הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטת ביופסיה בקנה מידה חדשני לאיסוף לימפוציטים ממאירים ולא ממאירים בדגי זברה

143 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72153

⸱

7 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

במאמר זה

סיכום

שיטת ביופסיה בקנה מידה חדשני מאפשרת איסוף תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה מדגי זברה חיים. התוצאות מראות שפע של לימפוציטים בקשקשי דגים מסוג בר (WT), ועלייה דרמטית בלימפוציטים בקשקשים של דגים עם ALL (לוקמיה לימפובלסטית חריפה). טכניקה זו מאפשרת מחקר מינימלי פולשני של לימפוציטים אפידרמיים תקינים וממאירים.

תקציר

דג זברה (Danio rerio) הוא מודל עוצמתי לחקר לימפופואיזיס וסרטן לימפואידי, שכן דגי זברה ובני אדם חולקים מערכות חיסון אדפטיביות דומות, כולל תאי B ו-T. מתוארים מספר מודלים של לוקמיה לימפובלסטית חריפה ( T-ALL) של D. rerio , כולל דגים המבטאים MYC אנושי (hMYC) ספציפי ללימפובלסטים. דיווחנו כי דגי rag2:hMYC מפתחים גם לוקמיה לימפובלסטית חריפה בתאי B (B-ALL), מה שהופך אותם לשימושיים ללימוד שני הסוגים של כל הסוגים. מגבלה במודלים ALL של דגי זברה היא שאין שיטות לא קטלניות לדגימה סדרתית של ALL. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו שיטת 'ביופסיה בקנה מידה' חדשנית לאיסוף כל התאים מדגי זברה חיים. עם זאת, הידע על אילו לימפוציטים שוכנים בקשקשי דגי זברה רגילים הוא מועט. לכן, כדי להגדיר זהויות לימפוציטים אפידרמליות תקינה, ביצענו ביופסיות בקנה מידה על קווים טרנסגניים מסומנים על ידי לימפוציטים ללא rag2:hMYC. השתמשנו במיקרוסקופיה קונבנציונלית וקונפוקלית לניתוח קשקשים, וחשפנו שפע של לימפוציטים אפידרמליים. ניתחנו גם קשקשים מדגים עם T- ו-B-ALL, שהראו עלייה משמעותית בלימפוציטים ביריעות מתאחדות של תאים ALL בקשקשים רבים. לאחר מכן השתמשנו במיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) כדי לטהר לימפוציטים לא ממאירים ו-ALL מהקשקשים למחקרים אקס ויבו. ניתוחי זרימה, ציטומטריה וביטוי של כל התאים מקשקשים או רקמות אחרות של אותו דג הראו כי ביטוי הגנים של כל התאים בקנה מידה דומה לזה של כל התאים במקומות אחרים. כמו כן, כימתנו את מספר התאים הנורמליים T, B, T-ALL ו-B-ALL שניתן לטהר לפי סולם. בסך הכול, ביופסיה בקנה מידה מספקת טכניקה לא קטלנית וזעיר-פולשנית לחקר לימפוציטים אפידרמליים של דגי זברה, המאפשרת מחקרים אקס ויבו, כולל ניתוח של דגימות ממאירות.

מבוא

תפקוד המחסום של עור היונקים ותפקידיו במערכת החיסון נקבע 1,2,3. לימפוציטים ביונקים תורמים לחסינות העור, כאשר תאי T ציטוטוקסיים שוכנים באפידרמיס, ותאי B, T ותאי רוצח טבעי (NK) נמצאים בעור 1,3,4,5. לדגי זברה יש לימפוציטים אלו, עם אימונוגלובולינים שטחיים, קולטני תאי T, קולטני קומפלקס היסטוקומפטציה עיקרי (MHC), ציטוקינים והקולטנים שלהם, ומולקולות חיסוניות נוספות, ולכן חולקים את רוב התכונות האימונולוגיות של היונקים 6,7,8,9. מחקרים עדכניים על עור וקשקשי דגי זברה הראו אוכלוסיות לימפוציטים עוריות שונות, כולל תאי T ו-B אפיתל10,11, ורשת לימפואידית המקלה על תנועת תאי T ומעקב אנטיגנים12. הדמיון בין לימפוציטים של דגי טלאוסט ליונקים הופך את D. rerio למודל חזק ב-in vivo לחקר לימפופיאזיס, תפקוד לימפוציטים ומחלות לימפואידיות, כולל לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

