מאמר שיטה

כיוון Cas9 לביצוע ניסויי הצלה (Rescue) בתאי HEK293 עם נוק-אאוט שהועברו טרנסדוקציה יציבה

93 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72172

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מסיר את חלבון ה-Cas9 לאחר עריכה גנומית כדי לאפשר ניסויי הצלה (rescue) חסונים בקווי תאים עם נשקיב (knockout) שעברו טרנסדוקציה יציבה.

תקציר

טכנולוגיית עריכת הגנים CRISPR-Cas9 חוללה מהפכה בביולוגיה מולקולרית. לעיתים קרובות, טכנולוגיה זו משמשת למחיקת גן המקודד לחלבון מדומה. הפנוטיפ שנוצר מספק תובנות בעלות ערך לגבי תפקוד החלבון. ניתן לאשר את החשיבות התפקודית של חלבון המטרה על ידי הכנסה מחדש של החלבון כדי לשחזר את התפקוד שאבד (rescue). פעולה זו משיגה בדרך כלל על ידי הכנסת ה-cDNA המקודד לחלבון באופן trans באמצעות וקטור ביטוי. עם זאת, בקווי תאים עם knockout המבטאים באופן יציב את מערכת CRISPR-Cas9, פלסמיד הביטוי שהוכנס לאחרונה עשוי להיחתך גם הוא על ידי Cas9. הפרוטוקול המוצג כאן מספק אסטרטגיה לעקיפת מחסום פוטנציאלי זה בניסויי שחזור. גישה זו מודגמת באמצעות תאי HEK293 שבהם הגן המקודד לחלבון הפיגום E3 ubiquitin ligase CUL4B הופסקו על ידי CRISPR-Cas9. טרנסדוקציה של תאים אלו עם RNA מנחה (gRNA) המכוון לטרנסגן Cas9 המשולב הובילה לאובדן של חלבון Cas9 גילוי. השמדת Cas9 אפשרה את השחזור של ביטוי ותפקוד CUL4B בעקבות הכנסת פלסמיד ביטוי של CUL4B. תוצאות אלו מספקות הוכחת היתכנות לגישה רחבה ללימוד תפקוד חלבונים באמצעות ניסויי שחזור.

מבוא

CRISPR-Cas9 הוא כלי רב-עוצמה לעריכה גנומית, המופק ממערכת חיסון אדפטיבית המתרחשת באופן טבעי ומשמשת פרוקריוטים להגנה מפני זיהום בבקטריופאג. הודות לעלות הנמוכה, לשיעור ההצלחה הגבוה וקלות השימוש, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 עלתה על כלים אחרים לעריכה גנומית, כגון נוקלאזות אצבעות אבץ (ZFNs) ונוקלאזות TALENs (transcription activator-like effector nucleases), לצורך מודיפיקציה גנטית מדויקת, ובמיוחד בתרביות תאים. המערכת הדו-רכיבית מורכבת מנוקלאזת Cas9 ומ-RNA מדריך (gRNA). באמצעות זיווג בסיסים של ווטסון-קריק, ה-gRNA מכוון את Cas9 למטרה גנומית הסמוכה לרצף PAM (protospacer adjacent motif). רצף ה-PAM משמש כאתר זיהוי קריטי המאפשר את פעילות הנוקלאזה. באתר זה, Cas9 יוצר שבירה של שני הגדילים (DSB). בהיעדרה של תבנית תיקון הומולוגית, התא מתקן את ה-DSB באמצעות חיבור קצוות לא הומולוגי (NHEJ). מנגנון תיקון זה עלול להוביל להחדרות או למחיקות (indels), הגורמות למוטציות של הזזה במסגרת הקריאה (frameshift mutations) ולביטול תפקודי (knockout) של הגן המטרה. לפיכך, שיבוש הגן המטרה מושג על ידי החדרת Cas9 יחד עם gRNA מהונדס. רצף ה-gRNA בן 20 הנוקליאוטידים הוא משלים לאתר גנומי הסמוך באופן מיידי ל-PAM. האובדן התפקודי הנובע מכך של הגן המטרה חושף את תפקידיו הספציפיים של אותו גן בתהליכים תאיים1.

ניסוי הצלה, או בדיקת קומפלמנטציה (השלמה), כולל השבה של החלבון החסר כדי להדגים היפוך של הפנוטיפ שנצפה. גישה זו משמשת כבקרה קפדנית כדי לשלול השפעות ניסיוניות בלתי מכוונות, כגון אלו הנובעות ממחיקות CRISPR-Cas9 של 'מטרות שאינן רלוונטיות' (off-target). השיטה הנפוצה ביותר להחדרה מחדש של חלבון עניין היא באמצעות טרנספקציה או טרנסדוקציה של וקטור ביטוי חיצוני. עם זאת, DNA מוכרס זה רגיש לאותה מיקוד של CRISPR-Cas9 כמו הלוקוס האנדוגני. סיכון זה גבוה במיוחד בקווי תאים שעברו טרנסדוקציה יציבה, שבהם ביטוי קונסטיטביבי של Cas9 משולב עם סלקציה אנטיביוטית כדי להבטיח אוכלוסיית נטרון (knockout) הומוגנית ועקבית; אסטרטגיה הנדרשת לעיתים קרובות בקווי תאים שקשה לבצע להם טרנספקציה או טרנסדוקציה, כגון תאים ממקורי מערכת החיסון, המערכת ההמטופואטית או שושלות עצביות.

שיטה אחת לעקיפת כיוונון הווקטור היא החדרת mRNA אקסוגני המקודד עבור החלבון המבוקש, ובכך עוקפים את השסע המתווך על ידי Cas9 ואת הצורך בתעתוק גרעיני. עם זאת, בהשוואה ל-DNA פלסמידי, ייצור של mRNA סינתטי הוא יקר יותר, הוא פחות יציב מטבעו, והוא מניב ביטוי חולף מאוד. יתרה מכך, הוא דורש מודיפיקציות כימיות ספציפיות כדי למנוע הפעלה של תגובות חיסוניות מולדות בציטוזול2.

כדי למנוע התגבשות של קומפלקס Cas9/gRNA על פלסמידי ביטוי, ניתן להשתמש בהנדסת בסיסי wobble ברצף המקודד. על ידי ניצול הדגנרציה של הקוד הגנטי, ניתן להחדיר מוטציות סינונימיות כדי לבטל את רצף ה-PAM הנדרש ו/או לשבש את המשלימות של ה-gRNA מבלי לשנות את רצף חומצות האמינו של החלבון המקודד. עם זאת, השימוש במוטציות סינונימיות אינו חף מסיכונים. שינויים אלו עלולים להוביל לשימוש בקונונים שאינם אופטימליים, מה שעלול לשבש את קינטיקת התרגום ולהוביל לקיפול לקוי של החלבון, לירידה ביציבות ה-mRNA, או לשינויים מזיקים במבנה השניוני של ה-RNA3,4. למרות שזה קורה בתדירות נמוכה יותר, השלכות פוטנציאליות נוספות כוללות החדרת אותות פוליאדנולציה חבויים, שיבוש של מוטיבים רגולטוריים פוסט-טרנסקריפציונליים, ועלייה בצפיפות CpG5,6. יתרה מכך, רצפים מהונדסים עלולים לעורר בטעות תגובות למעיכה תאית אם מבנה ה-mRNA שנוצר מפריע להתקדמות הריבוזום7,8.

