הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

Liuwei Dihuang Wan מעכב אוסטאוקלסטוגנזה ואובדן עצם הנגרמת על ידי ניתוח השחלות על ידי דיכוי איתות NF-κB

108 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72270

⸱

28 ביולי 2026

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה הראה שליווי דיהואנג וואן (LWDHW) מדכא התמיינות אוסטאוקלסטית ואובדן עצם הנגרם מכריתת שחלות על ידי עיכוב מסלול האיתות של NF-κB, כפי שנחשף באמצעות ניתוח LC-MS/MS, פרמקולוגיית רשת, ואימות in vivo ו-in vitro.

תקציר

ליוווי דיהואנג וואן (LWDHW), נוסחה קלאסית ברפואה סינית מסורתית, משמשת רבות לטיפול במחלות שונות הקשורות למחסור בכליות והוכיחה יעילות קלינית מספקת באוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר (PMOP). עם זאת, המנגנונים הפרמקולוגיים שלו נותרו לא ברורים. כדי להתמודד עם זה, ניתחנו תחילה את הרכיבים הכימיים של LWDHW באמצעות LC-MS/MS, שזיהו 1,615 רכיבים. פרמקולוגיית הרשת חזה אז כי דלקת ומסלול האיתות של NF-κB הם מנגנונים טיפוליים פוטנציאליים העומדים בבסיס השפעות LWDHW על PMOP. בהמשך, 27 עכברים נקבות C57BL/6J הוקצו באקראי לקבוצות Sham, Model ו-LWDHW. עכברים בשתי הקבוצות האחרונות עברו כריתת שחלות דו-צדדית (OVX), ואלו בקבוצת LWDHW קיבלו LWDHW דרך הפה במינון 9.75 גרם לק"ג/יום במשך 8 שבועות. נאספו דגימות סרום ועצם הירך לבדיקה אימונוסורבנטית מקושרת באנזים (ELISA), טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT), בדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה (IHC). מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם (BMMs) טופלו ב-LWDHW ולאחר מכן עברו צביעת TRAP ו-qRT-PCR. בעכברי OVX, LWDHW הקל משמעותית על אובדן עצם והידרדרות של מיקרוארכיטקטורת העצם, בליווי ירידה ברמות β-CTX בסרום וירידה במספר האוסטיאוקלסטים ברקמות הירך. צביעת IHC הראתה ביטוי נמוך משמעותית של TNF-α, IL-1β ו-p-P65 ברקמות הירך של עכברים שטופלו ב-LWDHW בהשוואה לקבוצת המודל. במבחנה, צביעת TRAP הראתה כי LWDHW מעכב התמיינות אוסטאוקלסטית מושרה על ידי RANKL/M-CSF של BMMs והפחית את הביטוי של Ctsk, MMP9 ו-Nfatc1. ניתוח ווסטרן בלוט הראה גם כי רמות החלבון של P65, p-P65, IκBα ו-p-IκBα ירדו באופן משמעותי ב-BMMs לאחר טיפול ב-LWDHW. ביחד, LWDHW מקל על אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר, ייתכן על ידי דיכוי אוסטאוקלסטוגנזה המתווכת על ידי איתות NF-κB.

מבוא

אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר (PMOP) היא מחלת עצם מטבולית נפוצה המאופיינת באובדן מסת עצם והידרדרות של מיקרוארכיטקטורת העצם1. עם האוכלוסייה המתבגרת באוכלוסייה, השכיחות הגוברת של PMOP הפכה לבעיה בריאותית ציבורית עולמית המאיימת באופן חמור על בריאותן של נשים לאחר גיל המעבר2. בסין, השכיחות הכוללת של PMOP מגיעה ל-32.1%3. המטופלים רגישים יותר לסיבוכים חמורים כגון כאבי גב כרוניים, עיוותים בעמוד השדרה ושברים שבריריים 4,5. נכון להיום, תרופות שאושרו על ידי ה-FDA לאוסטאופורוזיס כוללות ביספוספונטים6, הורמון פאראתירואיד6 7 ודנוזומאב8, הנפוצים בשימוש קליני. עם זאת, השימוש ארוך הטווח שלהם מוגבל לעיתים קרובות על ידי תופעות לוואי שונות9. לכן, יש צורך דחוף לפתח סוכנים טיפוליים בטוחים ויעילים יותר עבור PMOP. מבין החלופות האפשריות, תרופות צמחיות סיניות זכו לתשומת לב גוברת בזכות יעילותן המוכרתופרופיל הבטיחות החיובי שלהן.