העבודה הקודמת שלנו הראתה כי שושלת T ו-B ALL (T-ALL, B-ALL) מופיעה בדג זברה טרנסגני, מה שהופך את הקו הזה לשימושי לחקר שני הסוגים 13,15,21,22. מגבלה עיקרית של מודלים של D. rerio ALL, במיוחד במחקרי ביטוי אורך או בדיקות סמים, היא היעדר שיטות לאיסוף דגימות ALL סדרתיות מבעלי חיים בודדים. שיטות קודמות, כמו איסוף דם רטרו-אורביטלי, היו מאתגרות טכנית בשל גודלו הקטן של D. rerio, מה שמקשה על דגימת דם סדרתית23. לכן, רוב החוקרים מבצעים המתת חסד לדגי זברה כדי להשיג את כל התאים. זו הייתה פרקטיקה נפוצה במעבדה וברוב האנשים בתחום, אך היא מונעת את היכולת לבצע ניסויים לאורך זמן על בעלי חיים חיים. כדי להתגבר על כך, תיארנו לאחרונה לימפוציטים אפיתליים מסוג T ו-B בקשקשי דגי זברה שנאספו באמצעות אסטרטגיית ביופסיה לא קטלנית10. מחקר נוסף לאחרונה הראה מאגר תאי T על/ליד פני השטח של דג הזברה, בין קשקשיםסמוכים 12. ל-D. rerio יש מאות קשקשים, המתחדשים במהירות ימים ספורים לאחר ההסרה24. יחד, ממצאים ותכונות אלו מצביעים על כך שקשקשי דגי זברה הם מקור ללימפוציטים שאינם דורשים המתת חסד, מה שמאפשר מחקרים לאורך זמן בדגים חיים.

כאן, אנו מתארים שיטת ביופסיה בקנה מידה לאיסוף לימפוציטים אפידרמליים של דגי זברה מדגים עם סמנים פלואורופוריים ייחודיים ללימפוציטים, עם או בלי ALL. כדי לחקור תאי קו T, השתמשנו בדגי lck:GFP מבוססים היטב ובקו דומה של lck:mCherry; שניהם מתייגים T ותאי T-ALL 10,13,15,20. כדי לחקור תאי שושלת B, השתמשנו בדגים טרנסגניים cd79a:GFP ו-cd79b:GFP עם תאי B ו-B-ALLמסומנים פלואורסצנטית 10,13,17. כל אחד מהקווים הללו מאפשר ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וטיהור תאי זרימה ציטומטרית13. בדקנו קשקשים לאחר הביופסיה, יצרנו תמונות ברזולוציה גבוהה של לימפוציטים בקשקשים, זיהינו ביטוי גנים של לימפוציטים אפידרמליים באמצעות qRT-PCR, השווינו לזה של לימפוציטים מרקמות לימפואידיות אחרות של אותו דג, וכימות לימפוציטים לפי סולם באמצעות ציטומטריית זרימה/מיון תאים מופעל על ידי פלואורסנציה. לסיכום, הפרוטוקול מתאר שיטה פשוטה ומעשית להשגת לימפוציטים מדגי זברה חיים, כולל דגימה של בעלי חיים בודדים לאורך נקודות זמן מרובות ברצף ניסוי. שיטה זו מיועדת לחקור את ביולוגיית הלימפוציטים של דגי זברה, התקדמות לוקמיה, תגובות תרופות, או עיצובים ניסויים לאורך זמן אחרים שדורשים דגימה חוזרת של דגי זברה בודדים. פיתחנו את הפרוטוקול באמצעות דגי זברה טרנסגניים בוגרים עם אוכלוסיות לימפוציטים מסומנות פלואורסצנטית, ואישרנו אותו ליישומים במורד הזרם, כולל מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ציטומטריית זרימה/מיון תאים מופעלים על ידי פלואורסצנציה, ניתוחי ביטוי RNA ומחקרים נוספים ב-ex vivo הדורשים לימפוציטים ברי קיימא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (פרוטוקולים 24-028-EAH ו-25-068-EACHIR). פרוטוקול זה מציג גישה לבידוד וניתוח לימפוציטים תקינים ו/או ממאירים מקשקשי דגי זברה חיים, עם פרטים על המטרה, הביצוע והעקרונות שמאחורי פרוצדורות אלו.

