הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודלים תאיים לחקר מחלת אלכסנדר: ניתוח תפקודי של אסטרוציטים ראשוניים מחולדות

108 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72930

⸱

8 בספטמבר 2026

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University, 2School of Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

במאמר זה

סיכום

פיתחנו מודל של אסטרוציטים ראשוניים מחולדה המספק מערכת רלוונטית פיזיולוגית לחקר מחלת אלכסנדר (AxD), המאפשרת בחינה של אגרגציה של GFAP, מודיפיקציה פתולוגית ותפקוד לקוי של אסטרוציטים. מערכת זו מגשרת בין מחקרים in vitro לבין מחקרים in vivo, ומציעה פלטפורמה חסונה לחקר הפתולוגיה של AxD ולזיהוי מטרות טיפוליות למחלות נוירודגנרטיביות.

תקציר

אסטרוציטים ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על ההומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית, בתמיכה בתפקוד נוירונלי ובתגובה לפציעות או למחלות. הפרעה בפעילות האסטרוציטים מזוהה יותר ויותר כגורם מרכזי להפרעות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלכסנדר (AxD), מצב נדיר וקטלני הנגרם על ידי מוטציות בחלבון חומצה גליאלית פיברילית (GFAP). מוטציות אלה מובילות לאגרגציה של GFAP, להיווצרות סיבי רוזנתל (Rosenthal fibers) ולתפקוד אסטרוציטי לקוי הולך וגובר. בעוד שמודלים של בעלי חיים in vivo מציעים סביבה תאית מורכבת, הן המודלים הנוכחיים in vitro והן אלה in vivo מתמודדים עם מגבלות בשחזור מדויק של ההקשר התאי והתפקודים המורכבים של אסטרוציטים. כדי לטפל בכך, פיתחנו מודל תאי המשתמש באסטרוציטים ראשוניים של חולדות המופקים מחולדות מסוג בר (WT) ומחולדות מודל של AxD, במטרה לחקור את ההשפעות התפקודיות של מוטציות ב-GFAP. מערכת רלוונטית פיזיולוגית זו מאפשרת חקירה מפורטת של מנגנונים ספציפיים לאסטרוציטים, כולל אגרגציה של GFAP, תגובות לעקה חמצונית ושינויים פתולוגיים. עבור חוקרים שאין להם גישה לחולדות מודל של AxD, טרנסדוקציה לנטיביריאלית מציעה שיטה חלופית להחדרת מוטציות GFAP הקשורות ל-AxD לאסטרוציטים המופקים מחולדות נורמליות, ובכך מרחיבה את יישומיותה של גישה זו. בהשוואה לקווי תאי אסטרוציטים מונצחים או למחקרים in vitro המשתמשים בחלבון רקומביננטי, אסטרוציטים ראשוניים משמרים טוב יותר את הארכיטקטורה התאית והפרופילים המולקולריים הטבעיים, ומספקים פלטפורמה חסונה לחקר הדינמיקה, המסיסות והתגובות האסטרוציטיות לגורמי עקה כגון נזק חמצוני ושינויים פתולוגיים. מודל תאי זה מגשר על הפער בין מחקרים מולקולריים למערכתיים, ומספק מסגרת ניסוית מבוקרת לבחינת תפקוד לקוי של אסטרוציטים ב-AxD. על ידי השלמה של מתודולוגיות קיימות, תרביות של אסטרוציטים ראשוניים משפרות את הבנתנו את הפתולוגיה של AxD ומהוות כלי בעל ערך לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות למחלות נוירודגנרטיביות.

מבוא

אסטרוציטים הם תאי גליה מיוחדים הנפוצים בכל מערכת העצבים המרכזית (CNS), וממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על ההומאוסטזיס של המוח, בוויסות הפעילות הנוירונלית ובתגובה לפציעות או למחלה1. תפקידיהם כוללים פינוי ומיחזור של מוליכים עצביים, שמירה על הומאוסטזיס של מים ויונים חוץ-תאיים, ותמיכה בתפקוד מעגלים עצביים. מולקולות המופרשות על ידי אסטרוציטים חיוניות להתפתחות סינפסות ולפלסטיות סינפטית במוח הבוגר2. בתגובה לפציעה או למחלה במערכת העצבים המרכזית, עוברים אסטרוציטים שינויים ריאקטיביים שיכולים לתווך אותות פרו-דלקתיים או אנטי-דלקתיים, מה שמאפשר תפקודים נוירופרוטקטיביים אך עשוי לתרום לפתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית, תלוי בהקשר3. הפרעה בוויסות התפקוד של האסטרוציטים מוכרת יותר ויותר כגורם מפתח לבריאות ולמחלה במערכת העצבים המרכזית4,5.