ליוווי דיהואנג וואן (LWDHW) היא נוסחה קלאסית ברפואה הסינית המסורתית (TCM), שתועדה לראשונה בטקסט העתיק מפתח לטיפולים במחלות ילדים בתקופת שושלת סונג. במשך אלפי שנים, LWDHW שימש באופן נרחב בפרקטיקה קלינית לטיפול במחלות שונות המיוחסות למחסור בכליות 11,12,13,14. לפי תיאוריית ה-TCM של "הכליה השולטת בעצמות", אובדן מסת עצם והידרדרות עצם אצל מטופלי PMOP נגרמים בעיקר מחוסר תזונה מ-Kidney Essence15. כתוצאה מכך, LWDHW מיושם בדרך כלל בניהול קליני של PMOP והוכיח יעילות טיפולית ברורה16,17. עם זאת, למרות שמחקרים בבעלי חיים וקליניים חשפו כי LWDHW מפעיל השפעות פרמקולוגיות רבות, כולל אנטי-חמצון18, אנטי-דלקתי19 ופעילות אנטיפיברוטית14, המנגנון הבסיסי שלו נגד PMOP נותר ברובו לא ידוע.

הומאוסטזיס עצם תלוי באיזון בין ספיגת עצם על ידי אוסטאוקלטים לבין היווצרות עצם על ידי אוסטאובלסטים20. איזון זה מופר כאשר התמיינות ופעילות האוסטיאוקלסטים משתפרים בתנאים דלקתיים, מה שמוביל להאצת ספיגת עצם21. בתהליך זה, מסלול NF-κB משמש כרגולטור ליבה. גורמים דלקתיים כמו TNF-α ו-IL-1β יכולים לגרום לזרחון ופירוק של IκBα, ולגרום להעברת גרעינית של p65 המזורחן (p-P65)22. כתוצאה מכך, גנים ספציפיים לאוסטיאוקלסט במורד הזרם, כולל Ctsk, Mmp9 ו-Nfatc1, מופעלים לקידום אוסטאוקלסטוגנזה23,24.

פרמקולוגיה רשתית היא תחום בין-תחומי המשלב מדעי המחשב, פרמקולוגיה וביואינפורמטיקה25. הוא מציג יתרונות ברורים בחקירה מקיפה של המנגנונים הפרמקולוגיים העומדים בבסיס ההשפעות הטיפוליות של צמחי מרפא סיניים26. במחקר הנוכחי, פרמקולוגיה ברשת שימשה לחיזוי התהליכים הביולוגיים הפוטנציאליים ומסלולי האיתות המעורבים בהשפעות האנטי-אוסטאופורטיות של LWDHW. במקביל, הרכיבים הכימיים של LWDHW נותחו באמצעות LC-MS/MS. יתרה מזאת, נערכו אימות in vivo באמצעות מודל עכבר OVX וניסויים במבחנה עם מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם (BMMs) כדי להמשיך לחקור את המנגנון הפרמקולוגי של LWDHW נגד PMOP. תהליך העבודה מוצג באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית הסינית של ג'ג'יאנג (IACUC-202402-07).

הכנה וניתוח LC-MS/MS של LWDHW

נוסחת LWDHW מורכבת משישה עשבי תיבול סיניים: Rehmannia glutinosa (Gaertn.), Cornus officinalis (Sieb.), Paeonia suffruticosa (Andr.), Dioscoreae מול (Thunb.), Poria cocos (Schw.), ו-Alisma orientale (Sam.). מידע מפורט על עשבים אלו מופיע בטבלה 1. כל העשבים הגולמיים סופקו על ידי בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה סינית (האנגג'ואו, סין) והורתחו במים מטוהרים ביחס עשבים למים של 0.1 ק"ג לליטר. התמצית המימית שהתקבלה סיננה וריכזה לתמיסה עובדת ב-0.5 גרם למ"ל לניתוח LC-MS/MS וניסויים בבעלי חיים נוספים. יתרה מזאת, תמיסת העבודה עובדה לאבקה מיובשת בהקפאה לניסויים בתאים.

בניתוח LC-MS/MS, תנאי הכרומטוגרפיה הנוזלית היו כדלקמן: פאזה ניידת A (מימי) ופאזה ניידת B (אורגנית) כללו 0.1% חומצה פורמית במים ובאצטוניטריל, בהתאמה, למצב יון חיובי, או פורמט אמוניום של 5 מ"מ במים ואצטוניטריל, בהתאמה, עבור מצב יוני שלילי. משך הריצה הכולל היה 8 דקות, עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל לדקה, טמפרטורת עמודה של 40 מעלות צלזיוס, ונפח הזרקה של 2 מיקרוליטר. לספקטרומטריית מסה, הנתונים נאספו במצב MS-ddMS2 מלא, עם מתחי ריסוס שנקבעו על +3.50 kV (חיובי) ו-2.50 kV (שלילי).

