מאמר שיטה

פרוטוקול לבידוד RNA ממספר מיני דובוני מים (Tardigrades)

15 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72120

⸱

1 בספטמבר 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את נהלי בידוד ה-RNA ממיניהם השונים של דובוני מים (tardigrades), תוך שימוש בערכה לבידוד RNA מבוססת עמודות, שנועדה לבודד RNA מכמויות קטנות של רקמה ולהפיק כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה ליישומים המשכיים כגון ריצוף RNA וסינתזת DNA משלימה.

תקציר

טרדיגרדים (דובוני מים) הם בעלי חיים מיקרוסקופיים הידועים בסבילותם יוצאת הדופן למאמץ סביבתי. בעלי חיים אלו יכולים לשרוד התייבשות, לחץ קיצוני, טמפרטורות נמוכות ורמות גבוהות של קרינה מייננת. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס יכולות אלו של עמידות לתנאי קיצון אינם מובנים עדיין במלואם. הגישות המולקולריות המשמשות לחקר מנגנונים אלו, הכוללות ריצוף RNA, השתקה של RNA (RNAi), וביטוי הטרולוגי של גנים של טרדיגרדים במערכות כגון חיידקים, דורשות בידוד של RNA שליח (mRNA) באיכות גבוהה מחומר ביולוגי מוגבל. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול הדיר בביצוע לבידוד RNA כולל מטרדיגרדים, אשר (1) יעיל על פני מספר מינים, כולל מין של Heterotardigrade, (2) דורש רק 25–200 בעלי חיים, בהתאם לגודל הגוף, ו-(3) מניב RNA בכמות ובאיכות מספקת ליישומים המשכיים. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר בהצלחה השחזור יעיל של RNA ממספרים סבירים של טרדיגרדים ותומך בחקירות מולקולריות של סבילות למאמץ במינים שונים של טרדיגרדים.

מבוא

דובוני מים (Tardigrades) ידועים ביכולתם לשרוד עקה קיצונית שבעלי חיים אחרים לא היו שורדים, כולל התייבשות, לחצים קיצוניים, טמפרטורות קיצוניות וחומרים הגורמים לנזק ל-DNA, כגון תרופות כימותרפיות וקרינה מייננת1,2,3,4,5,6,7,8. בשנים האחרונות חקרו מדענים את המנגנונים העומדים בבסיס העמידות הקיצונית של דובוני המים באמצעות גישות מולקולריות כגון ריצוף RNA, השתקה של RNA (RNAi), ואקספרסיה הטרוגנית של גנים של דובוני מים במערכות אחרות, כולל תאי אדם וחיידקים8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. כאשר הן מיושמות, גישות אלו היוו כלי רב עוצמה שסיפק לנו תובנות לגבי האופן המדויק שבו דובוני מים מסוגלים להפגין עמידות כה קיצונית לעקה8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. עם זאת, כל הגישות המולקולריות הללו להבנת סבילות דובוני המים לעקה מסתמכות על היכולת לבודד RNA מבעלי חיים זעירים אלו בכמות מספקת ובאיכות הולמת לשימוש בתהליכים המשכיים.

שיטה קודמת לבידוד RNA מדובדבני מים (tardigrades) הוכחה כאתגר מוצלח עבור חוקרים העובדים עם Hypsibius exemplaris23עם זאת, בניסיון לשחזר פרוטוקול זה ב- .H. exemplaris, מצאנו כי שיטה זו אינה מהימנה בכל הנוגע לריכוז ואיכות ה-RNA שהתקבלו (נתונים שלא פורסמו). שיטה חלופית לבידוד RNA המבוססת על פנול הוכחה כי היא יעילה עבור *H. exemplaris*, Ramazzottius varieornatus, ומין של טרדיגרדה הטרוגנית13,21,22,24,25,26פרוטוקול זה הוכח כמי שמספק RNA באיכות ובכמות מספקות עבור תהליכים המשכיים, הן מבעלי חיים בודדים והן מקבוצות של בעלי חיים (~50). עם זאת, פרוטוקול זה מחייב את המשתמש לעבוד עם ריאגנטים המכילים פנול. פנול הוא כימיקל מסוכן הדורש טיפול זהיר, וביצוע שגוי של פרוטוקול זה עלול להוביל לשאריות פנול המשפיעות על טוהר ה-RNA ועל יישומים המשכיים. פרוטוקול אחר שפורסם בעבר לבידוד RNA מדובשנים מתמקד ביכולת לבודד RNA מבעלי חיים בודדים.27אף על פי שזהו פרוטוקול בעל ערך ליישומים כגון PCR כמותי (qPCR)27היא פחות מתאימה ליישומים עוקבים כגון ריצוף RNA, שבהם המטרה היא להשיג מבט הוליסטי יותר על האופן שבו בעלי חיים מגיבים לגורם דחק או לתנאי מסוים.