מעבר לאתגרים הקשורים לשימוש ב-mRNAs סינתטיים או להנדסת wobble-base, ביטוי קונסטיטוטיבי של Cas9 לאחר העריכה מכניס מספר משתנים מבלבלים לבדיקות המשך. מכיוון שהספציפיות של Cas9 עלולה להיות לא מושלמת, ביטוי מתמשך מגביר את הסבירות לשבירה של off-target, מה שמוביל לצבירה של מוטציות לא מכוונות לאורך זמן9,10,11. יתרה מכך, מעקב גנומי כרוני ו-DSBs חוזרים עלולים לעורר תגובה מתמשכת לנזקי DNA, שדוחפת בסופו של דבר תאים לעצירת מחזור התא, להזדקנות (senescence) או לאפופטוזיס12,13. ייצור קונסטיטוטיבי זה מטיל גם עומס מטבולי, ובכך מחזק סחף קלונאלי (clonal drift) שבו תאים בעלי ביטוי נמוך דוחקים תאים בעלי ביטוי גבוה, מה שמוביל לרמות לא עקביות של הטרנסגן לאורך מעברים רצופים. לבסוף, כחלבון פרוקריוטי גדול, Cas9 עלול לעורר סטרס באמצעות סיגנל של מערכת החיסון המולדת או להעמיס על מנגנון הפרוטאוסטזיס של המארח, ובכך להשריץ את תגובת החלבון הבלתי מקופל (unfolded protein response)14,15,16.

כדי לצמצם סיבוכים אלו, פותחו מספר אסטרטגיות לעיכוב חולף של Cas9, כולל חלבונים מסוג Anti-CRISPR (Acrs) ממקור פאגי17,18, מעכבים של מולקולות קטנות או מערכות המחוברות לדגרונים כמו PROTACs19,20, ומנגנוני בקרה אופטוגנטיים19,21. עם זאת, גישות אלו מציבות מכשולים מעשיים המגבילים את תועלתן עבור בדיקות הצלה (rescue assays). Acrs מעכבים באמצעות חיקוי מולקולרי ולכן דורשים אופטימיזציה סטוכיומטרית לצורך דיוק. Acrs עלולים גם להחמיר את אותם מאמצים פרוטאוסטטיים ואימונוגניים הקשורים לביטוי יתר של Cas9. מודולציה כימית מביאה עמה מורכבויות פרמקוקינטיות, פוטנציאל לציטוטוקסיות, ו"אפקט וו" (hook effects) הקשור ל-PROTACs, שבו ריכוזי ליגנד גבוהים מדי מונעים באופן פרדוקסלי היווצרות יעילה של קומפלקס טרנרי22. פלטפורמות אופטוגנטיות מוגבלות על ידי פוטוטוקסיות תאית והצורך בחומרה ייעודית לשמירה על אספקת אור עקבית19,21. חשוב לציין כי מכיוון ששיטות אלו מספקות עיכוב זמני או הפיך בלבד, הן לרוב אינן מספיקות ליישומים שבהם Cas9 מבוטא באופן קונסטיטוטיבי.

בניגוד לכך, מערכות CRISPR בעלות השבתה עצמית מציעות פתרון קבוע על ידי שיבוש אוטונומי וסופי של הטרנסגן Cas9 מיד לאחר עריכה מוצלחת של הגן המטרה. על ידי ביטול פעילות נוקלאז שיורית, גישה זו מגנה באופן קבוע על וקטורי הצלה עוקבים מפני שסוע, ובמקביל מפחיתה עקה פרוטאוסטטית ארוכת טווח וסחף גנומי מחוץ למטרה (off-target genomic drift). אף שניתן להעביר gRNAs מכווני-עצמית באמצעות טרנספקציות זמניות של ריבונוקלאו-פרוטאין או מבוססות ליפידים23,24, שיטות אלו נוטות לדילול ולשונות סטוכסטית, מה שמוביל לאוכלוסיית "פסיפס" שבה חלק מהתאים חומקים מההשבתה25,26,27.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, הפרוטוקול המתואר כאן רשום רחב מנצל מערכת הובלה לנטיווירלית (lentiviral) להשבתה עצמית של Cas9, ובכך מציע יתרונות מעשיים מובהקים לשינוי יציב של שורות תאים. הובלה לנטיווירלית מבטיחה ירושה מקושרת של הטרנסגן Cas9 ושל הרגולטור המכוון-עצמית שלו, ובכך מונעת ביעילות את "בריחת הדילול" האופיינית לאוכלוסיות המתחלקות במהירות. יתרה מכך, קיבולת המטען המורחבת של וקטורים לנטיווירליים מאפשרת ביטוי משותף של סמני ברירה כדי להבטיח אוכלוסייה הומוגנית נטולת Cas9, בעוד שהטרופיזם הרחב שלהם, המוענק על ידי פסאודו-טיפינג של VSV-G, מקל על הובלה ביעילות גבוהה לסוגי תאים שקשה להעביר להם טרנספקציה25,28,29.

כהוכחה להיתכנותה של שיטה זו, פרוטוקול זה מפרט את ההשבתו העצמית של Cas9 כדי לאפשר הצלה פנוטיפית של חלבון הפיגום E3 ubiquitin ligase CUL4B בתאי HEK293 עם נוק-אאוט של CUL4B30.

פרוטוקול

מחקר זה השתמש בשורות תאים אנושיות מנחלות שהפכו לאלמטליות (HEK293 ו-HEK293FT) ולא כלל משתתפים אנושיים, רקמות אנושיות ראשוניות או ניסויי בעלי חיים. לפיכך, לא נדרש אישור אתי ממוסדי.

1. יצירת מבנה לנטי-ויראלי של gRNA ספציפי ל-Cas9-

  1. הכנס את רצף ה-gRNA הספציפי ל-Cas9 (טבלה 1) לתוך הווקטור הלנטיבירילי pLentiGuide-Puro.
  2. החלף את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה בגן שנבדל מסמן העמידות ששימש לבחירת שורת התאים של CRISPR-Cas9 שעברו טרנסדוקציה יציבה.
  3. אמת את ההכנסה המוצלחת ואת דיוק הרצף הן של ה-gRNA הספציפי ל-Cas9 והן של הגן המחליף לעמידות לאנטיביוטיקה באמצעות ריצוף סנגר (Sanger sequencing) תוך שימוש בפריימרים ספציפיים לווקטור.
    הערה: בפרוטוקול זה, הגן לעמידות לפיורומיצין (PuroR) הוחלף בגן לעמידות להיגרומיצין B (HygroR) כדי ליצור את הווקטור Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro. גנים חלופיים לעמידות לאנטיביוטיקה כוללים בלאסטיצידין S (BlastR), G418/Geneticin (NeoR), וזאוסין (ZeoR).