רכיבים ביואקטיביים ויעדים לחיזוי LWDHW

שמותיהם של שישה עשבים המרכיבים הוזנו למאגר הנתונים של מערכת הפרמקולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP) כדי לקבל את רשימת המרכיבים המלאה של LWDHW. רכיבים ביואקטיביים נבדקו לאחר מכן באמצעות פרמטרים פרמקוקינטיים של זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥ 30% ודמויות תרופה (DL) ≥ 0.18, 27,28,29,30. החלבונים המתאימים של הרכיבים הביואקטיביים זוהו והוגשו ל-UniProt כדי לאסוף את שמות הגנים הסטנדרטיים שלהם, שהוגדרו כיעדי הגנים הסופיים של LWDHW.

מטרות חופפות בין LWDHW ל-PMOP

מטרות גנים הקשורות ל-PMOP נאספו על ידי חיפוש במילת המפתח "osteoporosis postmenopausal osteoporosis" הן במאגרי GeneCards והן ב-DisGeNET ב-2 באוקטובר 2024. המטרות סיננו באמצעות ספי ציון של >0.1 ב-DisGeNET ו->10 ב-GeneCards, ורשומות כפולות הוסרו כדי לקבל סט גנים לא מיותרים הקשורים ל-PMOP. בהמשך, היעדים שמקורם בעשבים של LWDHW והיעדים הקשורים ל-PMOP יובאו לכלי המקוון של Venny ליצירת דיאגרמת ון המציגה את המטרות החופפות בין LWDHW ל-PMOP.

אונטולוגיה גנטית (GO) וניתוח העשרת מסלולי איתות

היעדים החופפים בין LWDHW ל-PMOP עברו ניתוח העשרת GO באמצעות מסד הנתונים DAVID. מונחי GO שנאספו סווגו לשלוש קטגוריות, כולל רכיב תאי, תפקוד מולקולרי ותהליך ביולוגי (BP). לאחר סינון FDR < 0.01, 30 המונחים המובילים של BP צוינו בדיאגרמת בועה בסדר יורד של העשרת קיפולים.

לאחר מכן, היעדים החופפים הוזנו לאנציקלופדיה של גנים וגנומים של קיוטו (KEGG) ומטאסקייפ לניתוח העשרת מסלולי איתות. המסלולים המועשרים ממאגרי KEGG ו-Metascape דורגו לפי מספר היעדים המתאימים בסדר יורד, ו-25 המסלולים המובילים מכל מסד נתונים הוצגו כתרשימי עמודות.

בניית רשת

רשתות "פורמולה-עשבים-מרכיבים-מטרות-מחלה" ו"מטרות-מסלולים" נבנו ב-Cytoscape כדי להמחיש את הקשרים בין הרכיבים. רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) נוצרה על ידי הזנת המטרות החופפות למסד הנתונים של STRING. מטרות המרכז בתוך הרשת זוהו באמצעות סינון על בסיס תכונות טופולוגיות, כולל מרכזיות דרגה (DC), מרכזיות ביניים (BC) ומרכזיות קרבה (CC).

קיבוץ בעלי חיים, מודל אוסטאופורוזיס מושרה OVX והתערבות תרופתית

בסך הכל 27 נקבות עכברים מסוג C57BL/6J (בני חודשיים, במשקל 22 ± 2 גרם) סופקו על ידי מרכז הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת הרפואה הסינית ג'ג'יאנג (האנגג'ואו, ג'ג'יאנג). כל בעלי החיים הוחזקו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורת סביבה שנשמרה על 25 מעלות צלזיוס, ולחות בין 40% ל-60%, עם גישה חופשית למזון ולמים. לאחר שבוע של האכלה אדפטיבית, העכברים חולקו באקראי לשלוש קבוצות (n = 9 לכל קבוצה) באמצעות טבלת מספרים אקראית: Sham, Model, ו-LWDHW. עכברים בקבוצות המודל ו-LWDHW עברו כריתת שחלות דו-צדדית (OVX) כדי להקים את מודל PMOP, בעוד שקבוצת שאם עברה הליך מזויף שכלל כריתה של נפח שווה של רקמת השומן הפריאוורית. החל משני ימים לאחר הניתוח, עכברים בקבוצת LWDHW קיבלו תמיסת עבודה יומית דרך הפה במינון של 9.75 גרם לק"ג/יום (הומר מהמינון המקביל האנושי לפי שטח הגוף), בעוד שקבוצות המודל והשאם קיבלו נפח שווה של תמיסת מלח. דגימות ביולוגיות, כולל רקמות סרום וירך, נאספו 8 שבועות לאחר המתן לניתוח נוסף. לא התרחשו מוות או תמותה בלתי צפויים באף אחת מהקבוצות לאורך תקופת הניסוי.

מבחן אימונוסורבנט המקושר באנזימים בסרום (ELISA)

דם מלא נאסף מהפלקסוס הרטרו-אורביטלי וצונטריפוג בעוצמה של 1000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לקבלת סרום. ריכוזי אוסטאוקלצין (OCN) וטלופטיד β-C-טרמינל של קולגן מסוג I (β-CTX) נמדדו באמצעות ערכות ELISA מתאימות בהתאם לפרוטוקולי היצרן.

