובילים המועשרים ב-KEGG. (D) פעילות רפורטר לוסיפרז כפולה של 3'-UTR של CADM1 מסוג פראי (wild-type) ומוטנטי לאחר ביטוי יתר של miR-21-5p. **P < 0.01; ns, ללא מובהקות. פאנל D כולל בלבד טרנספקציה משותפת של WT-CADM1 3'-UTR ו-MUT-CADM1 3'-UTR עם miR-21-5p mimic/mimic-NC לזיהוי לוסיפרז כפול; התוויות Control/overexpression/interference שהופיעו בטיוטות הגרפים הגולמיות הותאמו לקבוצות WT/MUT סטנדרטיות באיורים הסופיים. ניתוח ניבוי המטרות השתמש בשלושה מאגרי נתונים מקוונים; ערכי P של העשרה הותאמו באמצעות תיקון Benjamini-Hochberg FDR; לניסויי לוסיפרז הכפול היו שלושה שחזורים ביולוגיים (שלושה שחזורים טכניים לכל אחד); פסי השגיאה מייצגים mean ± SD; מבחן t לשתי קבוצות להשוואה סטטיסטית. קיצורים: CADM1 = cell adhesion molecule 1; GO = Gene Ontology; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MUT = מוטנטי; NC = ביקורת שלילית; ns = לא מובהק; UTR = אזור לא מתורגם; WT = סוג פראי. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניסויי הצלה תפקודיים המאמתים את ציר הבקרה miR-21-5p/CADM1 בתאי A549 ו-H1299. (A) ביטוי יחסי של miR-21-5p לאחר טרנספקציה של mimic או inhibitor. (B) ביטוי mRNA יחסי של CRP, TNF-α, ו-IL-6 בקבוצות LV-CADM1 ו-si-CADM1. (C) כימות סטטיסטי של יכולת נדידה יחסית תחת ביטוי יתר של CADM1. (D) כימות מספר התאים שנדדו לכל שדה מיקרוסקופי בקבוצות LV-CADM1 . (E) ערכי CCK-8 OD₄₅₀ של קבוצות ההצלה של A549 (LV-NC, LV-21, LV-CADM1, LV-21+LV-CADM1, si-NC, si-CADM1, si-CADM1+miR-21 inhibitor). (F) ערכי CCK-8 OD₄₅₀ של קבוצות ההצלה של H1299 עם טיפולי טרנספקציה זהים. **P < 0.01, ***P < 0.001. כל בדיקות ההצלה כללו שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות; פסי השגיאה מציינים ממוצע ± SD, מבחן one-way ANOVA עם מבחן Bonferroni post-hoc להשוואות בין קבוצות מרובות. קיצורים: CADM1 = cell adhesion molecule 1; CRP = C-reactive protein; IL-6 = interleukin-6; LV = lentiviral vector; NC = negative control; OD = optical density; qRT-PCR = quantitative reverse-transcription PCR; si = small interfering RNA; TNF-α = tumor necrosis factor alpha. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ביטוי miR-21-5p | סה"כ | x2 | ערך P | |||
| נמוך | גבוה | |||||
| גיל (שנים) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1.357 | 0.244 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| סה"כ | 61 | 96 | 157 | |||
| מין | זכר | 42 | 73 | 115 | 1.06 | 0.3032 |
| נקבה | 19 | 23 | 42 | |||
| סה"כ | 61 | 96 | 157 | |||
| סוג היסטולוגי | קרצינומה של תאי קשקש | 31 | 41 | 72 | 1.09 | 0.2965 |
| אדנוקרצינומה | 30 | 55 | 85 | |||
| סה"כ | 61 | 96 | 157 | |||
| דרגת גידול | Ⅰ-Ⅱ | 55 | 58 | 113 | 16.25 | 0.00006 |
| Ⅲ | 6 | 38 | 44 | |||
| סה"כ | 61 | 96 | 157 | |||
| גרורות בקשרי לימפה | שלילי | 41 | 37 | 78 | 12.17 | 0.00049 |
| חיובי | 20 | 59 | 79 | |||
| סה"כ | 61 | 96 | 157 | |||
| גודל הגידול(cm) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5.623 | 0.0601 |
| 3-7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 11 | 12 | |||
| סה"כ | 61 | 96 | 157 | |||
| שלב T | T1 | 15 | 17 | 32 | 4.295 | 0.117 |
| T2 | 36 | 52 | 88 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| סה"כ | 61 | 96 | 157 | |||
טבלה 1: קשר בין ביטוי של miR-21-5p למאפיינים קליניק פתולוגיים בחולים עם סרטן ריאותה לא תאיים קטנים. הערכים הם מספר החולים. קשרים הוערכו באמצעות מבחן χ2. קיצור: NSCLC = סרטן ריאות לא תאיים קטנים. כל מבחן χ2 בוצע עבור משתנים קליניק פתולוגיים קטגוריאליים, וכל הניתוחים התבססו על מלאי של 157 דגימות חולים.