2. ייצור לנטי-וירוס המקודד ל-gRNA ספציפי ל-Cas9

  1. זרע 2.5 × 106  תאי HEK293FT בצלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ שעברה טיפול.
    הערה: תחזק את התאים ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; גלוקוז גבוה) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) (להלן cDMEM) והדגר אותם בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לחה המכילה 5% CO2. תאי HEK293FT משמשים מכיוון שהם מייצרים טרים (titers) גבוהים יותר של לנטי-וירוסים מאשר שורות תאים אחרות המופקות מ-HEK29331.
  2. הדגר את התאים למשך 12 שעות עד שיגיעו לפחות ל-60% התמסכות (confluence) לפני הטרנספקציה.
    זהירות: בצע את כל הפעולות הכוללות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי תחת תנאי רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), תוך שימוש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים ובנהלי דה-קונטמינציה מאושרים (למשל, קבלי בטיחות ביולוגית Class II, הכלה משנית ואתנול 70%), כפי שתיארו Pauwels et al32.
  3. הכן תערובת טרנספקציה סטנדרטית של סידן פוספט (CaPhos). דלל 20 µg של DNA פלסמידי כולל במים סטריליים בדרגת ביולוגיה מולקולרית לנפח סופי של 450 µL. הוסף 50 µL של CaCl2 בריכוז 2.5 M, ולאחר מכן 500 µL של תמיסות HEPES-buffered saline בריכוז 2× (HBS; pH 7.05), כדי לקבל נפח סופי של 1 mL בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL.
    הערה: השתמש ב-DNA פלסמידי שסדרו אומת ומצוי בעיקר בצורה סופר-סלילית (supercoiled), העומד בקריטריונים הבאים לאיכות: A260/A280 = 1.8–2.0, A260/A230 = 2.0–2.2, ורמת אנדוטוקסין <0.1 EU/µg. הכן את תערובת הטרנספקציה ביחס מולרי שקול בקירוב המורכב מ-5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5.6 µg pLP1 (Gag/Pol), 3.8 µg pLP2 (Rev), ו-5.6 µg pLP/VSVG (vesicular stomatitis virus glycoprotein).
  4. ערבב היטב את תמיסת הטרנספקציה של CaPhos באמצעות פיפטינג עדין.
  5. הוסף 1 mL של תערובת הטרנספקציה של CaPhos בטפטוף לתרבית תאי HEK293FT.
  6. נער בעדינות את צלחת התרבית כדי להפיץ את קומפלקסי הטרנספקציה באופן אחיד.
  7. הדגר את התאים למשך 12 שעות.
    הערה: טרנספקציית סידן פוספט אינה מושפעת בדרך כלל מאנטיביוטיקה סטנדרטית לתחזוקה33. עם זאת, מומלץ להשתמש במצע ללא אנטיביוטיקה בשיטות טרנספקציה רגישות יותר, כגון ליפופקציה (lipofection), מכיוון שאנטיביוטיקה פולי-אניונית עלולה להפריע להיווצרות קומפלקס DNA-ליפיד34.
  8. שאב והסר את מצע התרבית.
  9. שטוף את התאים פעם אחת עם 10 mL של תמיסת PBS (phosphate-buffered saline) סטרילית בריכוז 1× בטמפרטורת החדר.
  10. שאב והסר את ה-PBS.
  11. הוסף 10 mL של cDMEM טרי בטמפרטורת החדר.
  12. החזר את התאים לאינקובטור ואפשר לחלקיקים הלנטי-ויראליים להצטבר במצע התרבית במשך 36 שעות.
    הערה: בתנאים אלו, עלפי מעריכים, סופרנאט לנטי-ויראלי לא מרוכז יניב כ-1.0 × 106 יחידות טרנסדוקציה (TU)/mL לאחר 48 שעות, אם כי יש לקבוע את הטר (titer) בפועל באופן ניסיוני כפי שתיארו Kutner et al.35 או Barde et al.36. אחסן סופרנאט לנטי-ויראלי בטמפרטורה של −80 °C למשך עד שנתיים. הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים, שכן הם עלולים להפחית את הטר הוויראלי בכ-55%37,38,39,40.

3. קציר של lentivirus המקודד עבור gRNA ספציפי ל-Cas9 והדבקה (transduction) של תאי מטרה

  1. זריעה 1.0 × 106 תאי מטרה דבקים בצלחת תרבית רקמה בעלת ציפוי בשטח של 10 ס"מ.
  2. דגרו את תאי המטרה למשך 12 שעות לפני התעתוק הלנטיבירי.
    הערה: תאי המטרה הם תאי HEK293 המבטאים באופן יציב Streptococcus pyogenes Cas9,‏ a CUL4B-gRNA המכוון ל- (טבלה 1), וגן לעמידות לפיורומיצין (PuroR). תחזק את התאים במצע cDMEM המכיל 10 µg/mL פוּרוֹמַייסין (puromycin) ואשש את שיבוש ה-CUL4B באמצעות אנליזת Western blot לפני ביטול הפעילות העצמי של Cas9. בצע את כל הניסויים הבאים באמצעות תאי HEK293 במעברים מוקדמים.ΔCUL4B תאים.
  3. אספו את המצע המכיל את הלנטי-וירוס על ידי העברה זהירה של העלייה (supernatant) מתאי היצרן HEK293FT לשפופרת קונית סטרילית של 15 מ"ל, תוך הקפדה לא להפר את שכבת התאים (cell monolayer).
    הערה: יש להשליך את תאי היצרן HEK293FT בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המקובלות32.
  4. סנטריפוגו את העלייה שנאספה במהירות של 1,000 × ג' במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לשקע תאי יצרן HEK293FT שנותרו.
  5. שאבו והשליכו את מצע התרבית מתאי ה-HEK293 שנזרעו קודם לכןΔCUL4B תאים.
  6. העבירו 7 מ"ל של עליון הלנטי-וירוס (lentiviral supernatant) המזוקק אל הצלחת בנפח 10 ס"מ המכילה את תאי ה-HEK293ΔCUL4B תאים. יש להימנע מהפרעה למשקע בתחתית מבחנת הצנטריפוגה ולהשאיר לפחות 1 מ"ל של עליון שאר כדי לצמצם את העברת תאי היצרן.
    הערה: סננו את העליון (supernatant) דרך 0.45 µm סננו, במידת הצורך, כדי להסיר תאי יצרן שאריתיים. השליכו את העליון שנותר בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית32בטיטר מוערך של 1.0 × 106 TU/mL, תדבקה (inoculum) של 7 מ"ל צפויה להוביל לכפילות זיהום (MOI) שבין 3.5 ל-5.541.
  7. דגרו את תאי ה-HEK293 שעברו טרנסדוקציהΔCUL4B את התאים למשך 24 שעות כדי לאפשר טרנסדוקציה לנטיוויראלית ואינטגרציה מלאות.
  8. שאבו והשליכו את העל-נוזל הויראלי (viral supernatant).
  9. שטפו את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של 1 סטרילי בטמפרטורת החדר× PBS.
  10. שאבו והשליכו את ה-PBS.
  11. הוסיפו 10 מ"ל של cDMEM טרי בטמפרטורת החדר.
  12. החזירו את התאים לאינקובטור וגדלו אותם במשך ארבעה ימים כדי לאפשר ביטוי של הגן התוצאה (transgene) ושיבוש על ידי Cas9.
    הערה: אם וקטור ה-gRNA של Cas9 הלנטיביראלי אינו מקודד לדיווח פלואורסצנטי, בצעו טרנסדוקציה לתרבית ביקורת (sentinel culture) מקבילה עם וקטור לנטיביראלי שנוצר באופן דומה ומבטא דווח פלואורסצנטי. השתמשו בתרבית הביקורת כדי להעריך את יעילות הטרנסדוקציה ואת תזמון הדלת הגן המטרה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית איכותנית או ציטומטריית זרימה כמותנית. במחקר זה, ביטוי GFP זוהה בקלות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ארבעה ימים לאחר הטרנסדוקציה.

4. סלקציה אנטיביוטית של תאים שעברו טרנסדוקציה של gRNA ספציפי ל-Cas9

הערה: ארבעה ימים לאחר ההעברה (transduction), התאים המטרה צריכים להיות במצב של התלכדות (confluence) או קרוב אליה, ובשל כך נדרש העברתם למכל סביבת גידול גדול יותר. בצעו את העברת התאים במקביל לתחילת הבחירה האנטיביוטית.