מיקרו-CT וניתוח ביומכני

דגימות הירך נסרקו באמצעות מכשיר מיקרו-ממוחשב ברזולוציה גבוהה (μCT) ברזולוציה איזוטרופית של 10 מיקרון. המיקרו-מבנה התלת-ממדי (תלת-ממדי) של עצם הירך הרחוקה שוחזר מהתמונות שנרכשו באמצעות תוכנת NRecon. בהמשך, הפרמטרים הבאים של מיקרוארכיטקטורה של העצם, כולל צפיפות המינרלים של העצם (BMD, g/mm3), שבר נפח העצם (BV/TV, אחוז), עובי טרבקולר (Tb.Th, מ"מ) ומספר טרבקולר (Tb.N, 1/mm), נמדדו באזור העניין (ROI) של הירך הרחוקה.

התכונות הביומכניות של דגימות הירך (n = 3 לקבוצה) הוערכו באמצעות מבחן כיפוף בשלוש נקודות באמצעות מערכת בדיקת עייפות טורסיית צירית. הוחל עומס דחיסה על הדיאפיזה האמצעית בקצב תזוזה קבוע של 2 מ"מ לדקה עד לכשל מבני. העומס המרבי (N) נרשם אוטומטית על ידי תוכנת המערכת.

היסטומורפולוגיה, אימונוהיסטוכימיה (IHC) וצביעה אימונופלואורסצנציה (IF)

לאחר קיבוע עם 4% פאראפורמלדהיד, דה-קלציפיקציה בתמיסת EDTA של 14%, והתייבשות באמצעות סדרת אתנול מדורגת, דגימות הירך עובדו לחלקי פרפין בעובי 3 מיקרון כפי שתואר קודם31. החתכים צובקו בהמטוקסילין כחול אלציאני (ABH)/Orange G להערכה מורפולוגית. ניתוח כמותי של אזור עצם הטרבקולר במטאפיזיזה של הירך הדיסטלית בוצע באמצעות תוכנת OsteoMetrics.

דגימות כבד וכליות הוקבו, הוטבעו בפרפין, ונחתכו לחתכים של 4 מיקרון. לאחר דה-פרפיניזציה שגרתית והידרציה מחודשת, החתכים צולמו בהמטוקסילין ואאוזין. בדיקה היסטולוגית בוצעה תחת מיקרוסקופ אור.

בדיקות IHC ו-IF בוצעו על מקטעים מוטמעים בפרפין בהתאם לנהלים שנקבעו. בקצרה, שליפת האנטיגנים בוצעה על ידי דגירה של חתכים בבופר ציטראט בקוטר 0.01 מטר בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. החתכים הוגדרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים כולל ALP (1:300), IL-1β (1:500), TNF-α (1:500) ו-p-P65 (1:300). לאחר דגירה עם נוגדנים משניים מתאימים למשך 20 דקות, החלקים הונחשפו לתמיסת דימינובנזידין (DAB) וצביעת נגד המטוקסילין ל-IHC או צובעו ב-DAPI לסימון גרעיני ב-IF. לכימות צביעה חיובית, נלכדו ארבעה שדות שנבחרו באקראי מכל אחד משלושת חלקי הרקמה בכל דגימה. בצביעת IHC, הצפיפות האופטית הממוצעת הוגדרה כיחס בין צפיפות אופטית משולבת (IOD) לשטח החלל המתאים, כפי שנקבע באמצעות תוכנת Image-Pro Plus. בצביעת IF, אזור הצביעה החיובית ננורמל לשטח השדה והובטא באחוזים, והכימות בוצע באותה תוכנה.

תרבית ראשונית של מקרופאגים של מח עצם (BMMs) ובדיקת ספירת תאים

תאי מח עצם נשטפו מהירך ומהשוקה של עכברים בני חודשיים מסוג C57BL/6 עם מלח בופר עם פספט (PBS). המתלה התא שהתקבל עבר סינון דרך מסננת של 70 מיקרון וצנטריפוגה ב-200 x g למשך 5 דקות. כדור התא הושהה מחדש במדיום שלם α-MEM שכלל 10% סרום בקר עוברי. לאחר 24 שעות של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO₂, תאים לא דביקים הוסרו. כדי לעודד התמיינות של מקרופאגים, תאים דבקים גודלו במדיום המכיל 50 ng/mL פקטור מגרה קולוניית מקרופאגים (M-CSF) ו-40 ng/mL RANKL במשך 5–7 ימים עד שנצפו BMMs בוגרים.

ה-BMMs צויפו ב-3 x 104 תאים/באר בלוחות 96 בארים. לאחר 24 שעות טיפול בריכוזי LWDHW במדרגות, דגרו BMMs בתמיסת 10% Cell Counting Kit-8 (CCK-8) בטמפרטורה של 37°C למשך שעה. הספיגה של כל באר נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.