מגבלות אלו בפרוטוקולי בידוד ה-RNA הזמינים הובילו לבחינת שיטות חלופיות לבידוד RNA מטרדיגראדות (דובוני מים). ערכת בידוד ה-RNA מבוססת העמודות המשמשת בפרוטוקול זה משווקת לבידוד RNA מכמויות קטנות של רקמה. ערכה זו שימשה בעבר לבידוד RNA מרקמות של חרקים לצורך אנליזת רצף RNA (RNA sequencing) במורד, דבר המרמז כי היא עשויה להתאים לבידוד מבעלי חיים קטנים אחרים בעלי קוטיקולה, כגון טרדיגראדות28. מחקר זה מפרט את הפרוטוקול שלב אחר שלב לשימוש בערכת בידוד RNA מבוססת עמודות זו עם טרדיגראדות, כולל הסברים על זהירות מיוחדת שיש לנקוט בעת ביצוע פרוטוקול זה בטרדיגראדות. מאמר זה מדווח על הצלחתו של פרוטוקול זה בשישה מיני טרדיגראדות (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti, וההטרוטרדיגראד Viridiscus celatus). המחקר תיקף כי ניתן להוציא RNA באיכות ובכמות משמעותיות אפילו מ-25 בעלי חיים בלבד. כמו כן, מוצגות דוגמאות לנתוני ריכוז ואיכות ה-RNA שהתקבלו, אשר מתאימים ליישומים במורד כגון רצף RNA (עם הטיה מינימלית, הגברה אקספוננציאלית של הספרייה) וסינתזת DNA משלימה (cDNA). פרוטוקול בידוד RNA זה כבר הוכח כמותיל לחשיפת מנגנוני עמידות לקרינה ב-H. exemplaris8. הצלחתו של פרוטוקול זה במיני טרדיגראדות שונים מרמזת כי הוא יהיה רלוונטי באופן רחב יותר לחקירת מנגנוני עמידות לעקה, מנגנוני התפתחות ותהליכים אבולוציוניים.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא אינו דורש אישור מהוועדה המוסדית לאתיקה בבעלי חיים, כיוון שבעלי חיים חסרי חוליות פטורים מדרישה זו. הרכיבים והציוד שבהם נעשה שימוש מפורטים ב- טבלת חומרים.

1. הכנה של הציוד והאזור לבידוד RNA

  1. הפעילו בלוק חימום או מקבץ מים ל- 42 °C כהכנה להפקת RNA.
  2. השיגו מעמד למבחנות מיקרו-צנטריפוגה, פיפטות (2 µL, 20 µL, 200 µLו- 1000 µL), וקלקיפי פיפט מסוננים בגודל מתאים.
  3. נקה את משטח העבודה, את מעמד המבחנות, את הפ pipette-ים ואת קופסאות הטיפים באמצעות RNase Away, תמיסת הלבנה מהולה (10%) או אתנול 70%, כדי לדנטר כל שאריות של RNase.
    הערה: נוכחות מוגברת של RNase על הציוד או באזור שבו מבודד ה-RNA עלולה להוביל לאיכות RNA נמוכה לאחר הבידוד עקב דגרדציה. ניתן להפחית סיכון זה על ידי מתן זמן מספיק לפעולת הכימיקלים המנטרלים (denaturing) את ה-RNase, ועל ידי המתנה להתייבשות מלאה של האזור והציוד לפני המשך הפעולה.
  4. יש להשתמש בכפפות בכל שלבי פרוטוקול זה, ולטפל בכפפות בתדירות גבוהה בתמיסה דנטורית ל-RNase לאורך הפרוטוקול, כדי למנוע פירוק של RNA על ידי RNase.

2. איסוף בעלי חיים לצורך בידוד RNA

  1. באמצעות נורית שאיבה המחוברת לתא של מערכת צינורות שאיבה המצויד בנימה מזכוכית (איור 1A), לולאת Irwin, או מיקרופיפט, העבירו 25–200 בעלי חיים (בהתאם לגודל המין) מכלי השגיהם לכלי עם מי מעיין נקיים, כדי להפחית את כמות החומרים שאינם טרדיגרדים (אצות או מקורות מזון אחרים כגון נמטודות או רוטיפרים, בהתאם למין).
  2. השיגו מבחנה של 1.5 mL נטולת RNase ועלי פסטל (pestle).
  3. באמצעות נורית שאיבה המחוברת לתא של מערכת צינורות שאיבה המצויד בנימה מזכוכית או לולאת Irwin, העבירו את בעלי החיים לתחתית המבחנה של 1.5 mL נטולת RNase, תוך הקפדה מיוחדת להעביר מעט מים ככל האפשר יחד עם בעלי החיים.
  4. סובבו בצנטריפוגה במהירות של 4,500 g למשך 3 דקות כדי לשקע את הטרדיגרדים לתחתית מבחנת המיקרו-צנטריפוגה.
  5. בעודכם צופים במבחנה עם המשקע של הטרדיגרדים תחת מיקרוסקופ הפרדה, השתמשו בפיפט של 20 µL או בנורית שאיבה המחוברת לתא של מערכת צינורות שאיבה המצויד בנימה מזכוכית עם פתח הקטן מהטרדיגרדים מהם מבודד ה-RNA, כדי להסיר בזהירות כמה שיותר מים מבלי להפריע למשקע הטרדיגרדים. ראו איור 1B לדוגמה לכמות מקובלת של מים נותרים.
    הערה: היזהרו להשאיר שכבה דקה של מים כדי שבעלי החיים לא יתייבשו בזמן הקצר שבין הסרת המים להוספת באפר המיצוי (Extraction Buffer (XB)). אם בעלי החיים יתייבשו, הדבר עלול להוביל לאיכות RNA נמוכה לאחר הבידוד.
  6. הוסיפו 100 µL של באפר מיצוי (Extraction Buffer (XB)) למבחנה המכילה את הטרדיגרדים.

