פרוטוקול זה מתאר מודל של פצע כירורגי בעור חולדה הכולל תא לחות. המערכת מאפשרת הערכה של פורמולציות נוזליות למריחה מקומית, תרחיפי תאים, חומרים ביומטריים ותרופות אחרות לטיפול בפצעים.
מאמר שיטה
מודל של פצע כריתה בחולדה לבחינת תרופות בפצעי עור בגודל קריטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
פצעים בעור מהווים אתגר בריאותי עולמי מרכזי, הגורם לתחלואה ניכרת ולנטל כלכלי. מודלים של בעלי חיים, שהם מהימנים ורלוונטיים מבחינה קלינית, חיוניים לחקירת מנגנוני תיקון רקמות ולהערכת אסטרטגיות טיפוליות חדשות. עם זאת, מודלים קונבנציונליים של פצעים שגרו בבעירי מכרסמים מוגבלים בשל התכווצות מהירה של הפצע הנובעת מה-panniculus carnosus, השונה משמעותית מריפוי פצעים בבני אדם. ריפוי הפצעים בבני אדם מתרחש בעיקר באמצעות היווצרות רקמת גרנולומה (granulation tissue) ואפיתליזציה מחדש (re-epithelialization). מחקר זה מתאר מודל של פצע שגרו בחולדה שנועד להגביל את התכווצות הפצע תוך אספקת סביבה מוגנת לבדיקת התערבויות טיפוליות רגישות. פצעים שגרו בעומק מלא ברוחב 10-mm נוצרו בגבם של חולדות Sprague Dawley ויוצבו באמצעות טבעת O-ring מגומי ניטריל בוטדין (NBR) שקובעה בתפרים מקוטעים. כדי לשמור על סביבת פצע לחה, הוחלו האטם קוהזיבי של Eakin וסרט דביק שקוף ליצירת תא המתאים למתן מקומי של תאים, ביו-חומרים או תרכובות תרופתיות. שכבות הגנה נוספות, המורכבות מתחבשת ספוג, סרט דביק, תחבושת צינורית ומערכת קיבוע כפולה לכתפיים, שימשו כדי למנוע מהבעלי החיים להסיר את התחבושת. ריפוי הפצע נוטר במשך 14 ימים באמצעות פלנימטריה דיגיטלית והערכה היסטולוגית באמצעות צביעת hematoxylin and eosin. הפרוצדורה דרשה כ-30 min לכל בעל חיים והניבה תוצאות עקביות של ריפוי פצעים. טבעת ה-NBR O-ring שימשה כספלינט להגבלת התכווצות הפצע. הריפוי התרחש בעיקר באמצעות היווצרות רקמת גרנולומה ואפיתליזציה מחדש. התחבושות נשארו שלמות למשך עד שבעה ימים ללא עדות לזיהום. ניתוח היסטולוגי הדגים תיקון רקמות פעיל המאופיין ברגנרציה של האפידרמיס ובחדירת תאי דלקת. מודל זה מספק פלטפורמה להערכה פרה-קלינית של טיפולים בפצעים וטיפולים רגנרטיביים מתקדמים.
מבוא
פצעים בעור, כולל פצעים שקשיי ריפויים, משפיעים על יותר מ-40 מיליון מטופלים ברחבי העולם ומטילים נטל כבד על מערכות הבריאות, עם עלויות שנתיות של 22 מיליארד דולר עד שנת 2024. באירופה לבדה, 4 מיליון מטופלים סובלים מדי שנה מפצעים שקשיי ריפויים, שתופסים עד מחצית מהאשפוזים הדחופים הזמינים1. למרות התקדמויות בטכניקות כירורגיות, בפרקטיקה תוך-ניתוחית ובזמינותם של תחבושות מתקדמות לפצעים, חלק מהפצעים הם עמידים לטיפול, ובסופו של דבר יתפתחו סיבוכים. לכן, חיוני לפתח גישות טיפוליות חדשות הדורשות מודל חיה ניסיוני של פצעי עור כדי לבחון מגוון רחב של חומרים למריחה מקומית.
מבין המודלים החייתיים של פצעי עור ניסיוניים, כריתת עור היא הטכניקה הישומה ביותר ליצירת מודל של ריפוי פצעים2. מודל זה יכול לסייע בחקירת דימום, תגובות דלקתיות, גרנולציה, רי-אפיתליזציה, אנגיוגנזה ושחזור רקמות3. פצעי כריתה נוצרים בעיקר בגב החיה על ידי הסרה כירורגית של אזור עור מוגדר. הפצע צריך להיות בגודל קריטי כדי למנוע ריפוי ספונטני. פצע כריתה בגודל קריטי זה מספק גישה ישירה לבחינת יישום טופיקלי של כימיקלים, תאים או ביו-חומרים שונים ומעורבותם בתהליך הריפוי4,5.