ניתוח ביטוי גנים כמותי על BMMs ראשוניים

ה-BMMs נזרעו בצלחות בגודל 6 ס"מ בצפיפות של 3 על 10,6 תאים לכל צלחת. לאחר טיפול ב-500 ו-1,000 מיקרוגרם/מ"ל LWDHW למשך 24 שעות, הופק סך כל ה-RNA מ-BMMs באמצעות ערכת ה-RNA-Quick Purification לפי הוראות היצרן. לאחר כימות באמצעות ספקטרופוטומטריה, 500 ng של RNA כולל הועתקו הפוך ל-cDNA. PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) בוצע באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים (טבלה 2), ותנאי מחזור ה-PCR היו כדלקמן: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס ל-5 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. רמות ביטוי הגנים נותחו באמצעות שיטת 2ΔΔCt , כאשר GAPDH היה הגן הפנימי ההתייחסות הפנימי.

ניתוח ווסטרן בלוט על BMMs ראשוניים

לאחר שצלחות ב-3 x 106 תאים בכל צלחת בצלחות של 6 ס"מ, ה-BMMs טופלו בהתערבויות שונות ואז עברו ליזה על קרח באמצעות בופר RIPA ליזיס. סך החלבון נאסף וגודל באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. דגימות חלבון (30 מיקרוגרם לנתיב) הופרדו על ידי SDS-PAGE על ג'לים פוליאקרילאמיד 12.5% והועברו לממברנות PVDF של 0.2 מיקרומטר. לאחר חסימה של 20 דקות, הממברנות נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם הנוגדנים הראשוניים הבאים: P65 (1:1000), p-P65 (1:1000), IκBα (1:1000), p-IκBα (1:1000) ו-β-אקטין (1:1000). למחרת, הממברנות נדגרו עם נוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות החלבון הוצגו באמצעות ערכת זיהוי כימילומינסנציה ECL ונלקחו באמצעות מערכת ניתוח תמונות כימילומינסנציה אוטומטית.

צביעת TRAP ברקמות ירך ו-BMM

חתכי רקמת הירך ו-BMMs מצופים בלוחות 24 בארות בגודל 1 על 10תאים 5 לבאר צובעו באמצעות ערכת צביעה של TRAP (TRAP) שעמדו בפרוטוקול היצרן. משטח העצם הטרבקולרית המכוסה באוסטאוקלסט (Oc.S/BS) בחתכי רקמה ואזור היווצרות האוסטאוקלסט בתרביות BMM נמדדו באמצעות תוכנת Image-Pro Plus.

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ±. ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן דאנט שימש לניתוח סטטיסטי ב-SPSS. *p < 0.05 ו -**p < 0.01 נחשבו מובהקים סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

רכיבים כימיים של LWDHW נותחו על ידי LC-MS/MS

הפרופיל הכימי של התמיסה המימית LWDHW התאפיין בניתוח LC-MS/MS. זוהו בסך הכול 1615 רכיבים, מתוכם 968 שזוהו במצב יוניזציה חיובית ו-647 במצב יינון שלילי (איור 2A). פרטי עשרת הרכיבים המובילים מכל מצב יינון מפורטים באיור 2B,C.