חלבון חומצה גליאלית פיברילית (GFAP), חלבון פילמנט ביניים (IF) מסוג III, הוא מרכיב שלד תאי מרכזי של אסטרוציטים, המבוטא ברוב האסטרוציטים אך לא בכולם. ביטוי ה-GFAP עולה בעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזית (CNS), והוא משמש כסמן לחומרת הנזק לרקמה.6על אף ש-GFAP מקושר באופן מסורתי לתפקידים מבניים7, אך השלכותיה התפקודיות נותרו לא חקורות דיו. מוטציות ב-GFAP גורמות למחלת אלכסנדר (AxD)8, הפרעה נוירודגנרטיבית נדירה המאופיינת באגרגציה של GFAP, ביצירת סיבי רוזנثال (Rosenthal fiber) ובדיספונקציה פרוגרסיבית של אסטרוציטים. בעוד ש in vitro מחקרים ביוכימיים9,10,11 ו- in vivo מודלים של בעלי חיים12,13 סיפקו תובנות לגבי הפתולוגיה של AxD, אך הם אינם מצליחים ללכוד את ההקשר התאי המורכב של תפקוד האסטרוציטים14.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, פיתחנו מודל תאי המשתמש באסטרוציטים ראשוניים של חולדה שנגזרו מחולדות מסוג בר (WT) ומחולדות מודל AxD13. מערכת זו משמרת את הארכיטקטורה התאית המקורית ואת הפרופילים המולקולריים של האסטרוציטים, ובכך מאפשרת את חקר האגרגציה של GFAP, תגובות לעקה חמצונית ומודיפיקציות פתולוגיות הקשורות ל-AxD. עבור חוקרים שאין להם גישה לחולדות מודל AxD, טרנסדוקציה לেন্টি-ויראלית מציעה שיטה חלופית להחדרת מוטציות ב-GFAP הקשורות ל-AxD לאסטרוציטים שנגזרו מחולדות נורמליות10.

בהשוואה לקווי תאים ממורטלים, אסטרוציטים ראשוניים שומרים על ההטרוגניות והמורכבות של אוכלוסיות אסטרוציטים in vivo, ובכך מספקים פלטפורמה רלוונטית פיזיולוגית לחקירת מנגנונים ספציפיים לאסטרוציטים15. בניגוד למחקרים in vitro המשתמשים בחלבון רקומביננטי9, אסטרוציטים ראשוניים מבטאים באופן טבעי GFAP וסמנים אחרים ספציפיים לאסטרוציטים, מה שמאפשר לחקור וריאנטים הקשורים למחלות בתוך סביבה תאית טבעית10,16,17. יתרה מכך, אסטרוציטים ראשוניים מאפשרים חקירה של תגובות תפקודיות לגירויי עקה, כגון נזק חמצוני18 ודלקת19, אשר קשה לשחזר במערכות in vitro מפושטות.

במחקר של AxD, אסטרוציטים ראשוניים משלימים גישות ביוכימיות וגישות in vivo על ידי גישור על הפער בין מחקרים מולקולריים למחקרים סיסטמיים. בעוד שבדיקות ביוכימיות מתמקדות בתכונות המולקולריות של מוטציות ב-GFAP, הן חסרות מורכבות תאית, בעוד שדגמים in vivo לוכדים השפעות סיסטמיות אך פחות מתאימים למחקרים תאיים מכניסטיים. אסטרוציטים ראשוניים מספקים מערכת ביניים בעלת מורכבות תאית ובקרה ניסויית, בהלימה למגמות עכשוויות במחקר של מחלות ניוורו-דגנרטיביות המדגישות מודלים תאיים להבנת מנגנוני המחלה וזיהוי מטרות טיפוליות20.

כתב יד זה מציג את הפיתוח והיישום של אסטרוציטים ראשוניים של חולדה כמודל תאי למחקר של AxD. על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה בין אסטרוציטים מסוג WT לבין אסטרוציטים מסוג AxD, גישה זו נותנת מענה למגבלות מרכזיות של טכניקות חלופיות ומרחיבה את הנגישות באמצעות טרנסדוקציה לנטי-ויראלית. ממצאים אלו תורמים להבנה עמוקה יותר של תפקוד לקוי של אסטרוציטים ב-AxD ומספקים כלי בעל ערך לקידום תגליות טיפוליות במחלות ניוורו-דגנרטיביות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בבעלי החיים בפרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ובקרת בעלי חיים של המכללה למדעי החיים והרפואה באוניברסיטת National Tsing Hua (מספרי אישור NTHU IACUC 109088 ו-111060), ובוצע בהתאם להנחיות של ה-Agriculture Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. הכנת מצעים, לבישי זכוכית (coverslips), צלחות פטרי ולוחיות תרבית 

  1. לפני התחלת העבודה, ודאו כי התמיסות הבאות (טבלה 1) מוכנות לשימוש.
  2. סטריליזציה של מספריים ופינצטות תתבצע באמצעות אוטוקלאב לפני השימוש כדי להבטיח סטריליות.
  3. הכינו תמיסת poly-L-lysine (PLL) בריכוז של 0.02 mg/mL בבופר חומצה בורית.
  4. הוסיפו כמות מספקת של תמיסת PLL כדי לכסות באופן מלא את פני השטח של הזכוכית המכסה או את תחתית כלי/צלחת התרבית. ודאו כי הציפוי אחיד.
  5. השאירו את הזכוכית המכסה ואת הכלים המצופים ב-PLL להדגרה למשך לילה בטמפרטורת החדר בתוך מנדף זרימה למינרית.  
  6. למחרת, הסירו בזהירות את תמיסת ה-PLL. שטפו את הזכוכית המכסה או את הכלי/הצלחת המצופים שלוש פעמים במים סטריליים טריים כדי להסיר שאריות PLL.
    הערה: חשוב לשטוף ביסודיות את הבקבוק/הצלחת או את הזכוכית המכסה המצופים ב-PLL, כדי להסיר שאריות PLL שעלולות להשפיע לרעה על חיוניות התאים. 