3. פירוק מכני של טרדיגרדות והפקת RNA

  1. בעזרת עלי הפס (pestle) נטול RNase, השמידו את הטרדיגרדס על ידי ריסוק עדין אך נחרץ של העלי בתחתית המבחנה למשך ~30 s. כ-20–30 פעולות ריסוק אמורות להספיק כדי להשמיד את הטרדיגרדס.
  2. הוציאו את העלי מהמבחנה, תוך הקפדה על כך שכמות הנוזל המקסימלית תישאר בתחתית המבחנה.
  3. בדקו את תכולת מבחנת המיקרופוגה תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שלא נותרו בעלי חיים שלמים גלויים.
  4. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 42 °C למשך 30 min בבלוק חימום רועד עם רעידה עדינה (300 rpm).
    הערה: תחליל ההפקה (Extraction Buffer (XB)) מייצב את ה-RNA כדי למנוע פירוק בטמפרטורה זו.

4. התניית עמודת בידוד ה-RNA

  1. ב-10 הדקות האחרונות של דגירת המיצוי, הרכיבו את העמודה לאיסוף וניקוי ה-RNA. מקמו עמודת ניקוי בתוך מבחורת איסוף וסמנו את העמודה באופן מתאים.
  2. הוסף 250 µL בופר התנייה (Conditioning Buffer, CB) ישירות לעמודה.
  3. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  4. סבב במערך צנטריפוגה במהירות 16,000 × ג במשך דקה אחת והשליכו את הנוזל שעבר דרך העמודה (flowthrough). העמודה מוכנה כעת לקבלת על-משקע ה-RNA מהשלב הבא.
  5. הוציאו את תמיסת התגובה 10x DNase I ואת המים נקיים מנוקליאז (Nuclease-Free Water) מהמקפיא להפשרה מלאה, כך שיהיו מוכנים לקראת שלב 6 להלן.

5. קישור ה-RNA לעמודה

  1. לאחר דגירת המיצוי, סנטריפוגו את המבחנה המכילה את הדבדיבונים שועבדו באופן מכני ואת באפר המיצוי (Extraction Buffer - XB) במהירות של 3,000 × g למשך 2 דקות.
  2. השיגו מבחנה חדשה נקייה מ-RNase וסמנו אותה בהתאם.
  3. בעזרת פיפט של 200 µL עם טיפ עם פילטר, הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מהמשקע של קוטיקולות הדבדיבונים. הקפידו לא להפריע למשקע הקוטיקולה ולהסיר רק את הנוזל העליון.
    הערה: העברת קוטיקולה לשלבים הבאים תביא לירידה ביעילות ניצול ה-RNA מהעמודה עקב סתימה פיזית של העמודה. כדי למנוע טעות פוטנציאלית זו, ניתן לבחון את טיפ הפיפט עם הנוזל העליון תחת המיקרוסקופ כדי לוודא היעדר קוטיקולה. אם קוטיקולה נמצאה, החזירו את הנוזל העליון למבחנה וחזרו על שלב הסנטריפוגה.
  4. העבירו את הנוזל העליון למבחנה הנקייה מ-RNase שסומנה.
  5. הוסיפו בעזרת פיפט 100 µL אתנול 70% למבחנה המכילה את ה-RNA וערבבו היטב על ידי פיפטור למעלה ולמטה מספר פעמים. בשלב זה, יש לראות פילמנטים צמיגיים שקופים עם הוספת האתנול. זהו סימן טוב לנוכחות RNA בנוזל העליון.
  6. העבירו בעזרת פיפט את כל התערובת (200 µL) לעמודה שהוכנה בשלב 4.
    הערה: בעת פיפטור של תמיסות לעמודה בשלב זה ובשלבים הבאים, הקפידו להעביר את הנוזל למרכז העמודה והימנעו ממגע פיזי של טיפ הפיפט עם העמודה. פגיעה מכנית בעמודה תגרום לבעיות בהמשך באיכות ובכמות ה-RNA.
  7. כדי לקשור את ה-RNA לעמודה, סנטריפוגו למשך 2 דקות ב-100 × g, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגה במהירות של 16,000 × g למשך 30 שניות כדי להסיר את הנוזל שעבר (flowthrough).