חיזוי מטרות טיפוליות של LWDHW מול PMOP באמצעות פרמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עם הזדקנות האוכלוסייה העולמית, PMOP הפכה לבעיה בריאותית רצינית ברחבי העולם, ומשפיעה על מיליוני נשים מדי שנהבגיל 36. בהתחשב בתופעות הלוואי הקשורות לתרופות אנטי-אוסטאופורטיות כיום, חיוני לפתח אסטרטגיות טיפוליות בטוחות ויעילות יותר. LWDHW היא נוסחה קלאסית לחיזוק הכליות ב-TCM ומשמשת כרפואה אלטרנטיבית לטיפול במחלות עצם שונות37,38. ראיות קליניות הראו את יעילותו בהגדלת מסת העצם בקרב מטופלי PMOP3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים או לא פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הטבעי של מחוז ג'ג'יאנג (ZCLQN25H2701).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.01 M חיץ ציטראטSolarbioC1010להחזרת אנטיגן של חלקי ירך לצביעת IHC ו-IF בשלב 10 בפרוטוקול
0.2 μm קרומי PVDF BioRad1620177להעברה אלקטרופורטית של חלבונים מ-SDS-PAGE לקרום בשלב 13 בפרוטוקול
ג'לים פוליאקרילאמיד של 12.5%Epizyme BiotechPG113להפרדת SDS-PAGE של חלבונים בשלב 13 בפרוטוקול
נוגדן ALP ARIGOARG57422להזהה של IHC בחלקי ירך בשלב 10 בפרוטוקול
מערכת ניתוח תמונות אוטומטית של כימולומינסנציה Tanon 5200להדמיית רצועות Western blot בשלב 13 בפרוטוקול
מערכת בדיקת עייפות צירית-פיתולית Instronדגם 5569R1412לבדיקה ביומכנית של דגימות ירך בשלב 9 בפרוטוקול
ערכת תיאור חלבונים BCABeyotimeP0010Sלכימות חלבונים לפני Western blot בשלב 13 בפרוטוקול
CCK-8BeyotimeC0039למדידת כושר הישרדות תאים של BMMs בשלב 11 בפרוטוקול
Cytoscapeלא חללא חלגרסה 3.8.0
מאגר DAVIDלא חללא חלגרסה 6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
מאגר DisGeNETלא חללא חלhttps://www.disgenet.org/
ערכת גילוי כימולומינסנציה ECLVazymeE411-04להזהה כימולומינסנטית של אותות Western blot בשלב 13 בפרוטוקול
ערכת ELISA של OCNMEIMIANMM-0551M1למדידת רמות אוסטאוקלצין בסרום בשלב 8 בפרוטוקול
ערכת ELISA של β-CTXMEIMIANMM-44858M1למדידת רמות β-CTX בסרום בשלב 8 בפרוטוקול
מאגר GeneCardsלא חללא חלhttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830Aלהגברה qRT-PCR בשלב 12 בפרוטוקול
ציוד מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה (μCT)BrukerSkyscan 1176להדמיית מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה של מיקרו-מבנה עצם הירך בשלב 9 בפרוטוקול
נוגדן IL-1β BIOSSbs6319Rלהזהה של IHC בחלקי ירך בשלב 10 בפרוטוקול
נוגדן IκBαCST4812להזהה של Western blot בשלב 13 בפרוטוקול
מאגר Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) לא חללא חלhttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1להשראת התמיינות BMMs בשלב 11 בפרוטוקול
מאגר Metascapeלא חללא חלhttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120 Thermo Fisher ScientificBRE725531לניתוח LC-MS/MS של LWDHW בשלב 2 בפרוטוקול
נוגדן P65CST8242להזהה של Western blot בשלב 13 בפרוטוקול
נוגדן p-IκBαCST2859להזהה של Western blot בשלב 13 בפרוטוקול
נוגדן p-P65CST3033Sלהזהה של Western blot בשלב 13 בפרוטוקול
נוגדן p-P65Suzhou Ruiying RLP0187להזהה של IHC בחלקי ירך בשלב 10 בפרוטוקול
ערכת PrimeScript RT Reagent TakaraRR047Aלתעתוק הפוך של RNA סה"כ ב-BMMs לניתוח qRT-PCR בשלב 12 בפרוטוקול
מערכת QuantStudio 5Applied BiosystemsA28573לניתוח qRT-PCR של גנים אופייניים לתאי עצם בשלב 12 בפרוטוקול
RANKLAMIZONAAMK1001-S1להשראת התמיינות BMMs בשלב 11 בפרוטוקול
חיץ ליזה RIPAEpizyme BiotechPC101להפקת חלבונים סה"כ מ-BMMs בשלב 13 בפרוטוקול
ערכת טיהור מהיר של RNA TransGen BiotechER501-01-V2להפקת RNA סה"כ ב-BMMs בשלב 12 בפרוטוקול
תוכנת SPSS IBMגרסה 26לניתוח סטטיסטי של נתוני ניסוי בשלב 15 בפרוטוקול
מאגר STRING לא חללא חלhttps://string-db.org/
ערכת צביעת טרטראט-עמיד לחומצה פוספטאז (TRAP)AMIZONAAMK1001-S1לצביעת TRAP להזדהות וכימות של תאי עצם בשלב 14 בפרוטוקול
מערכת Thermo Vanquish UPLCThermo Fisher ScientificTSLC-002לניתוח LC-MS/MS של LWDHW בשל