2. הכנת תרבית ראשונית של אסטרוציטים

הערה: סקירה סכמטית מוצגת ב-איור 1.

  1. לאחר השראת היפותרמיה על ידי הנחת הגורים על קרח, בצעו דקפיטציה לגור חולדה ביום postnatal 1–3 והפרידו את הראש מהגוף.
  2. הניחו את הראש בצלחת של 60-mm וקבעו את הצדדים באמצעות פינצטה. בעזרת מספריים עדינים, בצעו דיסקציה עדינה של העור בחלקו העליון של הראש.
  3. בצעו חתך בvertex של הראש באמצעות מספריים עדינים כדי לפתוח בזהירות את הגולגולת. הפרידו בעדינות והסירו את שני חצאי הגולגולת.
  4. בעזרת פינצטה, תלשו את המוח מבסיסו והעבירו אותו לצלחת של 60-mm המכילה תמיסת דיסקציה.
  5. הניחו כל המיספירה כאשר הפני הפנימי (medial surface) פונה כלפי מעלה כדי לחשוף את מבני קו האמצע.
  6. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסירו בעדינות את רקמות המוח האמצעי וגזע המוח, והשאירו שלמות את ההמיספירות המכילות את הקורטקס וההיפוקמפוס.
  7. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לקלף בעדינות את הקרומים (meninges), רצוי כיחידה אחת. בדקו בזהירות אם נותרו קרומים חבויים בחריצים והסירו אותם לחלוטין.
  8. העבירו את רקמת המוח המדוקסקת למנדף זרימה למינרית (laminar flow hood). שאבו את תמיסת הדיסקציה באמצעות פיפטה של 1 mL והוסיפו תמיסת דיסקציה טרייה.
  9. קצצו את הרקמה דק בעזרת להב סקלפל סטרילי.
  10. העבירו את הרקמה הקצוצה ל-5 mL של תמיסת דיסוציאציה במבחנה של 15 mL. הדגירו את המבחנה באמבט מים של 37ºC למשך 15 min, תוך ניעור עדין של המבחנה בכל 5 min כדי להבטיח אינטראקציה נאותה בין האנזים לרקמה.
  11. לאחר ההדגרה, המתינו עד שהרקמה תשקע לתחתית המבחנה. שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והוסיפו 5 mL של תמיסת דיסקציה.
  12. הפכו את המבחנה 5 פעמים כדי לשטוף את הרקמה. הניחו למבחנה לעמוד במשך 3 min כדי לאפשר לרקמה לשקוע, ולאחר מכן חזרו על תהליך השטיפה שלוש פעמים תוך שימוש בתמיסת דיסקציה טרייה.
  13. לאחר השטיפה האחרונה, הסירו את הנוזל העליון והוסיפו 2.5 mL של תמיסת דיסקציה ו-2.5 mL של תמיסת תחזוקה.
  14. בצעו טריטורציה לרקמה על ידי העברת התמיסה מעלה ומטה 10–15 פעמים באמצעות פיפטה של 10-mL.
  15. הניחו למבחנה לעמוד במשך 3 min כדי לאפשר לרקמה לשקוע. העבירו את הנוזל העליון (המכיל את התאים) למבחנה קונית חדשה של 50 mL.
  16. הוסיפו 5 mL של תמיסת MEM למבחנה המקורית המכילה את הרקמה השקועה. בצעו טריטורציה נוספת של 10–15 פעמים עם פיפטה של 10-mL עד שרוב הגושים ייעלמו.
  17. העבירו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים סטרילית של 40 µm לתוך מבחנה קונית נקייה של 50 mL המכילה 5 mL של תמיסת תחזוקה.
  18. סבבו את תרחיף התאים המסונן בצנטריפוגה ב-200 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר.
  19. הסירו את הנוזל העליון, ולאחר מכן שחררו בעדינות את משקע התאים על ידי תיפוף על המבחנה. 
  20. הוסיפו 5 mL של תמיסת MEM וסבבו עם פיפטה מעלה ומטה 10 פעמים כדי לערבב מחדש את המשקע. שמרו את תרחיף התאים באמבט מים של 37ºC במהלך ספירת התאים.
  21. דללו 10 μL של תרחיף התאים עם 90 µL של תמיסת MEM. ערבבו היטב באמצעות טיפ של פיפטה של 200 µL.
  22. הוסיפו 20 μL של תרחיף תאים מדולל ל-20 µL של trypan blue. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
  23. זריעו את התאים בכלי תרבית באופן הבא: עבור פלטה של 24 בארות, זריעו 2 × 10⁵ תאים לבאר; עבור פלטה של 6 בארות, זריעו 5 × 10⁵ תאים לבאר; עבור צלחת של 6-cm, זריעו 1 × 10⁶ תאים לצלחת.
  24. הניחו את הפלטות או הצלחות באינקובטור לתרביות רקמה. הימנעו מהשארת התאים בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ממושכים.
  25. בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם נצמדו למצע 4 h לאחר הזריעה.
  26. במרחק של 24 h לאחר הזריעה, החליפו את תמיסת התרבית בתמיסת תחזוקה טרייה.
  27. הזינו את התרבית בכל 2–3 ימים על ידי החלפת מחצית מהתמיסה בתמיסת תחזוקה טרייה.
  28. לאחר 7 ימים, התאים אמורים להגיע לכ-80% קונפלואנסיות ויהיו מוכנים לניסויים.
    הערה: כדי להבטיח תנאים אופטימליים לתרביות אסטרוציטים, בצעו את כל השלבים בסביבה סטרילית, רצוי בתוך מנדף זרימה למינרית, כדי למנוע זיהומים. בנוסף, ודאו שכל הרכיבים חוממו מראש ל-37°C במידת הצורך. היו קפדניים בהסרת הקרומים, שכן כל שארית של רקמת קרומים עלולה להפריע לתרביות. יתרה מכך, הימנעו מהשארת תאים בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ממושכים במהלך הזריעה והספירה כדי לשמר את חיות התאים ושלמותם.