| n | P value | סיכון יחסי | רווח בר-סמך של 95% | |||
| גבול תחתון | גבול עליון | |||||
| גיל (שנים) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| מין | זכר | 115 | 0.339 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| נקבה | 42 | |||||
| סוג היסטולוגי | קרצינומה של תאי קשקש | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| אדנוקרצינומה | 85 | |||||
| ביטוי של miR-21-5p | גבוה | 96 | 0.005 | 3.066 | 1.412 | 6.659 |
| נמוך | 61 | |||||
| גרורות בבלטות לימפה | שלילי | 78 | 0.002 | 22.295 | 3.039 | 163.588 |
| חיובי | 79 | |||||
טבלה 2: ניתוח רב-משתני של מודל סיכונים יחסיים של Cox להישרדות כללית בחולים עם סרטן ריאה מסוג שאינו תאי קטנים. הערכים הם יחסי סיכון עם רווחי סמך של 95%. קיצורים: CI = רווח סמך; NSCLC = סרטן ריאה מסוג שאינו תאי קטנים. רגרסיית Cox רב-משתנית בוצעה על נתוני עוקבה קלינית מלאים, ו-HR ו-95% CI חושבו לצורך סריקה פרוגנוסטית עצמאית.
קובץ משלים 1: רצפי an oligonucleotides ופריימרים ששימשו לטרנספקציה ול-quantitative reverse-transcription PCR. הקובץ מפרט את ה-mimic וה-inhibitor של miR-21-5p, את הביקורות השליליות שלהם, ופריימרים עבור CADM1, GAPDH, hsa-miR-21-5p, ו-cel-miR-39. כל הרצפים מוצגים בכיוון 5′–3′. קיצורים: CADM1 = cell adhesion molecule 1; cel = Caenorhabditis elegans; GAPDH = glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; hsa = Homo sapiens; miR = microRNA; PCR = polymerase chain reaction. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.
קובץ משלים 2. נתוני מקור התומכים באיורים. קובץ זה מכיל את מערכי הנתונים הבסיסיים והניתוחים הסטטיסטיים ששימשו להפקת האיורים המוצגים במאמר, כולל המאפיינים הקליניים, ניתוחי הביטוי, נתוני הישרדות ותוצאות סטטיסטיות נלוות. נתוני מקור אלה תומכים בממצאים המדווחים בטקסט הראשי. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
מחקר זה אישר באופן שיטתי ביטוי מוגבר של miR-21-5p ברקמות קליניות של NSCLC, אשר נמצא במתאם עם שעתוק מוגבר של גורמים דלקתיים, ויכולת נדידה ושגשוג תאי גבוהה יותר; במקביל, ניסויי dual-luciferase, qRT-PCR וניסויי הצלה (rescue) זיהו את CADM1 כמטרה התפקודית הישירה שלו. חיזויים ביו-אינפורמטיים הצביעו עוד על כך שמטרות השלב הבא (downstream) של miR-21-5p הועשרו במסלולי האונקוגנים של MAPK ו-Ras, ובכך סיפקו ראיות ראשוניות לכך שציר ה-miR-21-5p/CADM1 עשוי להיות מעורב במסלולי איתות הקשורים להתקדמות ממאירה של הגידול.
ניתוח קוהורט קליני גילה כי ביטוי גבוה של miR-21-5p קשור קשר הדוק לדרגת גידול מתקדמת, גרורות בקשרי לימפה והישרדות כוללת קצרה יותר. רגרסיית Cox רב-משתנית אישרה כי miR-21-5p מהווה גורם פרוגנוסטי שלילי עצמאי, מה שמרמז כי miR-21-5p עשוי לשמש כביומארקר פוטנציאלי להערכת סיכון להתקדמות ותוצאות הישרדות של חולי NSCLC.
In vitro functional assays הראו כי ביטוי יתר של miR-21-5p קידם את השגשוג, הנדידה והתגובה הדלקתית של תאי NSCLC, בעוד שביטוי מוגבר של CADM1 הפך את כל הפנוטיפים האונקוגניים הללו; מתאם ביטוי שלילי בין miR-21-5p ל- CADM1 בדגימות מטופלים, יחד עם נתוני הצלה תאיים, הבהירו באופן מלא את המנגנון הרגולטורי שבו miR-21-5p מניע התנהגויות ממאירות של NSCLC באמצעות עיכוב ישיר של CADM1.