מקורות

  1. Liang H, et al. Global epidemiology and burden of osteoporosis among postmenopausal women: insights from the Global Burden of Disease Study 2021. NPJ Aging. 2025;11(1):78.
  2. Yi YT, Zhao HF, Wang WZ, Li X. Osteosarcopenia: epidemiology, molecular mechanisms, and management. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1577758.
  3. Wang J, et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Front Public Health. 2023;11:1084005.
  4. Peris P, et al. Effect of gender on the evolution of pain and quality of life after treatment of symptomatic vertebral fragility fractures. Osteoporos Int. 2024;35(3):515-21.
  5. McClung MR. Sequential and long-term therapy for osteoporosis. Curr Osteoporos Rep. 2025;23(1):15.
  6. Tamechika S, Ohmura S, Maeda S, Naniwa T. Efficacy of denosumab on bisphosphonate-treated osteoporosis and osteopenia in systemic rheumatic disease patients receiving glucocorticoids. J Bone Miner Metab. 2023;41(2):203-11.
  7. Fuggle N, et al. Parathyroid hormone receptor agonists in the management of osteoporosis. Nat Rev Rheumatol. 2025;21(10):599-611.
  8. Curtis JR, et al. Comparative effectiveness of denosumab vs alendronate among postmenopausal women with osteoporosis. J Bone Miner Res. 2024;39(7):826-34.
  9. Thomasius F, et al. Clinical practice guideline: the diagnosis and treatment of osteoporosis. Dtsch Arztebl Int. 2025;122(1):12-18.
  10. Tan M, Li Q, Yang B, Wang S, Chen Z. Insight of Chinese herbal medicine in treating osteoporosis: achievements from 2013 to 2023. Am J Chin Med. 2024;52(5):1303-28.
  11. Qiu Z, et al. Liuwei Dihuang Pills alleviate the polycystic ovary syndrome with improved insulin sensitivity through PI3K/Akt signaling pathway. J Ethnopharmacol. 2020;250:111965.
  12. Zheng W, Wang G, Zhang Z, Wang Z, Ma K. Research progress on classical traditional Chinese medicine formula Liuwei Dihuang pills in the treatment of type 2 diabetes. Biomed Pharmacother. 2020;121:109564.
  13. Song J, et al. Liuwei Dihuang improved cognitive functions in SAMP8 mice by inhibiting COX-2 expression and subsequent neuroinflammation. J Ethnopharmacol. 2022;296:115491.
  14. Wang H, et al. Liu Wei Di Huang Decoction alleviates renal fibrosis by inhibiting endothelial mesenchymal transitions via upregulating Sirt1 expression and inhibiting the Wnt/β-catenin signaling pathway. Drug Des Devel Ther. 2025;19:6587-603.
  15. Zhou Z, et al. Transcriptional sequencing analysis reveals the potential use of deer antler for "tonifying the kidney and strengthening bone". J Orthop Surg Res. 2022;17(1):419.
  16. Liu Y, et al. Liuwei Dihuang Decoction for primary osteoporosis: a protocol for a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2019;98(16):e15282.
  17. Long Z, et al. Research on the mechanism of Liuwei Dihuang Decoction for osteoporosis based on systematic biological strategies. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:7017610.
  18. Liu B, et al. Liuwei Dihuang Decoction alleviates cognitive dysfunction in mice with D-galactose-induced aging by regulating lipid metabolism and oxidative stress via the microbiota-gut-brain axis. Front Neurosci. 2022;16:949298.
  19. Perry B, Zhang J, Saleh T, Wang Y. Liuwei Dihuang, a traditional Chinese herbal formula, suppresses chronic inflammation and oxidative stress in obese rats. J Integr Med. 2014;12(5):447-54.
  20. Wang L, You X, Zhang L, Zhang C, Zou W. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 2022;10(1):16.
  21. Luo J, et al. Oxidative stress and inflammation: roles in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1611932.
  22. Jing R, et al. Toll-like receptor 7 promotes periodontal inflammation and alveolar bone resorption through the NF-κB signaling pathway. J Periodontal Res. 2025;60(8):823-34.
  23. Tao H, et al. Urolithin A suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and postmenopausal osteoporosis by suppressing inflammation and downstream NF-κB-activated pyroptosis pathways. Pharmacol Res. 2021;174:105967.
  24. Xue C, et al. Aconine attenuates osteoclast-mediated bone resorption and ferroptosis to improve osteoporosis via inhibiting NF-κB signaling. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1234563.
  25. Zhang P, et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 2023;25(1).
  26. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  27. Xia C, Zhu H, Li J, Jin H, Fu D. Network pharmacology-based mechanism prediction and pharmacological validation of Bushenhuoxue formula attenuating postmenopausal osteoporosis in ovariectomized mice. J Orthop Surg Res. 2023;18(1):200.
  28. Gu Y, et al. Exploring the efficacious constituents and underlying mechanisms of Sini Decoction for sepsis treatment through network pharmacology and multi-omics. Phytomedicine. 2024;123:155212.
  29. Tian M, Wang K, Chen D. Efficacy and mechanisms of Xiangsha Liujunzi Decoction for gastroesophageal reflux disease: a study integrating meta-analysis, network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 2026;151:157766.
  30. Ma Y, et al. Multi-omics and experimental validation reveal the mechanism of Danxia Tiaoban Decoction in treating atherosclerosis. Phytomedicine. 2025;147:157216.