3. ייצור חלקיקים לנטיביריאליים והטרנסדוקציה 

הערה: סקירה סכימטית מוצגת ב-איור 2.

  1. זרע תאי HEK293T בצלחת פטרי של 10 cm2 המכילה מצע גידול טרי (טבלה 1).
  2. גדל את התאים למשך לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37ºC עד להגעה למסף (confluency) של 50%–60%.
  3. ל-1 mL של Opti-MEM, הוסף 20 µg של פלסמיד לנטיווירוס המקודד ל-GFAP או לווריאנטים שלו, 5.6 µg של וקטור אריזה (packaging vector), ו-1.8 µg של וקטור מעטפת (envelope vector). 
  4. הוסף 45 µL של ריאגנט טרנספקציה לתמיסה המכילה את ה-DNA.
  5. ערבב בעדינות והדגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  6. הוסף את תמיסת הטרנספקציה ישירות לתאי ה-HEK293T והדגר באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 4 שעות.
  7. שאב את תמיסת הטרנספקציה והחלפה במצע גידול טרי.  
  8. המשך בגידול התאים למשך יומיים.
  9. אסוף את העלייה (supernatant) של תרבית התאים והחלפה במצע גידול טרי.
  10. ביום למחרת, אסוף שוב את העלייה של תרבית התאים והחלפה במצע גידול טרי.
  11. ביום שאחריו, אסוף את העלייה הסופית של תרבית התאים.
  12. אחד את העליות משלבים 3.9–3.11 לתוך מבחנה קונית של 50-mL.
  13. סנן את העלייה המאוחדת דרך מסנן של 0.45 µm באמצעות מזרק של 60 mL להסרת פסולת תאית.  
  14. סבב בצנטריפוגה את העלייה המסוננת ב-1,400 × g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר להסרת תאים מתים.
  15. העבר את העלייה המנוקה למבחנות אולטרה-צנטריפוגה.
  16. סבב בצנטריפוגה ב-100,000 × g למשך 70 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לשקיע את חלקיקי הלנטיווירוס.
  17. הסר בזהירות את העלייה מבלי להפריע למשקע בתחתית המבחנה.
  18. השבה את המשקע ב-600 µL של מצע Opti-MEM על ידי פיפטור עדין מעלה ומטה.
  19. חלק את חלקיקי הלנטיווירוס המושבים לאליקוטות של 50 μL ואחסן אותן ב-80°C- עד למועד השימוש. 
  20. זרע אסטרוציטים ראשוניים בצלחת של 6 בארות ואפשר להם להגיע למסף של 50%–70% (סעיף 2).
  21. הפשר את הכמויות הדרושות של חלקיקי הלנטיווירוס על קרח.
  22. הוסף 50 µL של חלקיקי לנטיווירוס לכל בארה, בתוספת של 8 µg/mL Polybrene.
  23. סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של הוירוס וה-Polybrene. הדגר את התאים באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37ºC למשך 4–8 שעות.
  24. שאב בזהירות את המצע המכיל את הוירוס כדי להימנע מהפרעה לתאים.
  25. החלף את המצע במצע גידול טרי והמשך בגידול למשך 2–3 ימים.
  26. בצע אנליזות המשך על התאים שעברו טרנסדוקציה באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה להדמיית היווצרות רשת פילמנטים ביניים, או אימונובלוטינג להערכת ביטוי GFAP.
    הערה: בעת טיפול בחלקיקי לנטיווירוס, חובה להשתמש בציוד מיגון אישי (PPE) מתאים להבטחת הבטיחות. בנוסף, כדי לשמור על שלמות חלקיקי הוירוס, הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.

4. מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה 

  1. שאבו בעדינות את מצע התרבית מהבארים המכילות לכיסויות עם תאים שנזרעו. הימנעו מהפרעת התאים.
  2. קבעו את התאים על ידי הוספה של אחד ממסלולי הקיבוע הבאים: עבור אסטרוציטים ראשוניים, השתמשו ב-3.2% (wt/vol) paraformaldehyde; עבור תרבית של אסטרוציטים ונוירונים, השתמשו ב-3.2% (wt/vol) paraformaldehyde ו-4% (wt/vol) sucrose.
  3. דגרו את הלכיסויות במקבע למשך 15 min בטמפרטורת החדר. אלא אם צוין אחרת, בצעו את כל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר. 
  4. שטפו את התאים המקובעים שלוש פעמים עם phosphate-buffered saline (PBS) כדי להסיר את מקבע.
  5. בצעו פרמיאביליזציה לתאים על ידי דגירה ב-0.2% (vol/vol) Triton X-100 שהוכן בבופר חסימה (5% (vol/vol) normal goat serum ב-PBS) למשך 15 min. 
  6. שטפו את התאים שעברו פרמיאביליזציה שלוש פעמים עם PBS.
  7. הכינו את תמיסת הנוגדן הראשוני על ידי דילול הנוגדן בבופר חסימה בהתאם לריכוז המומלץ על ידי היצרן.
  8. דגרו את הלכיסויות בתמיסת הנוגדן הראשוני למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר.
  9. שטפו את הלכיסויות שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר נוגדן ראשוני שלא נקשר.
  10. הכינו את תמיסת הנוגדן המשני על ידי דילול נוגדנים משניים מסוג goat anti-mouse ו-goat anti-rabbit המשורשרים לפלואורופורים בבופר חסימה בדילול של 1:500.  
  11. דגרו את הלכיסויות בתמיסת הנוגדן המשני למשך 1 h בטמפרטורת החדר.
  12. שטפו את הלכיסויות שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר נוגדן משני שלא נקשר.
  13. העבירו בזהירות את הלכיסויות אל על גבי למסות זכוכית באמצעות פינצטה.
  14. הצמידו את הלכיסויות באמצעות תוך מקבע (mounting medium) כדי לשמר את הפלואורסצנציה.
  15. אטמו בעדינות את קצוות הלכיסות בעזרת לק שקוף למניעת תזוזה ואידוי.
  16. המתינו לייבוש מלא של הלק לפני המעבר לדימות.
  17. הלמסות המוכנות מוכנות לדימות באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי או קונפוקאלי.
    הערה: כדי להבטיח את הצלחת הניסויים, הכינו את כל הרכיבים, כגון PBS, בופר חסימה ונוגדנים, באופן טרי ושמרו על סטריליות. טפלו בלכיסויות בזהירות כדי למנוע פגיעה בתאים או שריטות של משטח הזכוכית. הגנו על הדגימות מאור במהלך דגירת הנוגדנים ולאחר ההצמדה כדי למנוע פוטובליצ'ינג של האותות הפלואורסצנטיים. בנוסף, בצעו אופטימיזציה לריכוזי הנוגדנים ולזמני הדגירה בהתאם למערך הניסויי הספציפי.

5. אימונובלוטינג (Immunoblotting)