מכרסמים ועור אנושי חולקים דמיון ב שלבים התאיים והמולקולריים של ריפוי פצעים, כולל המוסטזה, דלקת, פרוליפרציה (שגשוג) וremodelling (עיצוב מחדש). חולדות ועכברים הם המינים הנפוצים ביותר במודלים של פצעים בשל זמינותם, גודלם הקטן, הקלות היחסית של מניפולציה גנטית וקלות הטיפול בהם. חולדות מספקות מספר יתרונות מעשיים על פני עכברים, כולל גודל גוף גדול יותר ועור עבה יותר, המורכב משכבות רבות יותר של קרטינוציטים מאשר בעכברים. פצעים בעכברים מחלימים בדרך כלל תוך 7 ימים, בעוד שבחולדות ניתן להעריך את תהליך הריפוי לאורך כ-12–14 ימים6.
אתגר מרכזי הקשור לשימוש במכרסמים בעלי עור רפוי הוא התכווצות הפצע3. לעורם של מכרסמים יש שכבה של panniculus carnosus, המתכווצת בעקבות פציעה כדי להקטין את השטח החשוף. לעומת זאת, לפצעים בבני אדם יש יכולת מוגבלת להתכווץ, והם תלויים בגרנולציה ובre-epithelialization לצורך ריפוי7. גישה אחת להתגברות על מגבלותיהם של מודלים בבעלי חיים היא ביצוע קיבוע פיזי או ספלינט (splinting) של העור המקיף את אזור הפצע8. תאי פצע מטיטניום היו בין המכשירים שפותחו בהצלחה למניעת התכווצות פצעים9, אך היו להם חסרונות, כולל סטרס גבוה לבעלי החיים עקב משקל התא, מיקום כירורגי מורכב, פוטנציאל לתזוזת המכשיר, פוטנציאל לזיהום ועלות גבוהה. הקונספט של מודל הפצע עם הספלינט הוצג על ידי Galiano et al.10 בשנת 2004 באמצעות תפירת טבעת סיליקון קשיחה מסביב לשולי הפצע. גישה זו מפחיתה באופן ניכר את התכווצות הפצע11, אך יש לה מספר חסרונות ומגבלות, המתמקדים בעיקר ב פוטנציאל לנזק לרקמה רכה, שיעור גבוה של תזוזת הספלינט וריפוי פצעים לא עקבי. ספלינטים (כגון טבעות סיליקון קשיחות) עלולים לגרום ללחץ מוגבר על העור המקיף, מה שמוביל לאיסכמיה, גירוי ונמק, במיוחד אם הוחלו באופן שגוי. ספלינטים מסיליקון ננזקים, נשברים או נתזוזים לעיתים קרובות עקב תנועת בעלי החיים או טיפוח עצמי 8,11. תפרים לא אחידים יוצרים לעיתים קרובות מתיחה לא שווה סביב הפצע, מה שמוביל לריפוי לא עקבי. במודל המוצג כאן, טבעת O-ring מגומי ניטריל בוטדין (NBR) נתפרת לקצה פצע העור על ידי הנחת 8-12 תפרי פוליאמיד פשוטים ומקוטעים באופן אחיד מסביב לטבעת. גישה זו צפויה למזער את הסיכונים שהוזכרו לעיל ולהגביל מספיק את התכווצות הפצע, ובכך לאפשר לפצע להירפא באמצעות היווצרות רקמת גרנולציה ו-re-epithelialization, בדומה לתהליך ריפוי הפצעים בבני אדם. מנגנון ריפוי זה יסייע להעברת ממצאים ממודלים בבעלי חיים ליישומים קליניים.
תיאוריית ריפוי הפצעים בסביבה לחה הוצגה על ידי George D. Winter בשנת 1962 כקונספט לתכנון מוצרים לטיפול בפצעים12. בהתבסס על תיאוריה זו, פותחו במהלך העשורים האחרונים תחבושות שונות לפצעים, כגון גזות, סרטים שקופים, ספוגים והידרוגלים13. מנגד, בשנת 1974 תוכנן ופותח טבעת איטום הידרוקולואידית ניתנת לעיצוב עבור סטומיה, במטרה למנוע דליפות ולהגן מפניהן. ניתן לעצב ולמתח אותן בקלות כדי להתאימן לגבול הפצע, במיוחד ביישומים של טיפול בסטומה. במודל זה, איטום קוהזיבי מיושם על החלק החיצוני של הפצע, ויחד עם סרטים שקופים וסטריליים, הוא יוצר תא לח המדמה את המצב הקליני של מטופלים עם פצעי עור הנמצאים בטיפול, ובכך מקדם את האפיתליזציה של הפצע ומגן על חומרים מקומיים (למשל, תאים, ביו-מטריאלים, תרכובות) מפני דליפה.
חבישת פצעים היא חיונית להגנה על מצע הפצע מפני טראומה פיזית וזיהום מיקרוביאלי. חבישת פצעים בחולדות הייתה תמיד מאתגרת בשל הסבירות הנמוכה שלהן להכניע את החבישה. חולדות מסירות או הורסות לעיתים קרובות את החבישות על ידי נשיכה וקריעה כמעט מיד לאחר התאוששותן מההרדמה. דבר זה מקשה מאוד על שימור סוכנים טופקליים כגון תאים ותרופות, והופך את הגנת הפצעים מפני פתוגנים ומזהמים חיצוניים לבלתי אפשרית. זהו אתגר נוסף שיש להתמודד איתו במודל מכרסמים, במיוחד במחקרים הדורשים סביבה סטרילית, כגון בדיקות של תכשירים ביולוגיים, טיפול מבוסס תאים ותכשירים רפואיים טיפוליים מתקדמים. במודל המוצג כאן, נעשה שימוש בחבישת ספוג ובסרט דביק כדי לכסות את התא הלח. לאחר מכן נעשה שימוש בתחבושת גמישה בצורת צינור, תחבושת קיבוע וסרט מיקרופור כירורגי כדי להחיל חבישה כפולה בצורת הצטלבות על הכתף, על מנת למנוע מהחולדות להסיר או להזיק לתחבושות.