אזהרה: MS-222 הוא חומר הרדמה כימי מסוכן ויש לטפל בו באמצעות ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כגון כפפות מעבדה, מגן עיניים ומעיל מעבדה. השלכת תמיסות MS-222 בהתאם להנחיות הפסולת הכימית המוסדית. נהגו בזהירות בעת טיפול במחטים ומלקחיים כדי למנוע פציעות חדות. יש לשקול את כל הדגימות הביולוגיות שעשויות להיות מסוכנות ביולוגית ולהיפטר מהפסולת בהתאם לנהלי הבטיחות הביולוגית המוסדיים.

1. הכנת מדיה מיון

  1. תוסף 1× תמיסת מדיה RPMI 1640 עם 1% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    הערה: מדיה RPMI 1640 שומרת על חיוניות הלימפוציטים מחוץ לחיים. ניתן להחליף את RPMI 1640 ב-0.9× PBS. סרום בקר עוברי (FBS) מספק גורמי גדילה לקידום חיוניות תאית. פניצילין וסטרפטומיצין מגבילים זיהום חיידקים.
  2. המדיה של Aliquot לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל בנפח של 500 מיקרוליטר, כאשר כל צינור מיועד ל-10–20 סולמות. שמור על מיון צינורות המדיה על הקרח.

2. הרדמה לדגי זברה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, והדמיה

  1. הרדמו את D. rerio עם טריקאין מתנסולפונאט (MS-222) עם בופר (MS-222) שהוכנה לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיות, תוך שימוש במים ממערכת הדגים.
  2. לאחר ההרדמה, מניחים בעדינות את הדג בצלחת גידול תאים עם מספיק מים במערכת (ועוד 0.02% MS-222) לשמירה על לחות במהלך הטיפול הבא.
  3. בדקו וצילמו דגים מורדמים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי לזיהוי פלואורסצנציה מהגנים הטרנסיים. שלב זה מזהה סולמות פלואורסצנטיים לביופסיה.
    הערה: קווים חסרי טרנסגנים פלואורסצנטיים ניתנים לצפייה במיקרוסקופיה אור סטנדרטית.
  4. השתמש בפלואורסצנציה לזיהוי תאי T (lck:GFP או lck:mCherry fish) או T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP או lck:mCherry fish). תאי שושלת T הם פלואורסצנטיים בבהירות בקווים אלו; תאי B-ALL הם בעלי פלואורסצנציה עמומה ברקעים lck:GFP ו-lck:mCherry 13,15,21.
  5. סקר B-lineage – מסומן cd79a:GFP או cd79b:GFP דגים (עם או בלי rag2:hMYC) לתאי B אפידרמליים ו/או B-ALL, תוך שימוש ב-GFP לבחירת סולמות לביופסיה.
  6. תרגל מיקום דג זברה והתאמת הגדרות מיקרוסקופ לפני ביופסיה, אם רוצים הדמיה
    הערה: הדמיה וביופסיה דורשות 5–7 דקות של הרדמה באמצעות MS-222 של 0.02%. מעקב רציף אחרי התנועה האופרקולרית. אם התנועה האופרקולרית מאטה משמעותית או נפסקת, העבר מיד את הדג למים במערכת ללא הרדמה והפסק את הביופסיה. יש למרוח מחדש ~50–100 מיקרוליטר של מי דגים המכילים חומר הרדמה על העור, האופרקולום והזימים כל 1–2 דקות במהלך ההדמיה והביופסיה לשמירה על לחות פני השטח.