  1. שאבו והסילו את מצע התרבית מתאי HEK293ΔCUL4B .
  2. שטפו את התאים פעם אחת עם 10 mL של 1× phosphate-buffered saline (PBS) סטרילי בטמפרטורת החדר.
  3. שאבו והסילו את ה-PBS.
  4. הוסיפו 2 mL של תמיסת trypsin-EDTA סטרילית בטמפרטורת החדר לצלוחית התרבית.
  5. דגרו את התאים למשך 5 min כדי לעודד היפרדות.
  6. הוסיפו 8 mL של cDMEM בטמפרטורת החדר כדי לנטרל את ה-trypsin.
  7. העבירו את תרחיף התאים למבחנה קונית סטרילית של 15 mL.
  8. בצעו טריטורציה (Trituration) לתרחיף התאים 15–20 פעמים כדי לפרק את הצבירים התאיים ביסודיות.
  9. סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 × g למשך 10 min בטמפרטורת החדר.
  10. בזמן סבב התאים בצנטריפוגה, הכינו בקבוק T150 מטופל לתרבית רקמות המכיל 20 mL של cDMEM מועשר ב-250 µg/mL hygromycin B.
    הערה: ריכוז ה-hygromycin B הדרוש לסלקציה עשוי להשתנות בין סוגי תאים. בצעו עקומת הריגה (kill curve) באמצעות 50–500 µg/mL hygromycin B כדי לקבוע את הריכוז המינימלי הדרוש להשמדת כל התאים שלא עברו טרנסדוקציה תוך 7–10 ימים. אם נעשה שימוש במסמן עמידות לאנטיביוטיקה חלופי בוקטור ה-Cas9 gRNA, בצעו עקומת הריגה באמצעות 2–10 µg/mL blasticidin S, ‏400–800 µg/mL G418/Geneticin, או 50–400 µg/mL zeocin.
  11. שאבו והסילו את העלייה ללא הפרעה למשקע התאים.
  12. השביו את משקע התאים ב-10 mL של cDMEM מועשר ב-250 µg/mL hygromycin B.
  13. העבירו את 10 mL של תרחיף התאים לבקבוק ה-T150 שהוכן, המכיל 20 mL של מצע סלקציה.
  14. נערו בעדינות את הבקבוק כדי לפזר את התאים באופן שווה.
  15. דגרו את התאים תחת סלקציה למשך שלושה ימים.
  16. ביום ה-3 לסלקציה, שאבו את מצע הסלקציה והחליפו אותו ב-30 mL של cDMEM טרי מועשר ב-250 µg/mL hygromycin B.
    הערה: החלפת מצע הסלקציה מסירה תאים מתים שאינם נצמדים, מחדישה את רכיבי התזונה ושומרת על פעילות האנטיביוטיקה.
  17. המשיכו בדגירה עד ששכבת התאים השורדים מגיעה לכ-90% התמזגות (confluence), בדרך כלל לאחר ארבעה ימים נוספים.

5. תיקוף של פינוי Cas9 ושל הצלה של CUL4Bin trans

הערה: ברגע שהתאים מגיעים לכ-90% התמזגות (confluence), יש לאשר את השמדת ה-Cas9 בניסויים הראשוניים, ולהקפיא באופן מיידי אתו שאר אוכלוסיית התאים42. גישה זו מצמצמת את התפתחותם של מנגנוני פיצוי משניים.

  1. זריעה של תאי HEK293ΔCUL4B במעבר מוקדם המבטאים באופן יציב gRNA המכוון ל-Cas9 (להלן יכונה HEK293ΔCUL4BΔcas9) לארבעה בארות של פלטה בעלת 6 בארות שעברה טיפול לתרביות רקמה, בצפיפות של 2.5 × 105 תאים לבארה.
  2. זריעה של תאי HEK293ΔCUL4B לארבע בארות של פלטה נפרדת בעלת 6 בארות. זריעה של תאי HEK293 הוריים לפחות לבארה אחת נוספת כדי לשמש כביקורת.
    הערה: השתמשו בתרביות HEK293ΔCUL4B ובתרביות HEK293 הוריים כביקורות לביטוי של Cas9 ו-CUL4B, בהתאמה.
  3. דגירה של כל התרביות למשך 12 שעות כדי לאפשר היצמדות מלאה של התאים ופרוליפרציה פעילה.
  4. הכנת תערובות טרנספקציה של סידן פוספט (CaPhos) המכילות 0, 0.5, 1.0 או 2.0 µg של pCMV-FLAG-CUL4B. התאימו כל תערובת לסך קבוע של 10 µg DNA פלסמידי על ידי הוספת וקטור pCMV ריק.
  5. דילול של כל תערובת DNA במים סטריליים בדרגת ביולוגיה מולקולרית לנפח סופי של 180 µL, הוספת 20 µL של 2.5 M CaCl2, ולאחר מכן הוספת 200 µL של 2× HEPES-buffered saline (HBS; pH 7.05) כדי להגיע לנפח סופי של 400 µL בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL.
    הערה: בעת שימוש בפלסמידי ביטוי המונעים על ידי פרומוטרים חזקים (למשל, CMV), בצעו טיטול DNA כדי להשיג רמות ביטוי של חלבון הדומות לביטוי אנדוגני. השתמשו ב-DNA פלסמידי מאושר רצף, בעיקר במצב supercoiled, עם ערכי A260/A280 של 1.8–2.0, ערכי A260/A230 של 2.0–2.2, ורמת אנדוטוקסין של <0.1 EU/µg.
  6. ערבוב יסודי של כל תמיסת טרנספקציה של CaPhos באמצעות פיפוט עדין.
  7. הוספה של 200 µL מכל תערובת טרנספקציה בטיפות לבארה הייעודית המכילה תאי HEK293ΔCUL4BΔcas9. החליפו טיפים של הפיפטה בין הדגימות כדי למנוע זיהום צולב.
  8. הוספה של 200 µL שנותרו מכל תערובת טרנספקציה תואמת בטיפות לבארה הייעודית המכילה תאי HEK293ΔCUL4B.
  9. דגירה של התרביות שעברו טרנספקציה למשך 12 שעות.
  10. שאיבה של מצע התרבית מכל בארה.
  11. שטיפת התאים פעם אחת עם 1 mL של 1× PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
  12. שאיבה והשלכה של ה-PBS.
  13. הוספת 2 mL של cDMEM טרי בטמפרטורת החדר לכל בארה.
  14. דגירה של התרביות למשך 24 שעות נוספות כדי לאפשר ביטוי של CUL4B ותגובות תפקודיות במורד הזרם.
  15. קצירת התאים באמצעות פרוצדורות טריפסינציה סטנדרטיות.
  16. העברה של כל סספנזיית תאים למבחנה אישית למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL.
  17. שטיפה של כל סספנזיית תאים פעם אחת עם 1× PBS.
  18. צנטריפוגה קצרה של הדגימות ל-14,000 × g בטמפרטורת החדר כדי לשקע את התאי למשקע (pellet).
  19. שאיבה והשלכה של על-מבנה (supernatant) ה-PBS.
    זהירות: β-mercaptoethanol הוא חומר נשמר מרגז המגרה את העור ומסלקי הנשימה ובעל ריח חזק. טפלו בתמיסות מלאי במכבנת כימיקלים מאושרת תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות עמידות לכימיקלים, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. השליכו טיפים, מבחנות ופסולת מזוהמים בהתאם להנחיות המוסדיות לפסולת מסוכנת.
  20. ליזיס של כל משקע תאים ישירות ב-200 µL של Laemmli sample buffer המועשר ב-5% (v/v) β-mercaptoethanol.
  21. דנטורציה של החלבונים על ידי חימום הדגימות ב-95 °C למשך 15 דקות.
  22. הפרדה של 20–40 µg חלבון סה"כ לכל נתיב באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית של חלבונים בג'ל פוליאקרילאמיד עם נתרק דודציל סולפט (SDS-PAGE).
  23. העברה של החלבונים המופרדים לממברנת פוליבינילידן פלואוריד (PVDF).
  24. חסימה של הממברנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות תמיסת חסימה.
    הערה: הכינו את תמיסת החסימה באמצעות 5% (w/v) חלב רזה יבש או 5% (w/v) אלבומין משרת בקר (BSA) המומסים בתמיסת שטיפה סטנדרטית (0.1% Tween 20 ב-1× Tris-buffered saline או 1× PBS).
  25. שטיפת הממברנה שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם באמצעות תמיסת שטיפה סטנדרטית.
  26. דגירה של הממברנה עם נוגדנים ראשוניים נגד CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6 או α-TUBULIN למשך 12 שעות ב-4 °C עם ניעור עדין.
    הערה: דללו את הנוגדנים הראשוניים ביחס של 1:1,000 בתמיסת שטיפה סטנדרטית.
  27. הסרה של תמיסת הנוגדן הראשוני ושטיפת הממברנה שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם באמצעות תמיסת שטיפה סטנדרטית.
  28. דגירה של הממברנה עם נוגדן משני מתאים נגד IgG של עכבר או ארנב המצומד ל-horseradish peroxidase (HRP) למשך 12 שעות ב-4 °C עם ניעור עדין.
    הערה: דללו את הנוגדנים המשניים ביחס של 1:3,000 בתמיסת חסימה.
  29. הסרה של תמיסת הנוגדן המשני ושטיפת הממברנה שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם באמצעות תמיסת שטיפה סטנדרטית.
  30. מריחה של סובסטרט כימילומנסינציה משופר (ECL) באופן אחיד על פני הממברנה ודגירה למשך דקה אחת.
  31. לכידה של האותות הכימילומנסינציה באמצעות מערכת דימיג דיגיטלית.
    הערה: ניתן לאשר שיבוש גנים מוצלח, במידה ורצוי, על ידי רצף סנגר של האזור הגנומי המכוון לאחר הגברה ב-PCR של DNA גנומי מבודד43.