המודל המדווח כאן משלב מספר אלמנטים מפרוטוקולים שונים ופותח לאורך מספר שנים. המטרה הייתה לבסס מודל של פצע excised בחולדות באמצעות תא לח, אשר נסבל היטב על ידי בעל החיים ומקל על בדיקה של חומרים טופיקליים רגישים, ובמיוחד בצורה נוזלית.
פרוטוקול
כל הפרוצדורות בבעלי חיים המוצגות להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה של Linköping (מספר תיק Dnr 5163-2023), שוודיה. הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים ב- טבלת חומרים.
1. ניסויבעלי חיים בעלי מודעות
- השתמשו בחולדות Sprague Dawley זכרים בוגרות בגילאי 8–14 שבועות.
- לפני הניסוי, התאימו את החולדות למשך שבוע אחד לפחות למחזור של 12 שעות אור/חושך עם תזונה סטנדרטית.
2. הכנה טרום-ניתוחית
- הרד את בעל החיים באמצעות 1.5%–2.5% isoflurane (4.5% להשראה) מעורבב עם 1.0–1.5 L/min חמצן. הנח את בעל החיים במנח שכיבה על הבטן על משטח חימום כדי לשמור על חום הגוף. מרח סיכוך עיני כדי להגן על העיניים והנח 0.05 mg/kg Buprenorphine ממשקל הגוף, מדולל במי מלח, בהזרקה תת-עורית בגב בעל החיים להקלה על כאבים לאחר הניתוח.
הערה: חשוב להשתמש בשכבה דקה של משטח בידוד חד-פעמי בין בעל החיים למשטח החימום.
זהירות: Isoflurane הוא מדכא מערכת עצבים מרכזית וגירוי נשימתי. השתמש במאייד מכויל עם מערכת פעילה לפינוי גזים כדי למנוע חשיפה לאדים. - גלה את אזור הגב באמצעות מכונת גילוח חשמלית מבסיס הצוואר ומטה למרחק של כ-10 cm. נקה ביסודיות את האזור המגולח פעמיים עם chlorhexidine ו-70% ethanol, ולאחר מכן כסה את בעל החיים בסדין כירורגי עם חלון (fenestrated) החושף רק את האזור שנוקה.
3. יצירת פצע כריתה
- השתמשו במכשור כירורגי סטרילי מתאים, כגון מספריים ופינצטה.
- סמנו מעגל בקוטר 10 mm באמצעות שבלונה וטושים כירורגיים קבועים, כ-4 cm זנבית (caudal) לבסיס הצוואר.
- אחזו במרכז העור המסומן באמצעות פינצטה וכסרו את רקמת העור המסומנת בעזרת מספריים. עומק הפצע צריך להגיע עד לפסציה (fascia) השטחית. ניתן לזהות זאת על ידי שחרור העובי המלא של העור וויזואליזציה של הפסציה החצי-שקופה המכסה את השריר.
- מקמו טבעת NBR O-ring על קצה פצע העור וקבעו אותה במקומה באמצעות 8-12 תפריים. מטרת קיבוע הטבעת היא למנוע התכווצות של העור. ודאו כי התפרים הראשוניים ממוקמים בשעה 12, לאחר מכן בשעה 6, בשעה 3 ובשעה 9. במקרה של 8 תפרים, תפרו כל תפר במרכז המרווח שבין כל שני תפרים ראשוניים (איור 1A).
- מרחו איטום קוהזיבי (cohesive seal) מחוץ לטבעת ה-NBR O-ring, תוך ניצול תכונות ההדבקה שלו, כדי לבנות תא לחร่วม עם סרט שקוף, דביק וסטרילי (איור 1B). בשלב זה, הפצע מקובע באמצעות טבעת ה-NBR O-ring, ודפנות תא היישום נוצרות הן מקצה העור והן מהאיטום הקוהזיבי; הרצפה נוצרת על ידי פני השטח של הפצע הפתוח, בעוד הגג נוצר על ידי הסרט השקוף.
- כסו את הפצע בשכבה אחת של הסרט, ולאחר מכן הגישו את תמיסת הטיפול (תמיסת תאים או תמיסת תרכובת) דרך הסרט אל פני השטח של הפצע. תא בגודל המתואר יכיל בקלות 100 µL.
- כסו את נקודת ההזרקה בשכבה נוספת של הסרט כדי למנוע דליפה של הטיפול (איור 1C).
- כסו את הסרט בתחבושת סיליקון רכה כדי להגן על הסרט (איור 1D).