6. הכנת תמיסת DNase I

  1. יש להמתין להפשרה מלאה של תמיסת הריאקציה 10x DNase I Reaction Buffer ושל ה-Nuclease-Free Water לפני הכנת התמיסה.
  2. עבור כל בידוד RNA, הכינו תמיסה בנפח 40 µL בתוך פרועת מיקרוצנטריפוגה נפרדת של 1.5 mL, המורכבת מ-32 µL Nuclease-Free Water, ‏4 µL 10x DNase I Reaction Buffer ו-4 µL DNase I Enzyme. שמרו את התמיסה על קרח עד למועד היישום על העמודה בשלב 7.3.

7. שטיפת ה-RNA וטיפול ב-DNase I

  1. העבירו בפיפטה 100 µL של Wash Buffer 1 (W1) ישירות אל עמודת הטיהור המכילה את ה-RNA הקשור (משלב 5.7).
  2. סובבו בצנטריפוגה למשך 1 min ב-8,000 × g והסירו את הנוזל שעבר דרך העמודה (flowthrough).
  3. העבירו בפיפטה 40 µL של תמיסת DNase I משלב 6 ישירות אל עמודת הטיהור והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 min כדי להסיר זיהום של DNA.
  4. העבירו בפיפטה 40 µL של Wash Buffer 1 (W1) אל עמודת הטיהור וסובבו בצנטריפוגה ב-8,000 × g למשך 30 s.
  5. העבירו בפיפטה 100 µL של Wash Buffer 2 (W2) אל עמודת הטיהור וסובבו בצנטריפוגה ב-8,000 × g למשך 1 min.
  6. העבירו בפיפטה 100 µL נוספים של Wash Buffer 2 (W2) אל עמודת הטיהור וסובבו בצנטריפוגה ב-16,000 × g למשך 2 min. השליכו את הנוזל שעבר דרך העמודה.
  7. סובבו את העמודה בצנטריפוגה ב-16,000 × g למשך 1 min כדי לייבש את העמודה.

8. אלוציה של RNA

  1. השיגו מבחנה של 0.5 mL (כלולה בערכה) עבור כל בידוד RNA וסמנו אותה באופן מתאים. זו תהיה המבחנה שתכיל את ה-RNA לאחר הבידוד.
  2. העבירו את העמודה עם ה-RNA הקשור והמנוקה למבחנה המסומנת של 0.5 mL. העמודה צריכה להינעל בנקישה חזקה לתוך המבחנה זו.
  3. בעודכם מביטים במבחנה מהצד, מקמו את קצה הפ pipette ישירות מעל ממבrane העמודה, פלטו 11 µL של Elution Buffer (EB) על העמודה, והדריגו למשך 1 min בטמפרטורת החדר.
    הערה: אי-פיזור של ה-Elution Buffer (EB) ישירות על העמודה יוביל לתשואת RNA מופחתת. אם נצפים טיפות נוזל מסביב להיקף העמודה, הדבר מעיד על פיזור לא נכון של ה-Elution Buffer (EB) על העמודה. במקרה כזה, מומלץ לחזור על שלב זה עם הנוזל שעבר (flowthrough) משלב 8.5, תוך וידוא שה-Elution Buffer (EB) נפלט ישירות למרכז העמודה.
  4. מקמו את המבחנה של 0.5 mL המכילה את העמודה בתוך מבחנת האיסוף שסופקה עם הערכה להתאמה נכונה במהלך סנטריפוגציה (איור 2).
  5. סנטריפוגו את העמודה ב-1,000 × g למשך 1 min כדי להפיץ את ה-Elution Buffer (EB), ולאחר מכן סנטריפוגו ב-16,000 × g למשך 1 min כדי להשקיע (elute) את ה-RNA.
  6. מקמו את המבחנה של 0.5 mL המכילה את ה-RNA על קרח באופן מיידי.

9. תיקוף של כמות ואיכות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר למיקרו-נפחים

הערה: ניתן להשתמש בשיטות אחרות להערכת כמות ואיכות ה-RNA. כאן נעשה שימוש בשיטה המבוססת על ספקטרופוטומטר למיקרו-נפחים. ניתן להשתמש גם בפלואורומטר או בכלי אלקטרופורזה של ג'ל במיקרו-פלואידיקה29.

  1. נגב את המעמד של הספקטרופוטומטר למיקרו-נפחים באמצעות מטלית ללא סיבים כדי להבטיח שהוא נקי מנוזלים אחרים.
  2. בחר את הגדרת ה-RNA בספקטרופוטומטר לצורך הניתוח.
  3. בצע כיול (Blank) לספקטרופוטומטר באמצעות 1 µL של תמיסת השחרור (EB) ששימשה בשלב 8.3.
  4. לאחר הכיול, נגב את תמיסת השחרור (EB) מהמעמד באמצעות מטלית ללא סיבים.
  5. תוך שמירת מבחנת ה-0.5 mL המכילה את ה-RNA על קרח, טפטף 1 µL של RNA על מעמד הספקטרופוטומטר. הורד את זרוע הספקטרופוטומטר כדי למדוד את הבליעה של הדגימה, לצורך כימות והערכת האיכות של ה-RNA שהופרד.
    הערה: אנא עיין בסעיף "תוצאות" להלן לפרטים על האיכות והכמות המקובלות עבור יישומים המשכיים.