תוצאות

כדי להפיק שורות knockout עם מחיקת Cas9 לצורך הרכבה ניסויית (reconstitution), הופק לנטי-וירוס המקודד ל-gRNA המכוון ל-Cas9 ‏(Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro) בתאי HEK293FT באמצעות פלסמידי אריזה סטנדרטיים (pLP1, pLP2 ו-pLP/VSVG). העליון הוויראלי שהתקבל נאסף ושימש להדבקה (transduction) של תאי המטרה. הישרדות במהלך סלקציה של hygromycin B איששה הדבקה לנטי-ויראלית מוצלחת, וניתוח western blot עוקב וידא את מחיקת ה-Cas9 (איור 1).

חלבון CUL4B זוהה בקלות בתאי HEK293 הוריים, אך היה חסר בתאי HEK293ΔCUL4B ו-HEK293ΔCUL4BΔcas9 שעברו טרנספקציה בוקטור ריק. בהתאם לאובדן של CUL4B, WDR5 ו-CDC6 הראו את העליות והירידות הצפויות בביטוי במצב יציב (steady-state), בהתאמה, מה שמאשר את שיבוש תפקודו של CUL4B. חלבון Cas9 זוהה בתאי HEK293ΔCUL4B אך לא ניתן היה לזיהויו בתאי HEK293 הוריים ובמתי HEK293ΔCUL4BΔcas9 , מה שמאשר את השבתו המוצלחת של Cas9. כצפוי, טרנספקציה של פלסמיד ביטוי של CUL4B לתאי HEK293ΔCUL4B הובילה לשחזור מינימלי בלבד של ביטוי חלבון CUL4B. לעומת זאת, ביטוי חזק של CUL4B נצפה לאחר טרנספקציה של תאי HEK293ΔCUL4BΔcas9, בליווי שחזור של ביטוי חלבונים במורד המסלול, כפי שניתן לראות ברמות מופחתות של WDR5 ורמות מוגברות של CDC6. יחד, ממצאים אלה מדגימים כי השבתת Cas9 מאפשרת שחזור יעיל של ביטוי ותפקוד של CUL4B על ידי מניעת שסוע של פלסמיד ההצלה המתווכת על ידי Cas9 (איור 2).

figure-results-1
איור 1: זרימה ניסיונית עבור השביתה האסטרטגית של Cas9 ותיקוף של הצלה (rescue) של CUL4B. זרימה זו מתארת את יצירת תאי CRISPR knockout עם Cas9 משובת על ידי טרנספקציה משותפת של תאי יצרן HEK293FT עם pLP1, pLP2, pLP/VSVG, וקונסטרוקט Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro באמצעות טרנספקציית סידן-פוספט. הנוזל העליון הלנטיויראלי המתקבל נאסף, עובר סנטריפוגציה כדי להסיר תאי יצרן שאריים, ומשמש לטרנסדוקציה של תאי מטרה. לאחר סלקציה, השביתה המוצלחת של Cas9 מאושרת באמצעות אנליזת western blot כדי לבסס שורת תאי knockout נקייה המוכנה לשחזור ניסיוני של CUL4B. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-2
איור 2: השבה (Rescue) של ביטוי ותפקוד של CUL4B בתאי HEK293 שנערכו באמצעות CRISPR-Cas9. (A) תרשים ניסיוני של תהליך הטרנספקציה. תאי HEK293ΔCUL4B   ותאי HEK293ΔCUL4BΔcas9 עברו טרנספקציה עם וקטור ריק או עם כמויות עולות של pCMV-FLAG-CUL4B. התאים נאספו 36 h לאחר הטרנספקציה, וחלבונים מהליזט הופרדו ב-SDS-PAGE. (B) ניתוח Western blot של יעילות ההשבה ובקרות תפקודיות במורד המסלול. החלבונים המצוינים הודגמו באמצעות Western blot. WDR5 ו-CDC6 שימשו כבקרות לתפקוד של CUL4B. α-TUBULIN שימש כבקרת טעינה. תאי HEK293 הוריים שימשו כביקורת לביטוי הבסיס. התמונות מייצגות ניסויים חוזרים (n = 2). אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגן המטרהרצף gRNA (5'′→3′)PAM (5′→3′)מיקום המטרהתיאור המטרה
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 אקסון 3האזור הקצבי-N של ה-ORF של CUL4B אנושי עבור נוק-אאוט מסוג הזזה של מסגרת הקריאה (frame-shift knockout)
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)אזור פנימי שמור של התראנסגן cas9 להשראת מוטציות מסוג indels המביאות לביטול פעולה עצמי

טבלה 1: רצפי RNA מנחה של CRISPR-Cas9 ומפרטי מטרה גנומיים.

דיון

פרוטוקול זה אפשר שחזור חסון של ביטוי ותפקוד של חלבון מטרה בקווי תאי knockout שנערכו באמצעות CRISPR-Cas9, שבהם Cas9 הוסר לאחר העריכה. תצפית בולטת מעבודה זו היא המידה המשמעותית שבה ביטוי קוסטטיבי של Cas9 מדכא ביטוי של טרנסגן המונע על ידי פלסמיד. עוצמתו של פרוטוקול זה טמונה ביכולתו להחזיר הן את החלבון שאבד והן את הפנוטיפ הקשור אליו. שיטה זו מבססת גם מסגרת לחקירה פנוטיפית של מגוון רחב של שינויים בחלבונים. לדוגמה, הכנסת וריאנט פוספומימטי (למשל, סרין לחומצה אספרטית) עשויה לספק תובנה בעלת ערך לגבי תפקידה של אותה מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית ללא הרקע המבלבל של החלבון המקורי.