  1. שטוף את האסטרוציטים פעמיים עם PBS כדי להסיר שאריות של מצע ופסולת תאית.
  2. הנח את הפלטה או את הצלחת על קרח כדי למזער פירוק חלבונים. עבוד עם באר אחת בכל פעם, ושאב את ה-PBS באופן מלא.
  3. הוסף באפר RIPA (radioimmunoprecipitation assay) קר מאוד המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז. עבור פלטה של 6 בארות, הוסף 250 µL לבאר; עבור צלחת של 6-cm, הוסף 500 µL לצלחת.
  4. השתמש במגרדת תאים כדי לגרד ביסודיות את כל האסטרוציטים אל תוך באפר ה-RIPA (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (wt/vol) NP-40, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5% (wt/vol) sodium deoxycholate, ו-0.1% (wt/vol) SDS, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF]).
  5. העבר את התאים המגורדים להומוגניזר Dounce בנפח של 1-mL המונח על קרח. ביצע הומוגניזציה לתאים על ידי טחינה עדינה בעזרת המכתש.
  6. דגור את ליזאטי התאים ההומוגניים על קרח למשך 10 min כדי להבטיח ליזיס מלא. שמור 20 µL מהליזאטים הכוללים כדי לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA (bicinchoninic acid).
  7. סבב את ליזאטי התאים בצנטריפוגה במהירות של 13,500 × g בטמפרטורה של 4ºC למשך 10 min כדי להשקיע חלבונים לא מסיסים.
  8. העבר בזהירות את supernatant לתוך מבחנה נקייה. שמור 20 µL מה-supernatant כדי לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA.
  9. רכז את ה-supernatant על ידי ביצוע שקיעה באמצעות methanol/chloroform.
  10. השהה מחדש את המשקע המתקבל ב-0.1 mL של באפר דגימות Laemmli (25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 1% (w/v) SDS, 12.5% (v/v) glycerol, 0.01% (w/v) bromophenol blue, 355 mM β-mercaptoethanol).
  11. השהה מחדש את המשקע בבאפר דגימות Laemmli ופזר אותו באמצעות סוניקציה. 
  12. בצע שלושה מחזורי סוניקציה בפולסים של 0.5-s בהספק של 10%. שמור את קצה הפרובה לכיוון תחתית המבחנה כדי למנוע הקצפה.
  13. בצע בדיקת חלבון BCA (bicinchoninic acid) הן על ה-supernatant של ה-RIPA והן על ליזאטי התאים הכוללים. 
  14. טען את דגימות החלבון על ג'ל SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) בריכוז של 12% או 15%. הרץ את הג'ל במתח קבוע של 200 V למשך 45 min.
  15. העבר את החלבונים מהג'ל לממברנת ניטרוסלולוז באמצעות מערכת העברה רטובה. פעל לפי הוראות היצרן והעבר במתח של 100 V למשך 70 min.
  16. הנח את הממברנה ב-5% (wt/vol) BSA (bovine serum albumin) המומס ב-TBST (Tris-buffered saline עם 0.1% (wt/vol) Tween-20). בצע חסימה למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר תוך써 ניעור עדין.
  17. דלל את הנוגדנים הראשוניים ב-TBST בהתאם להוראות היצרן. דגור את הממברנה בתמיסת הנוגדן הראשוני למשך לילה ב-4ºC תוך ניעור עדין.
  18. שטוף את הממברנה שלוש פעמים ב-TBST, כאשר כל שטיפה נמשכת 5 min.
  19. דלל נוגדנים משניים המצומדים לפלואורופור או ל-HRP (horseradish peroxidase) ב-TBST בדילול של 1:500 (או כפי שצוין על ידי היצרן).
  20. דגור את הממברנה בתמיסת הנוגדן המשני למשך 1 h בטמפרטורת החדר תוך ניעור עדין.
  21. שטוף את הממברנה שלוש פעמים ב-TBST, כאשר כל שטיפה נמשכת 5 min.
  22. פתח את הממברנה באמצעות פלואורסצנציה או chemiluminescence משופר (ECL) בהתאם להוראות היצרן.
  23. הדמ את פסי החלבון באמצעות מערכת דימוי.
    הערה: כדי למנוע פירוק חלבונים, בצע את כל השלבים על קרח או ב-4ºC, למעט שלבי הדגירה של הנוגדנים והחסימה. ודא שכל הבאפרים, הריאגנטים והציוד קוררו מראש לפני השימוש כדי לשמור על טמפרטורות נמוכות לאורך כל התהליך. הימנע מהעמסה יתרה של הג'ל כדי למנוע מריחה (smearing), ובצע אופטימיזציה לריכוזי הנוגדנים ולזמני הדגירה בהתאם לניסוי הספציפי.