תוצאות

שלב קריטי בפרוטוקול זה, כפי שהוזכר לעיל, הוא הסרת כמות מתאימה של מים מהטרדיגרדים שנאספו לפני הוספת תחביב המיצוי (XB) להפקת RNA. השארת כמות מים רבה מדי תביא לדילול של תחביב המיצוי (XB) ולהפקה לקויה של RNA מהבעלי החיים (כלומר, RIN < 7, יחס 260/280 < 1.8, יחס 260/230 < 1.8, ו/או ריכוז < 5 ng/µL), מה שיביא לירידה בריכוז ובאיכות ה-RNA לאחר האלוציה. הסרת מים מרובה מדי תגרום לייבוש מהיר של בעלי החיים, מה שעלול להוביל למוות ולירידה באיכות ה-RNA עקב עלייה בפעילות RNase לאחר המוות. ייצוג חזותי המראה את כמות המים המתאימה להשאירה במבחנה עם הטרדיגרדים לפני הוספת תחביב המיצוי (XB) (איור 1B) מסופק כדי לסייע בהשלמה מוצלחת של פרוטוקול זה.

עד כה, פרוטוקול זה נסה בשישה מיני טרדיגרד שונים, כולל הטרדיגרד ההטרוגני (V. celatus). בידודים אלו הניבו ריכוזי RNA שנעים בין 11 ng/µL ל-106.6 ng/µL (אושר באמצעות ספקטרופוטומטר למיקרו-נפח, Table 1) ובין 9 ng/µL ל-113 ng/µL (אושר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל במיקרופלואידיקה, Table 2). מספר בעלי החיים הדרושים לבידוד RNA משתנה בהתאם לגודל המין ממנו מבודד ה-RNA. טרדיגרדים גדולים יותר, כגון מיני Paramacrobiotus ו- Milnesium sp., מניבים ריכוזי RNA מספקים כבר מ-25 בעלי חיים בלבד (Table 1). עבור מינים קטנים יותר, כגון H. exemplaris ו- V. celatus, הבידודים מצליחים יותר מ-100 בעלי חיים או יותר (Table 1). לרוב הבידודים יש יחס 260/280 של סביב 2, המעיד על RNA נקי30. בידודים ממינים מסוימים (V. celatus ו- H. exemplaris, ומיני Paramacrobiotus ) מביאים לעיתים ליחס 260/230 נמוך, מה שמרמז על זיהום מרכיבים כימיים30. דבר זה קרה לעיתים קרובות כאשר השתמשו בפחות בעלי חיים (100 עבור V. celatus ו- H. exemplaris, ו-25 עבור Paramacrobiotus species), מה שמרמז כי מספר קטן מדי של בעלי חיים עשוי להגביר את הסיכון לזיהום מרכיבים ב-RNA המבודד הסופי. באמצעות הערכת איכות ה-RNA via אלקטרופורזה של ג'ל במיקרופלואידיקה, ניתן לחשב את מספר שלמות ה-RNA (RIN). ערך RIN שבין 9–10 מעיד על RNA באיכות גבוהה עם פירוק מועט31, ובדרך כלל מומלץ לא להמשיך בתהליכים המשכיים כמו ריצוף RNA אם ה-RIN נמוך מ-7. מספר תוצאות לדוגמה של אלקטרופורזה של ג'ל במיקרופלואידיקה מוצגות (Figure 3) עבור דגימות עם ערכי RIN גבוהים ונמוכים/בלתי ניתנים לזיהוי. חלק מדגימות אלו הוצאו מהניתוח המשכי (Table 2, Figure 3A,D). עם זאת, דגימות מסוימות עם RIN נמוך/בלתי ניתן לזיהוי נבחרו להמשיך להכנת ספרייה לריצוף RNA ובכל זאת הניבו תוצאות ריצוף RNA איכותיות (Table 2, Figure 3B,F, נתונים שלא פורסמו, ראו "Discussion" למידע נוסף).

figure-results-1
איור 1: הגדרה לבידוד RNA. תמונות המראות פומפתית המחוברת למכל של מערכת צינורות שאיבה המצוידת בנימים מזכוכית להעברת בעלי חיים ושאיבת מים (A) והצגה של כמות מים מקובלת שנותרה לפני הוספת תמיסת מיצוי (XB) לטרדיגרדים מסוג Paramacrobiotus (B). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הגדרת מבחנות אלואוציה לאלואוציה סופית. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תוצאות מייצגות של אלקטרופורזה של ג'ל במיקרופלואידיקה עבור H. exemplaris ו-P. gadabouti. (A) ג'ל RNA מ-H. exemplaris שנחשף לקרינה מייננת. (B) ג'ל RNA מ-P. gadabouti ו- H. exemplaris בתנאי ביקורת. (C–F) פרופילי שיאים מייצגים מדגימת RNA איכותית של H. exemplaris (C), מדגימת H. exemplaris בעלת איכות מפוקפקת (D), מדגימת P. gadabouti באיכות טובה (E), ומדגימת H. exemplaris עם דגרדציה ניכרת (שיא ב-147 bp) (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ריכוזי RNA מייצגים ומידע על איכות מדוגמיות של מיני Tardigrade שונים שנאספו באמצעות ספקטרופוטומטר בנפח זעיר. *ריכוזים הנמוכים מ-20 ng/µL, כפי שזוהו באמצעות ספקטרופוטומטר בנפח זעיר, עלולים להוביל ליחסי בליעה לא מדויקים. **יחס 260/230 נמוך נגרם עקב מהירות צנטריפוגה שגויה בשלב 5.7. אנא לחצו כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: ריכוזי RNA מייצגים ומידע על איכות מדגימות של שני מיני טרדיגרד שנאספו באמצעות מערכת אלקטרופורזה של ג'ל במיקרופלואידיקה. אנא לחצו כאן להורדת טבלה זו.