3. איסוף והכנת סולמות

  1. כדי למקם את הדג לביופסיה, הניחו את הדג המורדם על צידו בצלחת תרביות תאים.
  2. כדי למנוע מהדג להחליק במהלך הביופסיה, השתמשו בספוג לח עם חיתוך ליניארי או בצורת V והניחו אותו בצלחת גידול התאים כדי לחבק את הדג.
  3. חלופה נוספת היא לוודא שמפלס המים של המערכת כמעט ולא מכסה את תחתית הצלחת של תרבית התאים (מספיק כדי לשמור על לחות השטח) כדי לאפשר למתח הפנים לייצב את הדג.
  4. יש להניח מדי פעם ~50–100 מיקרוליטר של 0.02% MS-222 שהוכנה במי מערכת על האופרקולום והזימים לשמירת הלחות ולשמירה על ההרדמה במהלך הדמיה וביופסיה.
  5. בצע ביופסיה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי לבחירת סולמות פלואורסצנטיים גבוהים המועשרים בלימפוציטים או בכל התאים.
  6. אספו 10–20 קשקשים סמוכים מאזור פלואורסצנטי אחד במיוחד, רצוי בתוך הפס הפיגמנטי האופקי הראשון או השני.
    הערה: סולם אחד בדרך כלל מספיק להדמיה. אוסף של 10–20 קשקשים מניב בדרך כלל >1,000 לימפוציטים מדגי WT ומומלץ לניתוחים במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה ו-qRT-PCR.
  7. יד דומיננטית (מחט): השתמש במחט מזרקת 31 גייג', הנח בעדינות את קצה המחט מתחת לקצה האחורי של קשקש, והפך אותה קדימה (כלומר, ראש). השתמש במחט סטרילית שונה לכל דג. מלקחיים נקיים בין דגים; לעקר אם נדרש על פי נהלים מוסדיים.
    הערה: הרמת המשקל עם מחט עדיפה על שימוש במלקחיים בלבד, שכן היא מעלה את הקשקשים כדי למזער גירוד על פני השטח. דבר זה מבטיח שהשכבה העדינה מתחת לקשקשים תישאר דבוקה לפני השטח של הקשקשים, דבר קריטי למקסום תפוקת התא.
  8. יד לא דומיננטית (מלקחיים): החזקת המשקל במצב הפוך קדימה עם המחט, אוחזת במשטח החיצוני הקשיח של הקשקשים עם מלקחיים. בתנועה חלקה, שלף את הקשקש מהכיס שלו.
    הערה: דימום קל עשוי להתרחש באתרי עקירת קשקשים, שבדרך כלל מוגבל בעצמו.
  9. אם יש דימום מופרז, יש להפעיל לחץ עדין עם מלקחיים ולשטוף בקצרה עם 0.02% MS-222 במי המערכת.
    הערה: ניתן להשיג המיסטזיס תוך שניות לפני המעבר לסולם הבא.
  10. כדי לבצע ביופסיה של מספר קשקשים, יש לאסוף 10–20 קשקשים לכל דג, ולהסיר קשקשים סמוכים מאזור רציף בפס פיגמנטלי אופקי, במקום מספר אזורי גוף או משני צידי בעל החיים.
  11. קטו קשקשים בודדים ברצף ושמרו אותם על קצות המלקחיים במהלך האיסוף כאשר משטח הקשקשים המדיאלי פונה כלפי מעלה.
  12. כדי למנוע הפרעה של קשקשים מצטברים בהסרת הקשקשים לאחר מכן, הפוך כל קשקש קדימה תחילה ואז אחוז בו בקצה האחורי שלו. העבר את הקשקשים לצינור המכיל מדיום מיון לאחר איסוף כל 5 קשקשים, או כאשר לא ניתן לשמור קשקשים נוספים בקצות המלקחיים.
  13. לאחר איסוף בקנה מידה, עבדו דגימות במהירות המרבית. העבר מיד קשקשים מהמלכודות לצינורות בגודל 1.5 מ"ל המכילים 500 מיקרוליטר של מדיום מיון קר על קרח כדי לשמור על חיוניות התא. ניקו מלקחיים בין דגים באמצעות 70% אתנול לפני איסוף הדגימות הבאות. עיבוד קשקשים מכל דג בצינורות נפרדים במהלך האיסוף, הדיסוציאציה ולניתוחים במורד הזרם.
  14. לאחר איסוף הקשקשים, העבר מיד את הדגים למיכל חילוץ עם מים מתוקים במערכת ללא MS-222.
  15. לעקוב אחרי תנועות אופרקולריות והתנהגות שחייה עד לשיקום הנשימה והיציבה התקינה. יש לעקוב אחרי אתר הביופסיה לאיתור דימום מתמשך או סימני מצוקה לפני החזרת הדגים למערכת המחזורית.
  16. החזירו את הדג לאקווריום הבית שלו לאחר שיווי משקל רגיל ושחייה חוזרת.