- הדביקו סרטי הדבקה (איור 1E), ולאחר מכן תחבושת צינורית אלסטית, בתצורת "כתף כפולה" מסביב לחולדה עם תחבושת קיבוע וסרטי micropore כירורגיים (איור 1F–H).
- גזרו את ציפורני החולדות כדי למנוע מהן לקרוע את התחבושת.
- הזריקו carprofen (במינון 5 mg/kg ממשקל הגוף), מדולל בסליין, תת-עורית לבעל החיים לפני הפסקת ההרדמה.
4. פרוצדורות לאחר הניתוח
- השאירו את בעל החיים על משטח החממה, כשהוא מכוסה בשמיכה, עד להתעוררות מההרדמה. מקמו את בעלי החיים בכלובים נפרדים או בכלוב אחד עם מחיצה כדי למנוע נשיכות הדדיות והסרה של התחבושת.
- החדירו קרפרופן (carprofen), במינון של 5 mg/kg למשקל גוף, מדולל בתמיסת סלין, בהזרקה תת-עורית למחרת בבוקר לניהול כאבים לאחר הניתוח. יש לנטר את החולדות מדי יום כדי לזהות כאבים לאחר הניתוח או ירידה במשקל, וניתן להעניק מנה נוספת של משככי כאבים במידת הצורך.
5. מדידות פצע והחלפת חבישות
- יש לבחון כל בעל חיים מדי יום בשבוע הראשון לאחר ניתוח הפצע. יש לבדוק את התחבשה ולתקנה במידה והבעלי חיים מתקשים לנוע או מפגינים אי-נוחות.
- יש להחליף את התחבשה ביום ה-7 בעוד בעל החיים תחת הרדמה, כפי שמתואר בשלב 2.1.
- יש להסיר בעדינות את כיסוי התחבשה מהעור. יש לצלם תמונות של הפצע עם סרגל לצורך קנה מידה. התמונות נותחו באמצעות תוכנת Fiji/ImageJ על מנת להעריך את שטח פני הפצע.
- יש לבצע מדידות או הליכים אחרים בהתאם לצורכי החוקר.
- יש להניח תחבשה נקייה כבשלבים 3.8–3.11 ולאפשר לבעל החיים להתאושש כפי שמתואר בשלב 4.1.
6. איסוף פצעים והטלה
- יש להנחיר הרדמה כפי שצוין בסעיף 2.1 ביום ה-14, או בהתאם לתוכנית הניסויית הספציפית. יש להסיר את התחבושת ולצלם את אתרי הפצעים.
- יש להסיר את התחבושת ולצלם את אתרי הפצעים.
- יש לאסוף רקמת עור מהפצע. בעזרת סכין מנתחים, יש לחתוך את העור מסביב לפצע, כולל חלק מרקמה בריאה.
- יש להניח את הרקמה הגזוזה בתוך מבחנה של 2 mL ולהקפיא אותה במהירות בחנקן נוזלי לצורך אנליזה מולקולרית מאוחרת, או לשמור אותה בפורמלהידK מנויד בריכוז 4% בטמפרת החדר לצורך היסטולוגיה. לחלופין, ניתן לחתוך את הרקמה לשני חלקים כדי לבצע את שתי הבדיקות.
- לאחר הסרת רקמת הפצע, יש להקרין את בעל החיים באמצעות שאיפת CO2 או בשיטה חלופית בהתאם לאישור האתי.
אזהרה: CO2 גורם לכאב, למצוקה ולהחמצה מהירה של ריריות לפני אובדן ההכרה. יש להשתמש במד ספיקה מווסת כדי להחליף את האוויר בתא.
7. צביעה היסטוכימית: קיבוע פצע, הטבעה וחיתוך
- קבע את הביופסיות של רקמת הפצע בתמיסת פורמלהיד 4% למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שמור אותן בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה.
זהירות: פורמלהיד הוא רעיל, מעורר רגישות חזק ומסרטן ידוע בבני אדם. יש לטפל בתמיסה במCב מנדף כימיים תוךneath לבישת ציוד מיגון אישי. - שטוף את הביופסיות פעמיים ב-PBS למשך 30 דקות בכל פעם.
- החלף את ה-PBS באתנול (70%) ושמור בטמפרטורה של 4 °C.
- שמור את הביופסיות למשך מקסימום 24–48 שעות לפני העיבוד כדי למנוע אובדן אנטיגנים, או למשך 1–2 שבועות לצורך אפיון היסטולוגי פשוט.
- שטוף את הביופסיות היטב תחת ברז זורם כדי להסיר שאריות פורמלהיד.
- בצע דהידרציה לרקמה באמבטיות אתנול בסדר הבא: אתנול 70% למשך 20 דקות; 2 החלפות של אתנול 95% למשך 20 דקות כל אחת; 2 החלפות של אתנול 100% למשך 20 דקות כל אחת.
- שמור את הביופסיות בטמפרטורה של 65 °C באמבט פאראפין.
- שפוך את הפאראפין המומס לתבנית המיועדת, תוך הצבת הביופסיות במרכז, והנח לו להתקרר ולהתמצק. יש להכווין את הביופסיות בניצב לפני השטח של התבנית כדי לאפשר ויזואליזציה של כל שכבות העור בעת החיתוך.