דיון

מטרת פרוטוקול זה היא להקל על בידוד RNA מדובדובים (tardigrades) בכמות ובאיכות גבוהות מספיק כדי שיהיו רלוונטיות ליישומים המשכיים המאפשרים חקירה של עמידות הדובדובים לעקה. הפרוטוקול המוצג כאן מפרט תחומים שבהם משתמשים עלולים להיתקל בבעיות, כולל הסרת מים מספיקה לפני הוספת תמיסת מיצוי (Extraction Buffer (XB)) (שלב 2.5), פירוק גופי הדובדובים (שלבים 3.1–3.3), העברת העלייה (supernatant) לעמודה לצורך טיהור (שלב 5.3), ואלוציה של ה-RNA (שלב 8.3). שגיאות בכל אחד מהשלבים הללו עלולות להוביל לריכוז או לאיכות מופחתים של ה-RNA המתקבל. אם ריכוז ה-RNA המתקבל הוא פחות מ-5 ng/µL (כפי שמאומת באמצעות ספקטרופוטומטר למיקרו-נפחים), המשתמש עשוי לשקול ביצוע מחדש של בידוד ה-RNA עם (1) מספר רב יותר של בעלי חיים בהתחלה (>100 עבור מינים קטנים או >50 עבור מינים גדולים יותר), או (2) חזרה על הפרוטוקול, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לשלבי הסרת המים, פירוק הדובדובים והאלוציה.

מאמר זה מספק דוגמאות להערכות איכות של RNA (מדד RIN, יחס 260/280, יחס 260/230) שנחשבו למתאימות או לבלתי מתאימות לריצוף RNA (טבלה 1, טבלה 2, איור 3). לעיתים, נמוך (<1.0) יחסי 260/230 נצפים בחלק מבידורי ה-RNA שבוצעו באמצעות פרוטוקול זה (טבלה 1), מה שמעיד על נוכחות של תרכובות אורגניות שיריות. בדרך כלל, הדבר היה קשור למספר נמוך של בעלי חיים. אם הגדלת כמות בעלי החיים אינה אפשרות, או אם המשתמשים נתקלים באופן עקבי ביחס 260/230 נמוך, מומלץ להוסיף שלב שטיפה נוסף עם Wash Buffer 2 (W2) (חזרה על שלב 7.6) ו/או להאריך את זמן הסריפוגציה של סבב הייבוש (dry-spin) בשלב 7.7 כדי להבטיח את הסרת המזהמים הללו. בנוסף, יש לציין כי ה-one representative *H. exemplaris* בידוד עם יחס 260/230 נמוך (טבלה 1בוצעה על ידי סטודנט לתואר ראשון שהשתמש בפרוטוקול לראשונה, אשר במבט לאחור הבין ששלב 5.7 (סבוב לצורך הסרת אתנול לאחר קישור ה-RNA לעמודה) בוצע במהירות צנטריפוגה שגויה (איטית מדי). סביר להניח שהדבר הוביל לכך שאתנול נותר על העמודה ועבר הלאה עם הפרוטוקול, מה שגרם ליחס 260/230 נמוך. בידודים הבאים שבוצעו על ידי משתמש זה התקבלו ערכי 260/230 בטווח סביר (לא פחות מ-1.5). לפיכך, על כל המשתמשים, ובמיוחד משתמשים ראשוניים, להקפיד מאוד על מהירויות הצנטריפוגה בעת עבודה לפי הפרוטוקול כדי למנוע בעיות פוטנציאליות אלו. למרות יחסי 260/230 נמוכים מדי פעם או RIN נמוך ב- .H. exemplarisניתן יהיה להשתמש ב-RNA בעל קריאות איכות דומות להמשך ריצוף RNA (RNA sequencing), כדי לבחון ביטוי גנים דיפרנציאלי לאחר חשיפה לקרינה מייננת או לגורמי עקה אחרים8 (טבלה 1, טבלה 2, ונתונים שטרם פורסמו). בדומה לכך, RNA שבודד מ- *P. gadabouti* עם פרוטוקול זה התקבלו ריכוז ואיכות RNA גבוהים (כפי שאומת באמצעות RIN, טבלה 2, איור 3) והביא לנתוני רצף RNA משמעותיים (נתונים שלא פורסמו). באופן אנקדוטלי, מחקר זה השתמש בהצלחה ב-RNA מ- .H. exemplaris בריכוזים נמוכים (5–9 נג/µL) ליצירת cDNA לצורך שיבוט (cloning) מוצלח של *H. exemplaris* גנים8כאשר RNA מ- *H. exemplaris* הביאו לריכוז נמוך/בלתי ניתן לגילוי ולערך RIN (שנמדד באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל במיקרופלואידקה), ולכן RNA בודד מחדש עבור טיפול זה לפני ההמשך להכנת ספרייה לריצוף RNA (טבלה 2, איור 3A,D). ההחלטה לבצע מחדש בידוד RNA עבור דגימה זו (איור 3A,D), במקום להמשיך לריצוף כפי שנעשה עם דגימות אחרות מ- .H. exemplaris עם RIN לא ניתן לזיהוי (איור 3B,פ), התקבלה על סמך היעדר פסים ברורים בג'ל המיקרופלואידיקה, דבר שיכול להעיד על שגיאה בטעינה, RNA מ Nogדג או ריכוז RNA לא מספיק. לעומת זאת, כאשר RNA שבודד מ- .H. exemplaris הפגינה ריכוז נמוך יחסית, RIN שאינו ניתן לזיהוי וסימנים לדגרדציה מסוימת של RNA, כפי שהתבטא ברמות גבוהות יותר של RNA בגודל קטן, אך היא הניבה נתוני רצף RNA שמישים לאחר הכנת הספרייה (נתונים שלא פורסמו, טבלה 2, איור 3B,Fלפיכך, אף שסיפקו כאן מספר הנחיות לקביעה האם דגימות RNA מתאימות ליישומים המשכיים, על המשתמש להפעיל את שיקול דעתנו ולהתחשב ביישום ההמשכי הספציפי שלו בעת הערכת השאלה האם איכות וכמות ה-RNA מספיקות כדי להמשיך בתהליך.