בהתאמה למחקרים קודמים שדיווחו על תפקידו האונקוגני של miR-21-5p בקרצינומה של הריאה, עבודה זו מוסיפה נתוני קורלציה קלינית שלמים ותיקוף הצלה (rescue validation) מלא כדי לבסס את תפקודו כמקדם גידולים; בניגוד למחקרים קיימים, המתמקדים אך ורק בפנוטיפ גרורה בודד, המחקר הנוכחי מקשר בו-זמנית בין miR-21-5p לבין שגשוג תאים וסביבה מיקרובית דלקתית של הגידול באמצעות המטרה CADM1, ובכך מרחיב את רשת הבקרה של miR-21-5p ב-NSCLC.
על בסיס הראיות המקדמיות לעיל, לגילוי ביטוי של miR-21-5p ברקמה עשוי להיות ערך עזר עבור סיווג סיכונים והערכה פרוגנוסטית של NSCLC, וייתכן שציר ה-miR-21-5p/CADM1 יספק מטרות מולקולריות מועמדות חדשות לפיתוח אסטרטגיות התערבות למניעת התקדמות של NSCLC, אם כי יעילותו הטיפולית הקלינית טרם אומתה.
למחקר זה מספר מגבלות. נעשה בו שימוש במבחני תאים in vitro ובקוהורט קליני רטרוספקטיבי יחיד, ללא תיקוף באמצעות קסנוגרפט in vivo או קוהורט חיצוני עצמאי. לא בוצעו מבחני פרוליפרציה נוספים (למשל, מבחני EdU ויצירת מושבות), מבחני פלישה, אפופטוזיס ומחזור התא. כמו כן, לא בוצעו בדיקות דם פריפריאלי להערכת פוטנציאל אבחוני לא פולשני, תיקוף של רמות החלבון CADM1, ניתוח של רשימת הגנים-מטרה החופפת המלאה וניתוח מערכתי של רשת אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI). עבודות עתידיות צריכות להתייחס למגבלות אלו ולבחון לעומק רגולטורים שמעלה (upstream) של miR-21-5p ואת השליח (signaling) של CADM1 במורד (downstream).
בסך הכל, עבודה זו מספקת ראיות ראשוניות לכך ש-miR-21-5p פועל כ-microRNA אונקוגני, המאיץ את השגשוג, הנדידה והדלקת של NSCLC על ידי targeting ישיר של CADM1, וביטויו הגבוה מנבא הישרדות בלתי מיטבית של החולה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים כספיים או בלתי כספיים רלוונטיים להצהרה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פורמלין ניטרלי בבופר בריכוז 10% | Fisher Scientific (Fisherbrand™) | SF100-4 (טיפוסי) | מקבע רקמות; רקמות שנחתכו ל- &עובי של פחות מ-5 מ"מ, קיבוע בטמפרטורת החדר למשך 14–26 שעות |
| פלטת תרביות תאים בעלת 24 בארות | Corning | 3526 | פיתח לזריעת תאים שעברו טרנספקציה ולביצוע בדיקת ריפוי פצעים (שריטה) |
| קו תאי A549 | ATCC (או מרכז המשאבים של שנחאי) | CCL-185 | קו תאים של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) באדם (אדנוקרצינומה) |
| ערכה לבדיקת CCK-8 | Dojindo | CK04 | גילוי שגשוג (פרוליפרציה) |
| מצע לתרבית תאים (לא צוין) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | שונים (למשל, RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022) | מצע בסיסי עבור שורות תאים של NSCLC; ההרכב המדויק תלוי בשורת התאים שבשימוש |
| cel-miR-39 (בקרת Spike-in חיצונית) | GenePharma (שנגחאי, סין) | מותאם אישית (למשל, B010302) | רפרנס חיצוני לנורמליזציה של ביטוי miRNA, שנוסף במהלך בידוד ה-RNA |
| CO2 אינקובטור (מלביב/בעל לחות) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (50116047) | מספק 37°C, 5% CO22ולחות רוויה לתרביות תאים |
| CRP/TNF-αזוגי פריימרים ל-IL-6 | Sangon Biotech | סינתזה מותאמת אישית | רצפים מלאים בקובץ המלווה 1 |
| תמיסת צביעה בקריסטל ויולט | Solarbio | G1062 | צביעת תאים נודדים |
| מצע DMEM | Gibco | 11965092 | עבור תרבית H1299/293T |
| ערכה לבדיקת דאלי-לוסיפראז (Dual-luciferase reporter assay kit) | Promega | E1910 | גילוי 3'UTR של CADM1 מסוג WT/MUT |
| cel-miR-39 אקסוגני | Qiagen | הוספה מותאמת אישית של תוכן פנימי (custom spike-in) | נוסף שלב לאחר בידוד ה-RNA לצורך נורמליזציה |
| סרום עוברי בקר (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | תוסף המומס למצע גידול בריכוז סופי של 10% לתמיכה בצמיחת תאים |