כתוצאה מכך, פרוטוקול זהו רלוונטי באופן רחב לקווי תאים סטנדרטיים נצמדים (למשל, HeLa, A549) ומתלים (למשל, Jurkat, THP-1). עם זאת, מסגרת ברירה עקיפה זו עשויה להתברר כלא מעשית עבור תאים ראשוניים או תאים שאינם מתחלקים (למשל, נוירונים ראשוניים או מקרופאגים). במערכות רגישות אלו, הפינוי המהיר של תאי שכן שאינם עברו טרנסדוקציה משחרר פסד קריאטוקסי ואותות סטרס פרו-אפופטוטיים לסביבה המיקרוסקופית המשותפת, מה שמוביל לרעילות עקיפה46,47. באופן דומה, השיטה עשויה להיכשל בקווי תאי סרטן אנאuplואידיים בעלי יכולת הסתגלות גבוהה (למשל, גליובלסטומה U87 או מלנומה A375), הנוטים לחמוק מפנוטיפים מתווכי-CRISPR באמצעות ארגון מחדש מהיר של כרומוזומים או ברירה מהירה של קלונים עמידים קיימים48,49. בסופו של דבר, ההתאמה תלויה ביכולתו של קו התאים לסבול את העומס המטבולי של ביטוי וקטור כפול, לעמוד בלחצי הברירה העקיפים הללו, ולשמור על קינטיקת גדילה יציבה לאורך הפרוטוקול הנמשך מספר שבועות.

בעוד שגישה זו משמשת כהוכחת היתכנות ורסטילית עבור רוב סוגי התאים, יישומה דורש איזון זהיר בין יעילות ההעברה לבין השמירה על השלמות הגנומית. כפי שפורט, שימוש בהעברה לנטיויריסית עבור gRNA המכוון ל"עצמו" מבטיח אוכלוסייה הומוגנית שבה Cas9 הושבת, במיוחד בתאים שקשים לטרנספקציה. עם זאת, הסיכון למוטגנזה שאינזרציתית כתוצאה משילוב חצי-אקראי נותר מקור לדאגה. סיכונים אלו ניתנים לניהול על ידי אופטימיזציה של ה-MOI. בקווי תאים חדירים כגון HEK293, MOI של 1–5 يحقق רוויה גבוהה תוך מזעור מוטגנזה וציטוטוקסיות הנובעות משילוב הגנומי41. לעומת זאת, תאי מערכת חיסון או תאי עצב עמידים דורשים בדרך כלל MOIs של 10–50, ולעיתים קרובות מחייבים שימוש במעצירים כגון polybrene ו/או spinoculation כדי להשיג יעילויות דומות50,51,52,53,54,55.

פשרה טכנית זו משתרעת גם על הבחירה בין אוכלוסיות שנבחרו באופן פוליקלונלי או מונוקלונלי. תאי ה-HEK293ΔCUL4BΔcas9 שיוצרו כאן הם פוליקלונליים, בחירה המאיצה את לוחות הזמנים הניסויים על ידי עקיפת השבועות הנדרשים להתרחבות עבור סוב-קלונינג של תא בודד. יתרה מכך, מאגר פוליקלונלי לוכד את הפנוטיפ הממוצע של התרבית, ובכך מנטרל ביעילות ארטיפקטים קלונליים או בעיות של אינטגרציה באתרים ספציפיים. בעוד שקווי תאים מונוקלונליים נוטים להניב תוצאות עקביות יותר בשל הומוגניות גנטית, התוצאות המוצגות כאן מעידות כי בחירה פוליקלונלית היא חלופה ישימה ולעיתים קרובות עדיפה כאשר המהירות והייצוג של האוכלוסייה הם בעדיפות גבוהה.

היציבות הזמנית של הפנוטיפ המתקבל עשויה להיות גם היא משתנה קריטי. במערכת המוצגת כאן, ההשפעה הרגולטורית של CUL4B על WDR5 ו-CDC6 פחתה לאורך מעברים רצופים של תאי knockout, ובמקביל נצפתה עלייה מפצה בביטוי של הפראלוג CUL4A (הנתונים לא מוצגים). ממצא זה משקף את תוצאותיהם של Nakagawa et al., שהראו כי CUL4A יכול לשחזר באופן חלקי את תפקודו של CUL4B בתאים שבהם CUL4B מדולל44. פיצוי הומאוסטטי כזה נפוץ בביולוגיה תאית, ובמיוחד כאשר המטרה היא חלבון בעל הומולוגיה מבנית גבוהה ויתירות פונקציונלית ביחס לחלבונים תאיים אחרים.

כדי להתמודד עם מנגנוני פיצוי משניים אלו, ניתן להשתמש בשתי גישות אסטרטגיות נפרדות, בהתאם למטרות הניסוי ולקו התאים שבו נעשה שימוש. עבור חוקרים המעדיפים יעילות או עובדים עם קווי תאים בעלי יכולת הסתגלות גבוהה, לו״ז ניסויי דחוס הוא חיוני. אסטרטגיה זו כוללת תיקוף מיידי של אובדן חלבון המטרה, באופן אידיאלי ברגע שהתרבית מגיעה ל-90% confluence לאחר הברירה, ולאחריה ביצוע מהיר של targeting של Cas9 בעצמי-השבתה (self-inactivating) ובדיקות תפקודיות. אימוץ זרימה מואצת זו של העבודה מגדיל את הסיכוי ללכוד את ההשלכות הביולוגיות הראשוניות של ה-knockout לפני שלמנגנוני ההומיאוסטזיס התאי יהיה מספיק זמן להעלות את הביטוי של פאראלוגים רדונדנטיים או לסבך בדרך אחרת את הפנוטיפ שיתקבל.

לחלופין, עבור מחקרים הדורשים יציבות לטווח ארוך או ניסויי הצלה (rescue) ברמת דיוק גבוהה, במיוחד במודלים העמידים לטרנספקציה כגון תאי מערכת החיסון ותאי עצב, מערכת מבוקרת טטרהציקלין (Tet-On/Off) מציעה פתרון מעשי56,57. בעוד שהטמעת מסגרת השראית זו מחייבת סבבים נוספים של טרנסדוקציה לנטיוויראלית ושימוש בסממני עמידות שונים לאנטיביוטיקה, היא מספקת מנגנון לשחזור מתמשך של חלבון המטרה כדי לייצב את הסביבה התאית לפני השראת אירועי 'אובדן והצלה' (loss and rescue) זמניים המתווכים על ידי דוקסיציקלין57.