- בצע חיתוך של בלוק הרקמה הטבול בפאראפין בעובי של 5 μm באמצעות מיקרוטום, והצף את החתכים באמבט מים בטמפרטורה של 39 °C המכיל מים דה-יוניים.
- העבר את החתכים לשקופיות וייבש אותם, כדי לאפשר לרקמה להיצמד לפני השטח של השקופית. ניתן לשמור את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C לשימוש מאוחר יותר או לעבדן מיד לצורך צביעה היסטוכימית.
8. צביעת המטוקסילין ואוזין (HE)
- בצעו הסרת שעווה מהשקופיות על פלטות חימום בטמפרטורה של 60 °C למשך 30 min, לאחר מכן ב-3 החלפות של xylene (או תחליף אחר) למשך 5 min כל אחת, ולאחר מכן בהחלפה אחת של PBS למשך 2 min.
זהירות: Xylene הוא רעיל ודליק מאוד. יש לטפל בתמיסה במנדף כימיים, תוך יישום אמצעי מיגון אישיים סטנדרטיים. - בצעו רהידרציה ב-100% ethanol, ב-96% ethanol, ולאחר מכן ב-dH2O למשך 5 min כל אחד.
- בצעו צביעה ב-hematoxylin למשך 5 min, ולאחר מכן שטפו במי ברז זורמים למשך 5 min.
- בצעו דיפרנציאציה עם 0.3% acid alcohol (0.3% hydrochloric acid ב-70% ethanol) למשך מספר טבילות, ולאחר מכן שטפו במי ברז זורמים למשך 5 min.
- צבעו ב-Eosin Y (0.2%) למשך 30 s, ולאחר מכן שטפו במי ברז זורמים למשך 5 min.
- בצעו דהידרציה ב-96% ethanol למשך 1 min, וב-100% ethanol למשך 1 min.
- טפטפו מספר טיפות של מדיום סגירה (mounting medium), ולאחר מכן הניחו את זכוכית הכיסוי.
- בחנו את השקופיות תחת מיקרוסקופ אור וצלמו תמונות דיגיטליות.
תוצאות
ניתוח מודל פצע חתור בחולדה ארך כ-30 דקות לבעל חיים כאשר בוצע ביעילות. השלבים השונים של יצירת המודל, קיבוע טבעת ה-O-ring והחבישה מוצגים ב-איור 1.
איור 2 מראה את התקדמות ריפוי הפצע בימים 7 ו-14. רדיוס הפצע נמדד ב-mm, ושטח הפנים חושב באמצעות הנוסחה (area = πr2) כאשר r = 5 mm ביום 0. התקדמות סגירת הפצע יוצגה כאחוז השטח שאינו מכוסה ביחס לשטח הפצע שהושרה ביום 14. באמצעות תוכנת Fiji/ImageJ, נותחה תמונה דיגיטלית של שטח הפצע, כאשר קנה המידה כויל ל-10 mm באמצעות סרגל שנכלל בתמונה (איור 2D). לאחר ששטח הפצע סומן ונמדד, השטח הוצג ב-mm2. שטח הפצע שנותר ביום 14 (29.4% ± 10.1%; n = 7) מוצג ב-איור 3.
צביעת HE של פצע העור ביום 14 מוצגת באיור 4. החתכים הראו כי הביופסיות עקבו אחר הריפוי הטבעי של פצעי עור, מההיקף למרכז. ריפוי הפצע נותרים חלקי, כאשר המרכז היה נטול מהמבנה הרב-שכבתי הקלאסי הנורמלי עם שכבת אפדרמיס דקה. הדרמיס הראה חדירה שופעת של תאי דלקת, שהיא חשובה לתהליך הריפוי הפיזיולוגי. באופן כללי, המודל התקבל היטב על ידי בעלי החיים, עם עיכוב של התכווצות העור וריפוי פיזיולוגי אך חלקי.
איור 1: יצירת פצע כירורגי (Excisional wound) והליך החבישה. (A) פצע כירורגי שנוצר על פני השטח הגבי של החולדה, כאשר טבעת O-ring תפורה מסביב לשולי הפצע. (B) טבעת מחסום הידרוקולואידית ניתנת לעיצוב שהוחלה מסביב ל-O-ring. (C) שתי שכבות של חבישת סרט דביק שקוף שהוחלו מעל טבעת המחסום ההידרוקולואידית. (D) חבישת ספוג שהונחה מעל חבישת הסרט הדביק השקוף. (E) סרט דביק אלסטי שהוחל כדי לקבע את החבישה. (F–H) תחבושת קיבוע צינורית שהוחלה סביב החולדה, ולאחריה תחבושת קיבוע וסרט כירורגי המסודרים בתצורת "כתף כפולה" כדי לקבע את החבישה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של ריפוי פצע. (A) תמונת פצע מייצגת שצולמה ביום 7. (B–D) תמונות פצע מייצגות שצולמו ביום 14, המראות את הפצע כאשר טבעת ה-O במקומה (B) ולאחר הסרת טבעת ה-O (C,D). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות של שטח הפצע ביום 14. אחוז שטח הפצע שנותר ביום 14, המדגים את ההפחתה בגודל הפצע. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD) (n = 7). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 4הערכה היסטולוגית של ריפוי פצעים ביום ה-14חתכים מייצגים של רקמת פצע שצבעו בהמטוקסילין ואאוזין (HE) בהגדלה של 10×, 20×, ו-40× הגדלה. מרכז הפצע הראה רה-אפיתליזציה חלקית, בעוד שבשולי הפצע נצפתה החלמה אפידרמלית פיזיולוגית. הדרמיס הכיל תאי דלקת בשפע, באופן העולה בקנה אחד עם תגובת ריפוי פצעים נורמלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של דמות זו.