6. הכנת נוירונים ראשוניים לתרבית משותפת

  1. בצע הריגה הומנית לחולדה ההרה באמצעות פחמן דו-חמצני כחומר הרדמה בשאיפה. הוצא את הרחם והנח אותו בצלחת פטרי סטרילית.
  2. הוצא את המוחות מהעוברים והנח אותם בצלחת של 6-cm המכילה תמיסת דיסקציה. ודא שהרקמה נשארת טבולה בתמיסה בכל עת כדי למנוע התייבשות.
  3. בצע דיסקציה לקורטקס (קליפת המוח) והסר את הקרומיות כפי שתואר (שלב 2.7).
  4. העבר את הרקמה המבודדת למנדף זרימה למינרית.
  5. שאב את תמיסת הדיסקציה באמצעות פ pipette של 1 mL והוסף תמיסת דיסקציה טרייה לצלחת.  
  6. קצץ את רקמת המוח לחתיכות קטנות באמצעות להב סקלפל סטרילי.
  7. העבר את הרקמה הקצוצה ל-5 mL של תווך דיסוציאציה נוירונלית (טבלה 1) שחומם מראש ל-37 ºC, בתוך מבחנה של 15 mL.
  8. דגור את המבחנה באמבט מים של 37 ºC למשך 30 min, תוך ניעור עדין של המבחנה כל 5 min כדי להבטיח אינטראקציה תקינה בין האנזים לרקמה. 
  9. הוצא את המבחנה מאמבט המים ואפשר לרקמה לשקוע לתחתית המבחנה. שאב בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות טיפ של פ pipette של 1 mL מבלי להפריע לרקמה.
  10. הוסף 5 mL של תמיסת דיסקציה שחוממה מראש למבחנה והפוך אותה 5 פעמים כדי לשטוף את הרקמה. השאר את המבחנה למשך 3 min כדי לאפשר לרקמה לשקוע, ולאחר מכן חזור על תהליך השטיפה שלוש פעמים, בכל פעם תוך שימוש בתמיסת דיסקציה טרייה.
  11. לאחר השטיפה האחרונה, הסר את הנוזל העליון והוסף 2.5 mL של תמיסת דיסקציה ו-2.5 mL של תווך זריעה (plating medium).
  12. בצע טריטורציה (Trituration) לרקמה על ידי שאיבה והזרקה של התמיסה למעלה ולמטה 10–15 פעמים באמצעות פ pipette של 10-mL.
  13. השאר את המבחנה למשך 3 min כדי לאפשר לרקמה לשקוע. העבר את הנוזל העליון (המכיל את התאים) למבחנה קונית חדשה של 50 mL.
  14. הוסף 5 mL של תווך זריעה למבחנה המקורית המכילה את הרקמה ששקעה. 
  15. בצע טריטורציה לרקמה שוב 10–15 פעמים באמצעות פ pipette של 10-mL עד שרוב הגושים ייעלמו.
  16. העבר את תרחיף התאים דרך מסננת תאים סטרילית של 40 µm לתוך מבחנה קונית נקייה של 50 mL המכילה 5 mL של תווך זריעה.
  17. בצע סנטריפוגציה לתרחיף התאים המסונן במהירות של 200 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר.
  18. הסר את הנוזל העליון, ולאחר מכן שחרר בעדינות את משקע התאים (cell pellet) על ידי נקישה על המבחנה. הוסף 5 mL של תווך זריעה שחומם מראש ובצע שאיבה והזרקה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב מחדש את המשקע.
  19. ספור את התאים כפי שתואר קודם לכן (שלבים 2.21 ו-2.22). שמור את תרחיף התאים באמבט מים של 37°C במהלך ספירת התאים.
  20. זרוע את הנוירונים ישירות מעל האסטרוציטים הראשוניים בכלי תרבית באופן הבא: עבור פלטה של 24 בארות, זרוע 1.45 × 105 תאים לבאר; עבור פלטה של 6 בארות, זרוע 5 × 105 תאים לבאר; עבור צלחת של 6-cm, זרוע 1 × 106 תאים לבאר.
  21. הנח את הפלטות או הצלחות באינקובטור לתרביות רקמה המכוון ל-37ºC עם 5% CO₂. הימנע מהשארת התאים בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ממושכים כדי לשמור על חיוניותם.
  22. החלף את תווך הזריעה בתווך תחזוקה נוירונלית 4 שעות לאחר הזריעה.
  23. החלף מחצית מהתווך בתווך תחזוקה נוירונלית טרי כל 3–4 ימים.
    הערה: הנוירונים בתרבית המשותפת (coculture) יהיו מוכנים לניסויים לאחר 7–10 ימים במבחנה (DIV).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סקירה מורפולוגית של תרביות ראשוניות של אסטרוציטים בנקודות זמן שונות לאחר הבידוד מוצגת ב-איור 3. בעקבות זריעת תרחיף התאים הקורטיקליים, חלק מהאסטרוציטים נצמדים לפני השטח של כלי התרבית בתוך 24 השעות הראשונות (איור 3A). במהלך 3 עד 5 הימים הראשונים, התרביות מכילות פסולת תאית ונוירונים גוועים (איור 3B), שכן מצע התרבית עבר אופטימיזציה לתמיכה בהישרדות ובצמיחה של אסטרוציטים. עד ליום ה-7 לאחר הזריעה, מתחילה להיווצר שכבה אחת (monolayer) של אסט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תרביות ראשוניות של אסטרוציטים קידמו באופן משמעותי את הבנתנו לגבי תפקידם של אסטרוציטים בבריאות ובמחלה. בהתבסס על עבודתם המכוננת של McCarthy ו-de Vellis21, תרביות אלו הן קריטיות לחקר AxD, שכן הן מאפשרות בחינה מפורטת של תהליכים ספציפיים לאסטרוציטים, ובמיוחד את השפעת מוטציות AxD על הרכבת GFAP ויצירת אגרגטים.

בידוד וטיפוח מוצלחים של אסטרוציטים ראשוניים תלויים בכמה שלבים מרכזיים המשפיעים על חיות התאים, טוהרם והשחזוריות של התוצאות. דיסקציה מהירה ומדויקת של רקמת המוח, בשילוב עם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים לד"ר Tracy Hagemann (מרכז Waisman, אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון) על אספקת חולדות ה-knock-in מסוג R237H. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (111-2320-B-007-008 ו-112-2320-B-007-006 עבור N.-H. L. ו-M.-D.P.). המחברים אסירי תודה על התמיכה של מרכז הדימות הקונפוקאלי באוניברסיטת National Tsing Hua בטייוואן, הנתמך על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (NSTC-114-2740-M-007-001). אנו מודים גם למרכז המכשירים באוניברסיטת National Tsing Hua על הגישה למיקרוסקופ האלקטרונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 M HEPES , pH 7.4 Gibco15630-080
100× penicillin-streptomycin  Gibco15140-122
10× Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14180-046
2.5% TrypsinGibco15090046
30% Acrylamide/Bis solution 37.5:1Biorad1610158
נוגדן anti-GFAPCell Signaling Technology12389
נוגדן anti-human GFAPBiolegend837202Clone SMI21
נוגדן anti-panGFAPAgilentGA524
נוגדן anti-ubiquitinMilliporeST 1200Clone FK2
נוגדן anti-vimentinSigma-AldrichV6389Clone V9
נוגדן anti-β III tubulinBiolegend801201
תוסף B27Gibco17504044
סידום כלורי (CaCl2)Arcos34961
ריאגנטים הקשורים לתרבית תאים
מערכת דימוי ChemiDocBioRadNA
צבע Coomassie blueUSB32826
ציסטאיןSigma-AldrichC1276
דיתיותריטול (DTT)URDTT
DNase I Sigma-AldrichD5025
הומוגניזטור DounceWheaton
תווך Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CM
ערכה להכנת DNA פלסמידי נקי מאנדוטוקסינים Qiagen12943
ריאגנט כימילומינצנציה משופר (ECL)PerkinElmerNEL 105001
חומצה אתילנדיאמין טטרה אצטית (EDTA)USB15699
סרום עגל עוברי  GibcoA5209401
גלוקוזSigma-AldrichG8270
GlutaMaxGibco35050-061
תווך מינימלי חיוני (MEM)Corning10-010-CVR
NaClHoneywell31434S
תווך NeurobasalGibco21103049
אולטרסנטריפוגה Optima XE-90BeckmanNA
פאפאיןWorthingtonLS003126
פנילמתילסולפוניל פלוריד (PMSF)ACROS ORGANICS215740050
פוליאתילן-אימיןSigma-AldrichP3143
Poly-L-lysineSigma-AldrichP6516
אשלגן כלורי (KCl)Honeywell12636
נוגדן Rhodamine anti-actinBioRad12004164
סודיום דודציל סולפט (SDS)USB75819
סודיום פירובטGibco11360070
StarBright Blue 520 goat anti-mouse IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 goat anti-rabbit IgG BioRad12004161
סוכרוזSigma-AldrichS5391
רוטור SW-28BeckmanNA
ריאגנט טרנספקציה TansIT-LT1MirusMR-MIR-2300
TEMEDUSB76320
Tris(hydroxymrthyl)aminomethane (Tris)USB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
β-מרקפטואתנולSigma-AldrichM3148