גילויים

המחברים השתמשו ב-Google Gemini כדי לסייע בליטוש המינוחים הטכניים ובעריכת כתב היד. ה-AI שימש ככלי לשיפור לשוני ולא תרם לסינתזה המקורית של הנתונים, להגיית המחקר או לניסוח הראשוני של הטקסט. המחברים סקרו ועריכו את התוצאות והם נושאים באחריות מלאה לתוכן של כתב היד הסופי. המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי כספי סטארט-אפ שסופקו על ידי Le Moyne College, ועדת המחקר והפיתוח של Le Moyne College, ועדת מחקרי הסטודנטים של Le Moyne College, קרן Walter L. '66 and MaryAnne Poland Jesuit Center for Research and Teaching Innovation, והמחלקה למדעי הביולוגיה והסביבה של Le Moyne College. המחברים מודים על השימוש ב-BioRender.com בהכנת האיורים הגרפיים. איור 1 נוצר ב-BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3), והפאנל העליון של איור 2 נוצר ב-BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן anti-Cas9אותיות תאיים65832נוגדן מונוקלונאלי זה מעכבר מאפשר זיהוי ספציפי של Cas9 מ-S. pyogenes בליזאטים אנושיים, דבר ההופך אותו לאידיאלי לאימות של פינוי Cas9 המתווך על ידי gRNA המכוון לעצמו.
נוגדן anti-CDC6אותיות תאיות3387נוגדן מונוקלונלי זה מארנב מאפשר זיהוי ספציפי של CDC6 אנושי, מה שהופך אותו לאידיאלי לניטור השפעות תפקודיות במורד המסלול של CUL4B.
נוגדן anti-CUL4BSigma-AldrichC9995נוגדן פוליקלונלי זה מארנב, שעבר טיהור באפיניות, מאפשר זיהוי ספציפי של CUL4B אנושי ללא תגובת צולבת עם הפראלוג הקרוב אליו, CUL4A.
נוגדן משני אנטי-uouse IgG, מקושר ל-HRPאותיות תאיים7076נוגדן horse anti-mouse IgG זה מצומד לhorseradish peroxidase (HRP) ומותאם לזיהוי כימולומינסנטי של נוגדנים ראשוניים מונוקלונליים של עכבר.
נוגדן משני אנטי-rabbit IgG, מקושר ל-HRPאותיות תאיות7074נוגדן עיזים נגד IgG של ארנב זה מצומד לHorseradish Peroxidase (HRP) ומותאם לגילוי כימילומינצנטי של נוגדנים ראשוניים פוליקלונליים ומונוקלונליים של ארנב.
נוגדן anti-WDR5איתות תאי13105נוגדן מונוקלונלי זה מארנב מאפשר זיהוי ספציפי של WDR5 אנושי, ובכך הוא אידיאלי לניטור השפעות תפקודיות במורד המסלול של CUL4B.
אנטי-αנוגדן ל-TUBULINשליחון תאי (Cell Signaling)3873נוגדן מונוקלונלי זה, המופק מעכבר, מכוון לאלפא-טובולין אנושי ואידיאלי כביקורת טעינה אחידה לצורך נרמול בניתוח Western blot.
ערכה לטרנספקציה באמצעות סידן פוספטThermoFisher ScientificK278001ערכה זו מספקת ריאגנטים יעילים לטרנספקציה זמנית (transient transfection), המותאמים לייצור ניתן להרחבה וחסכוני של וקטורים לנטיוויראליים בתאי יצרן HEK293FT דבקים.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation סינתזה בהתאמה אישיתרצף gRNA של Cas9: CGTGATCACCGACGAGTACA, רצף PAM: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation סינתזה מותאמת אישיתרצף gRNA של cas9: CGTGATCACCGACGAGTACA, רצף PAM: AGG
מצע איגל משופר של דולבקו (Dulbecco's Modified Eagle Medium) GibcoD5796מצע עשיר גלוקוז זה, המועשר ב-L-glutamine ובסודיום פירובט, מותאם לשמירה על צמיחה, חיוניות ויציבות מטבולית של שורות תאים של יונקים בעלות קצב התרבות מהיר (למשל, HEK293FT).
סרום עגל עוברי, פרימיום (מנטרל חום)Corning35-016-CVסרום זה, ברמה גבוהה (premium-grade) ובעיקור בחום (heat-inactivated), מספק גורמי גדילה והורמונים חיוניים, תוך מזכור מינימום של ציטוטוקסיות ממדית למערכת המשלים עבור שורות תאים של יונקים.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573קו תאי כליה עובריים של בן אדם מאופיין היטב זה הוא בעל יעילות טרנספקציה גבוהה ומשמש כמודל סטנדרטי וחסון לחקר פנוטיפים של השתקת גנים ומסגרות להצלה של חלבוני מטבולה.
תאי HEK293FT ThermoFisher ScientificR70007גרסה זו, הגדלה במהירות ובעלת יכולת טרנספקציה גבוהה של שלב תאי הכליה העובריים של האדם, מבטאת באופן יציב את האנטיגן T הגדול של SV40, מה שהופך אותה לאופטימלית למקסימיזציה של תרשמי נגיפים (viral titers) במהלך ייצור וקטורים לנטיביריאליים.
היגרומיצין BsigmaaldrichH7772אנטיביוטיקה מסוג אמינונוקלאוזיד זו משמשת כסוכן ברירה בתרביות תאי יונקים, על מנת לבודד טרנסדוקטנטים יציבים המבטאים את סמן העמידות להיגרומיצין.
פלסמיד pCLIP-All-hCMV-Puro (CUL4B gRNA)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bרצף gRNA של CUL4B: ATCAAACCCTACAAACTCCA, רצף PAM: AGG
pCMV-FLAGCUL4Bלא רלוונטילא רלוונטיפלסמיד ביטוי יונקיים זה משתמש בפרומוטור של cytomegalovirus (CMV) להנעת ביטוי קונסטיטוטיבי של חלבון Cullin 4B (CUL4B) המסומן ב-FLAG, והוא ניתן כמתנה מאת Jianping Jin.
ווקטור ביטוי ליונקים pCMV-M1Addgene23007ביקורת של וקטור ביטוי ריק (מתנה מלינדה וורדמן)
pLentiGuide-PuroAddgene52963וקטור העברה לנטיבירי זה מניע ביטוי של gRNA הניתן להתאמה אישית תחת מקדם U6 אנושי, לצד סמן עמידות לפומייסין המונע על ידי מקדם EF-alpha, עבור טרגוט CRISPR בתאים המבטאים Cas9, והוא ניתן כמתנה מ-Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 וקטור לנטיווירלי המקודד ל-GFP להערכת יעילות התעתוק (מתנה מקווין ג'יינס)
פומייצין (Puromycin)Sigma-AldrichP8833אנטיביוטיקה מסוג אמינונוקליאוזיד זו משמשת כסוכן ברירה בתרביות תאי יונקים לצורך בידוד טרנסדוקטנטים יציבים המבטאים את סמן העמידות לפיורומיצין.
מלחים של פוספט בבופר סלין (PBS) סטרילייםCorning21-040-CVתמיסת מלחים מאוזנת סטנדרטית זו משמשת לשטיפת שכבות תאים חד-שכבתיות (monolayers), כדי להסיר ביעילות שאריות של מצע גידול, חלבוני סרום או אנזימים, מבלי לפגוע בלחץ האוסמוטי או בחיוניות התאים.
Trypsin EDTA 1XCorning25-051-CIתמיסת הפירוק האנזימטית הסטנדרטית הזו משמשת לניתוק תאי יונקים דבקים מכלי תרבית על ידי פירוק קשרי פפטיד, בעוד שה-EDTA קולט קטיונים דו-ערכיים כדי לשבש את ההיצמדות הבין-תאית.
ערכת תערובת אריזה לנטיוויראלי ViraPowerThermoFisher ScientificK497500תערובת אופטימלית זו של פלסמידים לאריזה (pLP1, pLP2, ו-pLP/VSVG) משמשת לטרנספקציה משותפת לתאי יצרן, כדי לאפשר הרכבה בריכוז גבוה וייצור של וקטורי ביטוי לנטיביריים שאינם מסוגלים לשכפול.