| טיפ פטנט דק לפפיטה (למשל, 10 µL טיפ) | Axygen (Corning) | T-300 | משמש לגרידה ידנית של שכבה אחת של תאים כדי ליצור "פצע" פער |
| GAPDH (בקרה אנדוגנית) | ספקים מרובים (למשל, Sangon Biotech, RiboBio; פריימרים בהתאמה אישית) | מותאם אישית | גן ייחוס לנורמליזציה של mRNA המשמש ב-qRT-PCR |
| GO/KEGG (הערות אנוטציה של clusterProfiler) | Bioconductor | בנייה 2026 | |
| GraphPad Prism | תוכנת GraphPad | v9.5.1 | שרטוט גרפים & סטטיסטיקה in vitro |
| קו תאי H1299 | ATCC (או מרכז המשאבים של שנחאי) | CRL-5803 | קו תאים של סרטן ריאה מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) באדם, שנגזר מגרורה בבלוטת לימפה |
| FBS שעבר אינאקטיבציה בחום | Gibco | 10099141 | ריכוז עבודה של 10% |
| קו תאי HEK-293T | ATCC | CRL-3216 | RRID:CVCL_0063; בדיקת STR מדי חודש, תוצאות בדיקת זיהוי מיקופלסמה שליליות |
| תערובת אריזה ללנטי-וירוס | Genecopoeia (או Takara Bio) | HPK-LvT-100 (Genecopoeia) | מספק פלסמידי אריזה (gag/pol, rev, vsv-g) לייצור לנטי-וירוס |
| וקטור Lentivirus-21 (LV-21) | GeneChem (שנגחאי, סין) או Genecopoeia | מותאם אישית | וקטור לנטי-ויראלי המכיל miR-21-5p ליצירת שורות תאים בעלות ביטוי יציב |
| וקטור Lentivirus-NC (LV-NC) | GeneChem (שנגחאי, סין) או Genecopoeia | מותאם אישית | וקטור לנטי-ויראלי של בקרת שלילה ללא השחלה של miR-21-5p |
| ריאגנט טרנספקציה ליפידי | Thermo Fisher | L3000015 | עבור טרנספקציה זמנית |
| סוכן הטרנספקציה Lipofectamine 3000 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 או L3000008 | ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים; 50 שעות לאחר הטרנספקציה עבור ניסויים המשכיים |
| מתנול | Sinopharm | 67-56-1 | קיבוע תאים |
| מתנול (מקבע/מדלל צביעה) | Sigma-Aldrich | 34860 | משמש כחומר מקבע או כמדלל לצביעה ב-crystal violet |
| מעכב miR-21-5p/מעכב-NC | GenePharma | סינתזה מותאמת אישית | רצפים בקובץ המשלים 1 |
| miR-21-5p mimic/mimic-NC | GenePharma | סינתזה מותאמת אישית | רצפים בקובץ המשלימים 1 |
| miRDB | אוניברסיטת וושינגטון | גרסה 6.0 | |
| miRWalk | אוניברסיטת היידלברג | גרסה 3.0 | |
| המרכז הלאומי להנדסת ביופסיה | המרכז הלאומי להנדסת ביופסיות (סין) | לא רלוונטי | ספק מוסדי של דגימות רקמות של סרטן ריאה עם נתונים קליניים רשומים ואבחנה היסטופתולוגית |
| רקמת NSCLC (עבור תרבית ראשונית) | Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | הזמנה מותאמת אישית | מקור הרקמה; תורגדו במצע עם 10% FBS ב- 37°C; תאים בעלי מורפולוגיה טובה בשלב צמיחה לוגריתמי נבחרים לטרנספקציה |
| מכשיר PCR | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 7500 Fast (4406984) | השגת תוצרי הגברה עבור qRT-PCR |
| פניצילין-סטרפטומייצין | Solarbio | P1400 | 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטריפטומייצין |
| פיפטות (בודדות & רב-ערוצי | Eppendorf | סדרת Research Plus | לטיפול מדויק בנוזלים בכל הניסויים |
| פוליברן (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | סופי 5 μg/mL להדבקה בלנטי-וירוס |
| פומסין (Puromycin) | InvivoGen | נמלה-פרוטוקול-1 | 5 μg/mL לסריקת תאי קו יציב |
| פיורומיצין דיהידרוכלוריד | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich) | אנטיביוטיקה לסלקציה, בשימוש בריכוז של 5 μg/mL להקמת שורות תאים שעברו טרנספקציה יציבה |
| R | R Foundation | v4.2.1 | חבילות: clusterProfiler, ggplot2 |
| ערכה לשעתוק הפוך | Takara | RR047 | RT מסוג לולאה-גבעול (Stem-loop) עבור miRNA, oligo(dT) עבור mRNA |