דיון
פצעי עור שקשיי ריפוי הם פצעים שאינם מתקדמים דרך שלבי הריפוי הרגילים בלוח הזמנים הצפוי, ויכולים להיות תוצאה של הליכים כירורגיים, טראומה ותגובות אלרגיות, בנוסף להיותם משניים לבעיות בריאותיות רבות אחרות, כולל אי-ספיקה וסקולרית, סוכרת והשמנה14. למרות זמינותן של מספר שיטות טיפול, מטופלים רבים אינם מחלימים כראוי. חקירת נתיבי טיפול חדשים, כגון תרפיות מבוססות תאים, חומרים כימיים, תמציות צמחים ותרכובות שהתגלו לאחרונה, היא חיונית לזיהוי אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. ניתן להחיל את המודל על מגוון רחב של מחקרים בנושא ריפוי פצעים. ביסוס של פרוטוקול סטנדרטי לבדיקת תרופות, תאים וטיפולים ביולוגיים עשוי להקל על מחקרים פרה-קליניים של ריפוי פצעים. מודל פצעי החיתוך והפרוטוקול המתוארים כאן נותנים מענה למגבלות העיקריות של מודל פצעי עור בחולדה במחקר: כלומר, התכווצות העור וחבישת הפצע.
ספלינטים מטיטניום נמצאים בשימוש נפוץ להפחתת התכווצות פצעים במודלים של פצעים חיתוכיים בעכברים; עם זאת, לשימוש בהם יש מגבלות. קשיחות הספלינט משנה את הסביבה המכנית של הפצע והרקמה הסובבת אותו, דבר שעשוי להשפיע על תגובות תאיות, דלקת ושכתוב המטריקס. כתוצאה מכך, הריפוי מתרחש בתנאים השונים מאלו של עור מכרסמים שאינו מטופל. בעוד שהגבלת ההתכווצות משפרת את ההשוואה לסגירת פצעים בבני אדם, המגבלות המכניות המוטלות על ידי הספלינט עלולות להוביל לארטיפקטים המשפיעים על תהליך הריפוי, ויש לקחתם בחשבון בעת פרשנות הממצאים הניסויים15.
לשם כך, נעשה שימוש בטבעות O-rings מחומר NBR במודל כדי להגביל את התכווצות העור, והן קובעו לקצה הפצע המקורי. הטבעות התקבלו היטב על ידי החיות ונשארו מקובעות במקומן לאורך 14 ימי הניסוי. למרות שלא נצפתה איכותית התכווצות משמעותית של הפצע באף אחת מהחיות, קקיעת סימנים (tattooing) של קצה הפצע או שימוש בשיטות כמותיות אחרות יחזקו את הערכת התכווצות הפצע במחקרים עתידיים. לפיכך, ניתן להחשיב את הקקיעה כשלב רשות בפרוטוקול זה.
יישום תחבושות הגן על הפצעים מפני זיהום ודלקת תוך שמירה על הטיפול באתר הפצע, דבר שהוא קריטי עבור מודלים של ריפוי פצעי עור. עם זאת, מקרה שבו בעלי חיים מסירים סוגים שונים של תחבושות אינו נדיר. חולדות נוטות לטבטב ולמניפולציה של אזור הפצע, מה שעלול להוביל להסטת התחבושת או להסרה מלאה שלה, למרות שימוש בסרטי דבק או בשיטות קיבוע משניות. אובדן כיסוי התחבושת עלול לשנות את סביבת הפצע, להשפיע על מתן הטיפול ולהגביר את השונות בין בעלי החיים16. במודל המוצג כאן, התחבושת נותרה שלמה למשך עד 7 ימים, מבלי שהוסרה או ניזוקה על ידי בעלי החיים. לא נצפו סימנים לזיהום פצעי עור באף אחד מבעלי החיים הניסיוניים. מומלץ להחליף את התחבושות מדי שבוע, כיוון שההתאמה הופכת צמודה יותר ככל שבעלי החיים גדלים ועולים במשקל. יש להקפיד על איזון בין קיבוע מאובטח לבין ניידות בעלי החיים, תוך הבטחה שהתחבושת אינה רפויה מדי ואינה ניתנת להסרה על ידי בעלי החיים.