מקורות

  1. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Leonhardt C, et al. Single-cell mRNA transfection studies: Delivery, kinetics and statistics by numbers. Nanomedicine. 2014;10(4):679-688.
  3. Liu Y, Yang Q, Zhao F. Synonymous but not silent: The codon usage code for gene expression and protein folding. Annu Rev Biochem. 2021;90:375-401.
  4. Chamary JV, Hurst LD. Evidence for selection on synonymous mutations affecting stability of mRNA secondary structure in mammals. Genome Biol. 2005;6(9):R75.
  5. Mauro VP, Chappell SA. A critical analysis of codon optimization in human therapeutics. Trends Mol Med. 2014;20(11):604-613.
  6. Bauer AP, et al. The impact of intragenic CpG content on gene expression. Nucleic Acids Res. 2010;38(12):3891-3908.
  7. Kudla G, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science. 2009;324(5924):255-258.
  8. Simms CL, Yan LL, Zaher HS. Ribosome collision is critical for quality control during no-go decay. Mol Cell. 2017;68(2):361-373.e5.
  9. Fu Y, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-826.
  10. Babu K, et al. Bridge helix of Cas9 modulates target DNA cleavage and mismatch tolerance. Biochemistry. 2019;58(14):1905-1917.
  11. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013;31(9):827-832.
  12. Ihry RJ, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med. 2018;24(7):939-946.
  13. Haapaniemi E, Botla S, Persson J, Schmierer B, Taipale J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med. 2018;24(7):927-930.
  14. Yang S, Li S, Li XJ. Shortening the half-life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Rep. 2018;25(10):2653-2659.e3.
  15. Kafri M, Metzl-Raz E, Jona G, Barkai N. The cost of protein production. Cell Rep. 2016;14(1):22-31.
  16. Mehta A, Merkel OM. Immunogenicity of Cas9 protein. J Pharm Sci. 2020;109(1):62-67.
  17. Liu Q, Zhang H, Huang X. Anti-CRISPR proteins targeting the CRISPR-Cas system enrich the toolkit for genetic engineering. FEBS J. 2020;287(4):626-644.
  18. Marino ND, Pinilla-Redondo R, Csörgő B, Bondy-Denomy J. Anti-CRISPR protein applications: Natural brakes for CRISPR-Cas technologies. Nat Methods. 2020;17(5):471-479.
  19. Gangopadhyay SA, et al. Precision control of CRISPR-Cas9 using small molecules and light. Biochemistry. 2019;58(4):234-244.
  20. Pandit B, et al. Bio-orthogonal chemistry-based strategy to turn off CRISPR-Cas9 activity in solution and live cells. NAR Mol Med. 2026;3(1):ugag008. Available from: https://doi.org/10.1093/narmme/ugag008
  21. Bubeck F, et al. Engineered anti-CRISPR proteins for optogenetic control of CRISPR-Cas9. Nat Methods. 2018;15(11):924-927.
  22. Kostic M, Jones LH. Critical assessment of targeted protein degradation as a research tool and pharmacological modality. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(5):305-317.
  23. Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-1019.
  24. Hendel A, et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015;33(9):985-989.
  25. Merienne N, et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Rep. 2017;20(12):2980-2991.
  26. Kelkar A, et al. Doxycycline-dependent self-inactivation of CRISPR-Cas9 to temporally regulate on- and off-target editing. Mol Ther. 2020;28(1):29-41.
  27. Dai Y, et al. Self-inactivating AAV-CRISPR at different ages enables sustained amelioration of Huntington's disease deficits in BAC226Q mice. Sci Adv. 2026;12(12):eaea8052.
  28. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014;11:783-784.
  29. Parr-Brownlie LC, et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 2015;8:14.
  30. Dobransky A, Root M, Hafner N, Marcum M, Sharifi HJ. CRL4-DCAF1 ubiquitin ligase-dependent functions of HIV viral protein R and viral protein X. Viruses. 2024;16(8)1313.
  31. Thermo Fisher Scientific. ViraPower Lentiviral Expression Systems User Guide. 2026. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/virapower_lentiviral_system_man.pdf
  32. Pauwels K, et al. State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr Gene Ther. 2009;9(6):459-474.
  33. Guo L, et al. Optimizing conditions for calcium phosphate-mediated transient transfection. Saudi J Biol Sci. 2017;24(3):622-629.
  34. Thermo Fisher Scientific. Cationic Lipid Transfection. 2026. Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/methods/cationic-lipid-transfection.html
  35. Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495-505. Available from: https://doi.org/10.1038/nprot.2009.22
  36. Barde I, Salmon P, Trono D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 2010;53(1):4.21.1-4.21.23. Available from: https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142301.ns0421s53
  37. Kumru OS, et al. Physical characterization and stabilization of a lentiviral vector against adsorption and freeze-thaw. J Pharm Sci. 2018;107(11):2764-2774.
  38. American Type Culture Collection. Lentiviral Vector Reference Material Information Sheet. 2026. Available from: https://www.atcc.org/-/media/product-assets/documents/protocols/virology/lentiviral-vector-reference-material-information-sheet.pdf?rev=a934bd06c07f4969b0aafec16506cd44
  39. Higashikawa F, Chang L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 2001;280(1):124-131.
  40. Kowolik CM, Yee JK. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 2002;5(6):762-769.
  41. Pichavant C, Tremblay JP. Generation of lentiviral vectors for use in skeletal muscle research. In: DiMario JX, editor. Myogenesis: Methods and Protocols. Humana Press; Totowa, NJ; 2012. p. 285-295.
  42. Stacey GN, Masters JR. Cryopreservation and banking of mammalian cell lines. Nat Protoc. 2008;3(12):1981-1989.
  43. Bauer DE, Canver MC, Orkin SH. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. J Vis Exp. 2015;(95):e52118.
  44. Nakagawa T, Xiong Y. X-linked mental retardation gene CUL4B targets ubiquitylation of H3K4 methyltransferase component WDR5 and regulates neuronal gene expression. Mol Cell. 2011;43(3):381-391.
  45. Zou Y, et al. CUL4B promotes replication licensing by up-regulating the CDK2-CDC6 cascade. J Cell Biol. 2013;200(6):743-756.
  46. Dachs GU, Hunt MA, Syddall S, Singleton DC, Patterson AV. Bystander or no bystander for gene-directed enzyme prodrug therapy. Molecules. 2009;14(11):4517-4545.
  47. Prise KM, O'Sullivan JM. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2009;9(5):351-360.
  48. Clark MJ, et al. U87MG decoded: The genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 2010;6(1):e1000832.
  49. Cormier JN, et al. Heterogeneous expression of melanoma-associated antigens and HLA-A2 in metastatic melanoma in vivo. Int J Cancer. 1998;75(4):517-524.
  50. Sigma-Aldrich. Successful Transduction Using Lentivirus. Darmstadt, Germany; 2023. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/genomics/advanced-gene-editing/successful-transduction-lentivirus
  51. Swainson L, Mongellaz C, Adjali O, Vicente R, Taylor N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol. 2008;415:301-320.
  52. Davis HE, Morgan JR, Yarmush ML. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 2002;97(2-3):159-172.
  53. Denning W, et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: Effect of sera and polycations. Mol Biotechnol. 2013;53(3):308-314.
  54. O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 2000;74(21):10074-10080.
  55. Sano S, et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. 2019;(152):e59977.
  56. Gossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(12):5547-5551.
  57. Gossen M, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995;268(5218):1766-1769.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

BiologyCRISPRCas9KnockoutLentivirusTransductionStableSelectionRescueRestorationTransgeneTransfectionPlasmid
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.