  31. Xia C, et al. β-catenin inhibition disrupts the homeostasis of osteogenic/adipogenic differentiation leading to the development of glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head. Elife. 2024;12.
  32. He Q, et al. Amlexanox enforces osteogenic differentiation and bone homeostasis through inhibiting ubiquitin-dependent degradation of β-catenin. Int J Biol Sci. 2024;20(13):5254-71.
  33. Feng X, et al. CX3CL1 promotes M1 macrophage polarization and osteoclast differentiation through NF-κB signaling pathway in ankylosing spondylitis in vitro. J Transl Med. 2023;21(1):573.
  34. Wang X, et al. Isoliquiritigenin alleviates periodontitis by suppressing inflammation via NF-κB signaling pathway of immune cell. J Inflamm Res. 2025;18:6133-48.
  35. Guo Q, et al. NF-κB in biology and targeted therapy: new insights and translational implications. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):53.
  36. Walker MD, Shane E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 2023;389(21):1979-91.
  37. Liang B, et al. Liuwei Dihuang pills attenuate ovariectomy-induced bone loss by alleviating bone marrow mesenchymal stem cell senescence via the Yes-associated protein-autophagy axis. Pharm Biol. 2024;62(1):42-52.
  38. Liu MM, et al. Therapeutic potential of Liuwei Dihuang pill against KDM7A and Wnt/β-catenin signaling pathway in diabetic nephropathy-related osteoporosis. Biosci Rep. 2020;40(9).
  39. Xie Y, et al. Clinical practice guideline for postmenopausal osteoporosis with traditional Chinese medicine. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2021;46(22):5992-8.
  40. Li YQ, et al. Astragaloside IV modulates oxidative stress and osteoimmune-Wnt signaling in ovariectomized rats: an integrated study of RNA sequencing, molecular docking, and experimental validation. Front Nutr. 2026;13:1785452.
  41. Zhao J, et al. Yishen Qianggu Mixture formulation suppresses osteometabolic inflammation by modulating the IL-17/NF-κB/MAPK signaling axis. J Ethnopharmacol. 2026;358:121011.
  42. Chen C, et al. Hydrolyzed egg yolk peptide prevented osteoporosis by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway in ovariectomized rats. Sci Rep. 2024;14(1):10227.
  43. Yang Y, et al. Nrf2 mitigates RANKL and M-CSF induced osteoclast differentiation via ROS-dependent mechanisms. Antioxidants (Basel). 2023;12(12).
  44. Wang Y, et al. Xian Huang Fang inhibits the PKCδ/MAPK signaling pathway to attenuate renal tubular epithelial cell senescence and thereby delay renal interstitial fibrosis. Drug Des Devel Ther. 2025;19:6991-7004.
  45. Niu MY, et al. Fanlian Huazhuo Formula alleviates high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by modulating autophagy and lipid synthesis signaling pathway. World J Gastroenterol. 2024;30(30):3584-608.
  46. Huang G, et al. Artemisia capillaris Thunb. water extract attenuates adriamycin-induced renal injury by regulating apoptosis through the ROS/MAPK axis. J Food Biochem. 2022;46(2):e14065.
  47. Zhao J, et al. Liuwei Dihuang Pills enhance osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells through the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmaceuticals (Basel). 2024;17(1).
  48. Zhang X, Xu D, Zhang R, Wang H, Yang G. Interaction between diabetes and osteoporosis: imbalance between inflammation and bone remodeling. Osteoporos Int. 2025;36(12):2401-9.
  49. Zhao W, et al. Osteoclast activation and inflammatory bone diseases: focusing on receptors in osteoclasts. J Inflamm Res. 2025;18:3201-13.
  50. Zeng J, et al. Comparison of donepezil, memantine, melatonin, and Liuwei Dihuang Decoction on behavioral and immune endocrine responses of aged senescence-accelerated mouse resistant 1 mice. Front Pharmacol. 2020;11:350.
  51. Wu Y, et al. Effect of Bifidobacterium on osteoclasts: TNF-α/NF-κB inflammatory signal pathway-mediated mechanism. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1109296.
  52. Zulfiqar Z, et al. Zn glycine attenuates LPS-induced inflammatory bone loss in geese through suppression of osteoclastogenesis via reducing TLR-4/NFκB signaling. Ecotoxicol Environ Saf. 2026;309:119655.
  53. Kingeter LM, Lin X. C-type lectin receptor-induced NF-κB activation in innate immune and inflammatory responses. Cell Mol Immunol. 2012;9(2):105-12.
  54. Zhao Y, et al. Trimethylamine-N-oxide promotes osteoclast differentiation and oxidative stress by activating NF-κB pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(10):9251-63.
  55. Zhang Q, et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 2021;34:43-63.
  56. Tseng YT, Chang FR, Lo YC. The Chinese herbal formula Liuwei Dihuang protects dopaminergic neurons against Parkinson's toxin through enhancing antioxidative defense and preventing apoptotic death. Phytomedicine. 2014;21(5):724-33.
  57. Xu Y, et al. Pharmacology-based molecular docking of 4-methylcatechol and its role in RANKL-mediated ROS/Keap1/Nrf2 signalling axis and osteoclastogenesis. Biomed Pharmacother. 2023;159:114101.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ביולוגיהגיליון 233אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעברנתיב השהור של NF-κBדלקת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.