מדעים המעוניינים לבודד RNA מדובשנים (tardigrades) צריכים לשקול היבטים מרובים כאשר הם קובעים איזה פרוטוקול הוא המתאים ביותר למטרתם. כל שיטות בידוד ה-RNA שדווחו בעבר (כולל השיטה המדווחת כאן) הניבו RNA בכמות ובאיכות מספיקות כדי לתמוך ביישומים המשכיים כגון ריצוף RNA, סינתזת cDNA ו-qPCR8,12,13,17,21,22,25,27. העלות היא לרוב שיקול מרכזי, במיוחד עבור מעבדות מחקר בעלות תקציבים קטנים או מעבדות הוראה. הפרוטוקול המדווח כאן יקר יותר מפרוטוקולים שדווחו בעבר לכל תגובת בידוד. עם זאת, נטענה כי עליית העלות מלווה ביתרונות ביחס לפרוטוקולים שדווחו בעבר. בהשוואה לפרוטוקולי בידוד RNA אחרים המבוססים על עמודות23, פרוטוקול בידוד ה-RNA המדווח כאן יכול להפיק כמות מספקת של RNA באיכות נאותה מכמות קטנה יותר של חומר פשוט (פחות בעלי חיים). בנוסף, כפי שהוזכר במבוא, פרוטוקול בידוד RNA מבוסס עמודות שדווח בעבר פעל באופן לא עקבי בידינו, ולעתים קרובות הניב תנובה נמוכה ביותר של RNA שאינה מספיקה לתהליכים המשכיים (נתונים שלא פורסמו). הפרוטוקול המדווח כאן בטוח משמעותית יותר בהשוואה לגישת בידוד RNA מבוססת פנול, שכן הוא אינו דורש מהמשתמשים לטפל בחומרים מסוכנים המחייבים שימוש במכסה שאיבה. כמו כן, בעיה נפוצה בקרב משתמשים בפרוטוקולי מיצוי RNA מבוססי פנול היא שאריות פנול (phenol carryover), המשפיעות על טוהר ה-RNA ויכולות לשבש יישומים המשכיים. בעיות אלו הופכות את מיצוי ה-RNA מבוסס הפנול לפחות נגיש לסטודנטים לתואר ראשון (בין אם במעבדות מחקר או בכיתות). עם זאת, השיטה מבוססת הפנול היא המשתלמת ביותר מבחינה כלכלית. הפרוטוקול המדווח כאן אינו מתאים לבידוד RNA מבעל חיים בודד לצורך הערכת תגובות טרנסקריפטומיות של פרט יחיד (כפי שפורסם ב-Kirk et al.) אלא הוא בעל ערך לבדיקת שינויים משותפים בין פרטים בתגובה לגורם מאמץ, ובכך מספק מבט הוליסטי יותר על תגובות למאמץ. לפיכך, על המשתמשים לשקול את חשיבות העלות, זמינות בעלי החיים ונגישות המשתמשים לפרוטוקולים הקיימים כדי לקבוע איזה פרוטוקול מתאים ביותר לצרכיהם.