הפרוטוקול הוא גמיש וניתן להתאמה. בעוד שאנו ממליצים על הרדמה באמצעות שאיפת isoflurane בשל ההתאוששות המהירה והבטיחות הגבוהה, חוקרים עשויים להשתמש לחלופין בהרדמה הניתנת בהזרקה, כגון ketamine/xylazine, במידה ומאיד isoflurane אינו זמין. אף על פי שבמחקר זה נעשה שימוש בחולדות זכר בלבד, הפרוטוקול רלוונטי באותה מידה גם לחולדות נקבה.
אנו ממליצים על מתן משככי כאבים של buprenorphine בשילוב עם carprofen, דבר המגביר את הקלה על הכאב. buprenorphine לבדו עשוי לספק אלגזיה לאחר ניתוח מספקת בשל משך הפעולה הארוך יחסית שלו. לתרופה זו יש השפעה מינימלית על התפקוד החיסוני, בהשוואה לאופיואידים אחרים, מה שמהווה יתרון לריפוי פצעים בהתאם לתהליך הדלקתי17. יש להימנע משימוש בתרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (NSAIDs), המדכאות דלקת ומפחיתות כאב, כאשר חוקרים דלקת. למרות שבמחקר זה נוצר פצע אחד לכל בעל חיים, החוקרים יכולים ליצור פצעים נוספים באמצעות אותו פרוטוקול, בהתאם לאישור האתי ולתכנון הניסויי שלהם. יש לשקול בקפידה שיקולי רווחת בעלי חיים ואת עקרונות ה-3Rs. על החוקרים לציית לעקרונות ה-3Rs (החלפה, הפחתה ושיפור) ולכבד את רווחת בעלי החיים בעת שימוש במודלים של בעלי חיים. הליכים כירורגיים חייבים להיות תואמים להנחיות ולפעול בקפידה לפי הפרוטוקול המאושר לבעלי חיים. במחקר זה, ריפוי הפצע הוערך על ידי מדידות שטח הפצע והערכה היסטולוגית, כאשר רפיתליזציה (re-epithelialization) מייצגת מרכיב אחד בתגובת הריפוי. נוכחות התפרים ביחס לקיבוע הטבעת עלולה להפריע לריפוי המקומי. מספר התפרים חייב להיות עקבי בין בעלי החיים. הערכת שטח הפצע צריכה לכלול את כל האזורים הגלויים, כולל את נקודות התפירה18. ניתן לפתח מודל זה כך שיכלול מצבים תחתונים שונים הקשורים לפצעי עור, כגון איסכמיה, סוכרת והזדקנות. המגבלות העיקריות של מחקר זה היו היעדר קבוצת ביקורת ללא ספלינט, חסרון של הערכה כמותית של התכווצות הפצע, ומדדי תוצאה ביולוגיים כמותיים מוגבלים מעבר להערכת שטח הפצע והיסטולוגיה תיאורית. אתגרים טכניים שונים ופתרון בעיות היו ניכרים במהלך פיתוח מודל זה. התאמה נכונה של חסית המגן/תחבשת חיונית לרווחת בעל החיים ולריפוי מוצלח של הפצע. תחבשת רפויה עלולה להיות מוסרת על ידי בעל החיים לאחר התאוששות מההרדמה, בעוד שתחבשת הדוקה מדי עלולה להגביל את התנועה, לפגוע בזרימת הדם או להשפיע על הנשימה. התחבשת צריכה לאפשר מקום מספיק לאצבע אחת (או לזרת עבור חולדות קטנות יותר) בין התחבשת לעור. יש לנטר את בעלי החיים מדי יום, ויש להתאים את התחבשת אם נצפים סימנים של אי-נוחות, פגיעה בניידות או תנוחה לא תקינה. ניהול כאב לאחר ניתוח עשוי להשתנות בין בעלי חיים בודדים בשל הבדלים ברגישות למשככי כאבים. יש להעריך באופן קבוע את בעלי החיים לאיתור סימנים הקשורים לכאב, כולל גיבנת (hunching), ירידה בפעילות, ירידה בתיאבון ואיבוד משקל. יש לספק אלגזיה נוספת במידת הצורך בהתאם להנחיות המוסדיות. קיבוע עקבי של הטבעת הוא קריטי למניעת התכווצות הפצע. 8–12 תפריים פשוטים ומקוטעים צריכים להיות מפוזרים באופן שווה סביב הטבעת כדי לחלק את המתח באופן אחיד ולמנוע הרמה או עיוות. כל תפר צריך להיות מאובטח בקשר כירורגי כדי למזער התרופפות במהלך ההתאוששות. לבסוף, אנו ממליצים להשתמש בחולדות מאותו זן, גיל, משקל גוף ומין בתוך מחקר נתון כדי למזער שונות. כמו כן, אותו חוקר מנוסה יכול לבצע את כל ההליכים הכירורגיים. כדי למנוע הטיות, אנו ממליצים להשתמש בסמיות כפולה (double blinding) לניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים.