4. דיסוציאציה וסינון של תאים

  1. בדוק את הקשקשים בתחתית הצינור. קשקשים נראים בקלות לעין בלתי לפני הניתוק. הפרדה של קשקשים באמצעות הומוגניזר עלי פלסטיק סטרילי מיקרו-צינור על ידי הפעלת לחץ ידני עדין ומבוקר למשך 30–60 שניות.
  2. השתמש בתנועה סיבובית איטית ותנועה למעלה ולמטה כדי לשחרר תאי אפידרמה תוך הימנעות מגזירה מופרזת של הקשקשים.
  3. להמשיך בניתוק עד שמדיה המיון הופכת לעקומה לעין.
    הערה: הצלחת ההליך מתבטאת בכך שהמדיה הופכת לעכורה, מה שמעיד על ריכוז גבוה של תאים משוחררים במצב תלוי.
  4. העבר דגימות הומוגניות דרך מסנן רשת ניילון בגודל 35 מיקרון להסרת פסולת ויצירת תליות חד-תאיות למיון תאים מופעלים על ידי ציטומטריית זרימה/פלואורסצנציה.
  5. אם קיימות אגגטים נראים של תאים לאחר הסינון הראשוני, העבר את הדגימה שוב דרך מסנן רשת חדש של 35 מיקרון מיד לפני ניתוח ציטומטרי זרימה. יש לחזור על סינון לא יותר מפי 2 בסך הכל כדי למזער אובדן תאים.

5. ניתוח ציטומטרי זרימה

  1. ניתוח דגימות באמצעות ציטומטריית זרימה.
    הערה: ניתן לבצע ציטומטריית זרימה לפני טיהור מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה או חילוץ RNA כדי להעריך את הרכב הדגימה.
  2. ניתחו תליות חד-תאיות באמצעות ציטומטר זרימה המצויד בלייזר 488 ננומטר לזיהוי GFP ולייזר 561 ננומטר לגילוי mCherry.
  3. החריגו פסולת באמצעות פרמטרים של פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (SSC). זהה לימפוציטים באמצעות שערי הלימפוציטים שתואר קודםלכן 10,13,21.
  4. יש להוציא אגרגטים של תאים באמצעות פרמטרים של שער יחיד (כלומר, אזור SSC [SSC-A] לעומת SSC-גובה [SSC-H]).
  5. הערכו את חיוניות התאים באמצעות פרופידיום יודיד (PI) או צבע חי/מת מקביל. להוציא תאים חיוביים ל-PI מניתוחים והליכי מיון עתידיים.
  6. הקמת שערי פלואורסצנציה באמצעות בקרות דגי זברה לא טרנסגניות ובקרות טרנסגניות פלואורסצנטיות חד-צבעוניות. הגדר אוכלוסיות חיוביות ל-GFP ו-mCherry חיוביות ביחס לקבוצות ביקורת שליליות.
  7. ייצוא קבצי תקן ציטומטריית זרימה (FCS) וניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה.

6. מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה

  1. למיון תאים, השתמש במיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה המצויד בלייזרים של 488 ננומטר ו/או 561 ננומטר לזיהוי GFP ו-mCherry.
  2. לימפוציטים בדרגה (FSC/SSC), סינגלטים (SSC-A מול SSC-H), ותאים חיים (PI-שליליים) לפני מיון מבוסס פלואורסצנציה.
  3. הגדר אוכלוסיות חיוביות GFPlo,GFP hi ו-mCherry באמצעות שערי פלואורסצנציה שנקבעו מדגימות בקרה שליליות.
  4. מיין אוכלוסיות חיוביות GFPlo,GFP hi ו-mCherry לצינורות איסוף המכילות מדיה מיון מקוררת.
    הערה: בעבודה זו עם קו lck:GFP, תאים בעלי GFP גבוה (GFP hi) לעומת GFP נמוך (GFP lo) הם שושלות לימפוציטים מובחנות, כפי שתוארו קודם 10,13,15,21.
  5. שמרו דגימות ממוינות על קרח והמשיכו מיד ליישומים במורד הזרם, כגון בידוד RNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בהתאם לשלבים הנ״ל, הרדמנו וסקרנו דגי זברה בוגרים לזיהוי לימפוציטים פלואורסצנטיים או ALL באמצעות מיקרוסקופיה. דגי LCK:GFP מסוג בר (WT) הראו פלואורסצנציה בעיקר באזור התימי, בעוד שדגי cd79b:GFP הראו פלואורסצנציה באזור הראש/זימים, בהתאם לתצפיות קודמות10 (איור 1A, משמאל). לעומת זאת, דגי rag2:hMYC; lck:GFP/lck:mCherry עם T-ALL או rag2:hMYC + cd79b:GFP עם B-ALL הראו פלואורסצנציה בהירה ומפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטת ביופסיית קשקשים לא קטלנית לאיסוף לימפוציטים אפידרמליים של דגי זברה, הכוללים גם לימפוציטים לא ממאירים וגם תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL). דגי זברה הם מודלים מבוססים היטב ללימפופיאזיס ולמאירויות לימפואידיות, אך רוב הגישות להשגת לימפוציטים דורשות המתת חסד וניתוח רקמות, מה שמונע מחקרים אורכיים של בעלי חיים בודדים 8,10,13,15. קשקשים מציעים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים פיננסיים.

תודות

אנו מודים לאמירה חסן, M.B.B.S., Ph.D., ולבראשה ווד על תרומתם לפרויקט זה. המחקרים נתמכו על ידי תוכנית המענק הפיילוט של מרכז הסרטן סטיבנסון של OUHSC, מרכז אוקלהומה למחקר תאי גזע בוגרים (OCASCR), תוכניות צוות המדע והסיוע של קרן הבריאות הפרסביטריאנית, וקרן משפחת W.J. Jones. FACS על ידי מרכז הסרטן סטפנסון למחקר ביולוגיה מולקולרית וציטומטריה, מומנה על ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן של NCI P30 CA225520. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מימון מהאגודה האמריקאית לסרטן (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). אימאן אוונס היא חוקרת תוכנית "STRONG" לאחר תואר ראשון ב-ACS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרים צריכה ותגובנים:
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521חומר הרדמה
RPMI 1640 mediumThermoFisher11875093תווך לקיום לימפוציטים
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442לקיום תאי
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122הגבלת זיהום חיידקי
70% ethanolThermoScientificT038181000להעיקור פורפס
CellPro 1x PBSVWR104027-280לדלל ל-0.9x עם מים סטריליים
Propidium IodideInvitrogenP1304MMPהפרדה בין תאים חיים למתים לצורך זרימה/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Size: 12 x 12 IN. 35um filter paper
Lab Pak 03-35/16		Sefarלמיון תאים
הפניה: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating malignant and non-malignant b cells from lck:Egfp zebrafish. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
אלטרנטיבה לנייר סינון: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342למיון תאים
Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1.5 mlEppendorf®20901-551צינור מיקרוצנטריפוגה למיון תאים
UltiCare VetRx U-100 Insulin Syringes 3/10cc 31G x 5/16" Half Unit MarkingUltiCare9436לביופסיות קטנות
100 x 25 mm Deep Petri DishUSA Scientific8609-0625לביופסיות קטנות
Bel-Art® Disposable PestlesBel-Art® BAF199230001לניתוק קשקשים
E-Z Pik 6-Piece Tweezer SetAven18480EZלביופסיות קטנות
Corning® microscope slides, frosted one side, one endSigma-AldrichCLS294875X25להדמיה
Cover glassesSigma-AldrichC8181להדמיה
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, with DAPIThermoFisherS36920להרכבת קשקשים על גלילה
RNeasy Mini Kit Qiagen74104להפקת RNA
ציוד:
Nikon AZ100 microscope and DS-Qi1MC cameraNikonמיקרוסקופ פלואורוסנטי ומצלמה
CFX96 Touch-PCR SystemBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-Coulterניתוח ציטומטריה של זרימה
Leica SP8Leicaמיקרוסקופ קונפוקלי
תוכנה:
Kaluza Analysis software version 2.1Beckman-Coulterניתוח ציטומטריה של זרימה
הפניה: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
LAS-X software version 3.7.4.23463Leicaמיקרוסקופ קונפוקלי
הפניה: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