| מבחנות EP נקיות מ-RNase | Axygen (Corning) | MCT-150-C | מבחנות בנפח 1.5 מ"ל נקיות מ-RNase לאחסון ועיבוד RNA |
| מצע RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | עבור תרבית A549 |
| si-CADM1 | GenePharma | סינתזה מותאמת אישית | רצפים בקובץ המשליים 1 |
| si-NC | GenePharma | סינתזה בהתאמה אישית | רצפים בקובץ המשליים 1 |
| SPSS | IBM | גרסה 26.0 | ניתוח רגרסיה קלינית/Cox |
| תערובת מאסטר ל-qPCR עם SYBR Green | Roche | 4913914001 | הגברה באמצעות qRT-PCR |
| TargetScan | MIT | v8.2 | |
| ריאגנט למיצוי RNA כולל | Takara | 9109 | ליסיס מבוסס פנול/גואנידין |
| תא Trans-well | Corning (Costar) | 3422 (24 בארות, 8.0 µm) | עבור טרנספקציית תאים בתוך מצע בטמפרטורת החדר; הוספת פריימרים כימיים ודגירה למשך 48 שעות |
| תאי נדידה מסוג Transwell | Corning | 3422 | 8 μm גודל נקבוביות |
| ריאגנט TRIzol | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | מיצוי RNA כולל מדגימות רקמה; הערכת איכות ה-RNA באמצעות יחסי OD260/280 ו-OD260/230 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | לניתוק תאים מכלי תרבית לפני זריעה בלוחות בעלי 24 בארות |
מקורות
- Bautista-Sánchez D, et al. The promising role of miR-21 as a cancer biomarker and its importance in RNA-based therapeutics. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;20:409-20.
- Zhou J, et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 2024;93:102693.
- Nicholson AG, et al. The 2021 WHO classification of lung tumors: impact of advances since 2015. J Thorac Oncol. 2022;17(3):362-87.
- The Lancet Regional Health – Europe. NSCLC: bridging the gap between clinical progress and real-world application. Lancet Reg Health Eur. 2024;38:100878.
- Reyes J, et al. Oncogenic and tumor-suppressive forces converge on a progenitor niche at the benign-to-malignant transition. Cell. 2026;189(10):2875-97.e53.
- Yu L, Yang R, Long Z, Tao Q, Liu B. Targeted therapy of non-small cell lung cancer: mechanisms and clinical trials. Front Oncol. 2024;14:1451230.
- O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402.
- Treiber T, Treiber N, Meister G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(1):5-20.
- Ohno S, Kuroda M. Exosome-mediated targeted delivery of miRNAs. Methods Mol Biol. 2016;1448:261-70.
- Ell B, Kang Y. MicroRNAs as regulators of bone homeostasis and bone metastasis. Bonekey Rep. 2014;3:549.
- Dedeoğlu BG. High-throughput approaches for microRNA expression analysis. Methods Mol Biol. 2014;1107:91-103.
- Qu K, et al. Circulating miRNA-21-5p as a diagnostic biomarker for pancreatic cancer: evidence from comprehensive miRNA expression profiling analysis and clinical validation. Sci Rep. 2017;7(1):1692.
- Xu H, et al. Engineered exosomes transporting the lncRNA, SVIL-AS1, inhibit the progression of lung cancer via targeting miR-21-5p. Am J Cancer Res. 2024;14(7):3335-47.
- Chawra HS, et al. MicroRNA-21's role in PTEN suppression and PI3K/AKT activation: implications for cancer biology. Pathol Res Pract. 2024;254:155091.
- Huang Y, Feng G. MiR-423-5p aggravates lung adenocarcinoma via targeting CADM1. Thorac Cancer. 2021;12(2):210-7.
- Hartsough EJ, et al. CADM1 is a TWIST1-regulated suppressor of invasion and survival. Cell Death Dis. 2019;10(4):281.
- Li H, Gao J, Zhang S. Functional and clinical characteristics of cell adhesion molecule CADM1 in cancer. Front Cell Dev Biol. 2021;9:714298.