דו"ח זה תיקף כי פרוטוקול זה מפיק RNA בכמות ובאיכות מספיקות מששה מינים שונים של טרדיגראדות (דובוני מים), כולל מין מייצג מ-Heterotardigrada. בנוסף, שיטה זו לבידוד RNA מניבה כמות מספיקה של RNA ממספר סביר של בעלי חיים (25–200, בהתאם לגודל המין). תיקוף פרוטוקול בידוד RNA זה במספר מינים פותח את הדלת להבנת היבטים מרתקים של הביולוגיה של הטרדיגראדות. הדבר אינו מוגבל לחקירת עמידות למתח, אלא נשתרה גם להבנת האבולוציה של בעלי חיים אלו, כולל האבולוציה של מנגנוני עמידות והתפתחותם. פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור מיני טרדיגראדות שאינם מיני מודל וכאלה שנאספו מהשדה, שבהם הביומסה מוגבלת וחסרות שיטות סטנדרטיות לבידוד RNA. לבסוף, פרוטוקול זה נגיש לחוקרים וניתן לביצוע באופן הדיר על ידי סטודנטים לתואר ראשון, מה שהופך אותו לנכס במעבדות הוראה או מחקר במוסדות אקדמיים המתמקדים בתואר ראשון.

גילויים

למחברים אין הצהרות גילוי נאות.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי כספי התנעה מ-UNC Asheville (עבור CCH) ומענק NSF מספר 2225683 ל-Jason Pienaar (המנחה הפוסט-דוקטורט של PK). אנו מודים למתקן הריצוף בעthroughput גבוה של UNC על הסיוע הטכני.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנות מיקרופוג' 1.5 mLUSA Scientific1615-5500מבחנת מיקרוצנטריפוגה מדורגת Seal-Rite 1.5 mL, טבעית, פוליפרופילן, 500/שקית
אתנול 70%VWR71001-654לניקוי משטחי עבודה/ציוד
ערכה לבידוד RNA מסוג Arcturis PicoPureFisherKIT0204ערכה המכילה רכיבים עבור פרוטוקול הבידוד המתואר במאמר זה
צנטריפוגהEppendorf5405000441Centrifuge 5425, כפתורי סיבוב, ללא קירור, עם Rotor FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (US)
מי מעיינות Deer ParkAny Grocery StoreN/Aזהו המצע לתרביות טרדיגראדים והוא משמש לשטיפת טרדיגראדים לפני בידוד RNA
מיקרוסקופ דיסקציהZeissN/AZeiss Stemi 305, יחס זום 5:1 והגדלה כוללת 8x-40x, עם יחידת תאורה תחתונה M LED
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, ללא RNase (1 U/uL)
טיפים מסננים לפיפטה 10 uLVWR76322-528כל טיפ מסנן לפיפטה מתאים
טיפים מסננים לפיפטה 1000 uLVWR76322-154כל טיפ מסנן לפיפטה מתאים
טיפים מסננים לפיפטה 20 uLVWR76322-134כל טיפ מסנן לפיפטה מתאים
טיפים מסננים לפיפטה 200 uLVWR76322-150כל טיפ מסנן לפיפטה מתאים
קפילריות זכוכיתFisher50-821-811World Precision Instrument Standard Glass Capillaries - 1B120-6 (6 אינץ', קוטר חיצוני 1.2 mm, ללא פילמנט). אלו נמתחות לשתי קפילריות זכוכית עם קצוות מוצרים מעל להבה ולאחר מכן שוברות לקוטר המתאים לשאיבה בפיפטה של מין הטרדיגראד הנבחר.
בלוק חימוםEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, מכשיר בסיסי ללא תרמובלוק, 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/South America/TW)
סולם High Sensitivity RNA Screen TapeAgilent5067-5581סולם לניתוח ברגישות גבוהה של total RNA במערכות TapeStation
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579לניתוח ברגישות גבוהה של total RNA במערכות TapeStation
בופר דגימה ל-High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5580בופר לניתוח ברגישות גבוהה של total RNA במערכות TapeStation
אלקטרופורזה של ג'ל במיקרופלואידקהAgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation System
ספקטרופוטומטר למיקרו-נפחFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, סוג גלאי: 2048-element, CMOS Linear Image Sensor, תצוגה: 10 אינץ' צבעונית בחדות גבוהה, שפות: סינית, אנגלית, צרפתית, יפנית, גרמנית, מקור אור: Xenon Flash, רוחב פס ספקטרלי: פחות או שווה ל-1.8 nm (FWHM ב-Hg 254 nm), מתח: 12 VDC
פיפטה לשאיבה באמצעות הפהMillipore SigmaA5177מכלולי צינורות שאיבה עבור פיפטות מיקרוקפילריות מכויילות
מים ללא נוקלאזFisherFERR0581Thermo Scientific Water, nuclease-free
פיפטות (2.5 uL, 20 uL, 200 uL, ו-1000 uL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, מארז של 4
RNase AwayFisher21-402-178חומר לחיטוי משטחים Thermo Scientific RNase AWAY
מבחנה ופסטל ללא RNaseFisher12-141-368מבחנות ופסטלים ללא RNase לבידוד RNA

מקורות

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNARNARNA
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.