מקורות

  1. Egawa G, Kabashima K. Skin as a peripheral lymphoid organ: revisiting the concept of skin-associated lymphoid tissues. J Invest Dermatol. 2011;131(11):2178–85.
  2. Matejuk A. Skin immunity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66(1):45–54.
  3. Zhang C, Merana GR, Harris-Tryon T, Scharschmidt TC. Skin immunity: dissecting the complex biology of our body's outer barrier. Mucosal Immunol. 2022;15(4):551–61.
  4. Kupper TS, Fuhlbrigge RC. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):211–22.
  5. Lafouresse F, Groom JR. A task force against local inflammation and cancer: lymphocyte trafficking to and within the skin. Front Immunol. 2018;9:2454. doi:10.3389/fimmu.2018.02454
  6. Danilova N, Bussmann J, Jekosch K, Steiner LA. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nat Immunol. 2005;6(3):295–302.
  7. Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(19):6919–24.
  8. Page DM, et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 2013;122(8)–e11.
  9. Sunyer JO. Evolutionary and functional relationships of B cells from fish and mammals: insights into their novel roles in phagocytosis and presentation of particulate antigen. Infect Disord Drug Targets. 2012;12(3):200–12.
  10. Park G, et al. Diverse epithelial lymphocytes in zebrafish revealed using a novel scale biopsy method. J Immunol. 2024;213(12):1902–14.
  11. Zhou Q, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793
  12. Robertson TF, et al. A tessellated lymphoid network provides whole-body T cell surveillance in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20). doi:10.1073/pnas.2301137120
  13. Park G, et al. Zebrafish B cell acute lymphoblastic leukemia: new findings in an old model. Oncotarget. 2020;11(15):1292–305.
  14. Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg) 1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431–43.
  15. Borga C, et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 2019;33(2):333–47.
  16. Tian Y, et al. The first wave of T lymphopoiesis in zebrafish arises from aorta endothelium independent of hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2017;214(11):3347–60.
  17. Liu X, et al. Zebrafish B cell development without a pre-B cell stage, revealed by CD79 fluorescence reporter transgenes. J Immunol. 2017;199(5):1706–15.
  18. Wan F, et al. Characterization of gamma delta T cells from zebrafish provides insights into their important role in adaptive humoral immunity. Front Immunol. 2016;7:675. doi:10.3389/fimmu.2016.00675
  19. Moore FE, et al. Single-cell transcriptional analysis of normal, aberrant, and malignant hematopoiesis in zebrafish. J Exp Med. 2016;213(6):979–92.
  20. Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369–74.
  21. Burroughs-Garcia J, et al. Isolating malignant and non-malignant B cells from lck zebrafish. J Vis Exp. 2019;(144):59191. https://www.jove.com/t/59191/isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish
  22. Borga C, et al. Molecularly distinct models of zebrafish Myc-induced B cell leukemia. Leukemia. 2019;33(2):559–62.
  23. Pugach EK, Li P, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. 2009;(34):1645. https://www.jove.com/t/1645/retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish
  24. Iwasaki M, Kuroda J, Kawakami K, Wada H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 2018;437(2):105–19.
  25. Traver D, et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 2003;4(12):1238–46.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

234234ALL
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.