גילויים
למחברים אין ניגודי תחומי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
המחברים ברצונם להודות למחוז Östergötland על מימון מחקר זה. המחברים מודים למר אנדרס דלסקוג (Anders Delleskog) מה-CBR באוניברסיטת לינקפינג (Linköping University) על הצעות, תמיכה וסיוע בהקמת המודל החייתי. המחברים מודים גם לד"ר מריה נצוני (Maria Ntzouni) מה-Core Facility באוניברסיטת לינקפינג על תמיכה והדרכה בטמיעת רקמת עור, חיתוך וצביעת HE. תודה מיוחדת לסלאם עבדאללה (Sallam Abdallah) ב-R&יחידה 38D לעור ותאים מתורגבים, אוניברסיטת Linköping, עבור הכנת דגימות עור וצביעת HE.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בופרנורפין | Salfarm Scandinavia | 451790 | ריכוז 0.3 mg/mL |
| קרפרופן | Zoetis Animal Health | 191380 | Rimadyl 50 mg/mL |
| אטם איקין (Eakin seal) | Swemed | 2076152 | עובי 3 מ"מ |
| עמדת הטמעה | Leica Biosystems | EG1150 H&C | |
| אוסין | היסטולב | 1650 | תמיסת צבע בריכוז 0.2% |
| אתנול מוחלט | Solveco | 1015 | בדרגת ניתוח (Analytical grade) |
| תחבושת קיבוע | Swemed | 2048934 | 4 ס"מ x 4 מ' PA/ויסקוז |
| פורמאלדהיד | Histolab | 2176 | 4% ב-PBS, pH 7.2-7.4 |
| קוצץ שיער | סוואבט (Swevet) | F95000 | אורך חיתוך: 0.5 מ"מ |
| המטוקסילין | היסטולב | 1800 | Harris HTX |
| Histolab-Clear | Histolab | 14250 | תחליף לקסילן |
| איזופלורן | VM Pharma | 448210 | Attane vet 1000 mg/g |
| Lekotape | Swemed | 2056774 | |
| Mepilex | Swemed | 2059125 | 7.5x8.5 ס"מ |
| סרט Mepore | Swemed | 2057753 | 6x7 ס"מ עם מסגרת |
| סרט הדבקה כירורגי מיקרופורי | Swemed | 2063856 | 1.2 ס"מ x 9.1 מ'" |
| מיקרוטום | Thermo Fisher Scientific | 387861 | Microm HM355S |
| תוך סגירה | היסטולב | 00840-05 | פרטקס |
| אטב גומי (O-ring) | רוילוגוד | B0B1TRQBRT | קוטר פנימי 11 ממ', רוחב 1 ממ' |
| תפר (ethilon 4-0) | Scandivet | 21274-A | פוליאמיד לא-ספיג |
| התייבשות רקמה | Leica Biosystems | Leica TP1020 | |
| Tubifast במתיחה דו-כיוונית | Swemed | 2069292 | 7.5 ס"מ x 10 מטר PES/PA |
מקורות
- Europe advanced wound care market size & share 2025-2034: market size by product, by application, by end use, regional forecast. Global Market Insights. Available from: https://www.gminsights.com/industry-analysis/europe-advanced-wound-care-market.
- Nauta AC, Gurtner GC, Longaker MT. Adult stem cells in small animal wound healing models. In: Gourdie RG, Myers TA, editors. Wound Regeneration and Repair Methods and Protocols. New York (NY): Humana Press; 2013. p. 81-98.
- Masson-Meyers DS, et al. Experimental models and methods for cutaneous wound healing assessment. Int J Exp Pathol. 2020;101(1-2):21-37.
- Wong VW, et al. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011;2011:969618.
- Shahin H, et al. MicroRNA-155 mediates multiple gene regulations pertinent to the role of human adipose-derived mesenchymal stem cells in skin regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 2024;12:1328504.
- Ojeh N, et al. The Wound Reporting in Animal and Human Preclinical Studies (WRAHPS) guidelines. Wound Repair Regen. 2024;33(1):e13232.
- Flynn K, et al. Chronic wound healing models. ACS Pharmacol Transl Sci. 2023;6(5):783-801.
- Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
- Nuutila K, et al. Titanium wound chambers for wound healing research. Wound Repair Regen. 2016;24(6):1097-1102.
- Galiano RD, Michaels J, Dobryansky M, Levine JP, Gurtner GC. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 2004;12(4):485-492.
- Miller AW, Anderson AR, Suarez-Arnedo A, Segura T. Wound healing splinting devices for faster access and use. JID Innov. 2024;5(2):100332.
- Winter GD. Formation of the scab and the rate of epithelialization of superficial wounds in the skin of young domestic pig. Nature. 1962;193:293-294.
- Laurano R, Boffito M, Ciardelli G, Chiono V. Wound dressing products: a translational investigation from the bench to the market. Eng Regen. 2022;3(2):182-200.
- Rhea L, Dunnwald M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. 2020;(162):61616.
- Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
- Bae SH, Bae YC, Nam SB, Choi SJ. A skin fixation method for decreasing the influence of wound contraction on wound healing in a rat model. Arch Plast Surg. 2012;39(5):457-462.
- DeMarco GJ, Nunamaker EA. A review of the effects of pain and analgesia on immune system function and inflammation: relevance for preclinical studies. Comp Med. 2019;69(6):520-534.
- Jorgensen LB, Sorensen JA, Jemec GBE, Yderstraede KB. Methods to assess area and volume of wounds: a systematic review. Int Wound J. 2016;13(4):540-553.