מקורות

  1. Verkhratsky A, Nedergaard M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 2018;98(1):239-389.
  2. Eroglu C, Barres BA. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 2010;468(7321):223-31.
  3. Sofroniew MV. Astrogliosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014;7(2):a020420.
  4. Sofroniew MV, Vinters HV. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 2010;119(1):7-35.
  5. Brandebura AN, Paumier A, Onur TS, Allen NJ. Astrocyte contribution to dysfunction, risk and progression in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci. 2023;24(1):23-39.
  6. Sofroniew MV. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 2009;32(12):638-47.
  7. Hol EM, Pekny M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 2015;32:121-30.
  8. Brenner M, et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 2001;27(1):117-20.
  9. Lin NH, Jian WS, Perng MD. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 2025;26(5):1913.
  10. Yang AW, et al. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 2022;33(8):ar69.
  11. Lin NH, Perng MD. Experimental approaches for biochemical analysis of glial fibrillary acidic protein and its disease-associated variants. J Vis Exp. 2025;(225).
  12. Hagemann TL, Connor JX, Messing A. Alexander disease-associated glial fibrillary acidic protein mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 2006;26(43):11162-73.
  13. Hagemann TL, et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 2021;13(620):eabg4711.
  14. Hagemann TL. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 2022;72:140-7.
  15. Lange SC, et al. Primary cultures of astrocytes: their value in understanding astrocytes in health and disease. Neurochem Res. 2012;37(11):2569-88.
  16. Lin NH, Yang AW, Chang CH, Perng MD. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 2021;35(5):e21614.
  17. Lin NH, Jian WS, Snider N, Perng MD. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 2024;300(7):107402.
  18. Goya-Iglesias N, et al. Alexander disease mutations differentially sensitize glial fibrillary acidic protein (GFAP) to posttranslational modifications and network disruption by oxidants. Redox Biol. 2026;92:104103.
  19. Olabarria M, Putilina M, Riemer EC, Goldman JE. Astrocyte pathology in Alexander disease causes a marked inflammatory environment. Acta Neuropathol. 2015;130(4):469-86.
  20. Lee HG, Wheeler MA, Quintana FJ. Function and therapeutic value of astrocytes in neurological diseases. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(5):339-58.
  21. McCarthy KD, de Vellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 1980;85(3):890-902.
  22. Olsen ML, et al. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 2006;53(5):516-28.
  23. Strack A, et al. Chemokines are differentially expressed by astrocytes, microglia and inflammatory leukocytes in Toxoplasma encephalitis and critically regulated by interferon-gamma. Acta Neuropathol. 2002;103(5):458-68.
  24. East E, Golding JP, Phillips JB. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. J Tissue Eng Regen Med. 2009;3(8):634-46.
  25. Zhang Y, Barres BA. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 2010;20(5):588-94.
  26. Oberheim NA, Goldman SA, Nedergaard M. Heterogeneity of astrocytic form and function. Methods Mol Biol. 2012;814:23-45.
  27. Vasile F, Dossi E, Rouach N. Human astrocytes: structure and functions in the healthy brain. Brain Struct Funct. 2017;222(5):2017-29.
  28. Oberheim NA, et al. Uniquely hominid features of adult human astrocytes. J Neurosci. 2009;29(10):3276-87.
  29. Peterson IL, et al. Isolation and monoculture of functional primary astrocytes from the adult mouse spinal cord. Front Neurosci. 2024;18:1367473.
  30. Agalave NM, et al. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 2020;340:108742.
  31. Du F, et al. Purity, cell viability, expression of GFAP and bystin in astrocytes cultured by different procedures. J Cell Biochem. 2010;109(1):30-7.
  32. Lin NH, et al. The role of gigaxonin in the degradation of the glial-specific intermediate filament protein GFAP. Mol Biol Cell. 2016;27(25):3980-90.
  33. Lin NH, Perng MD. Synergistic effects of glial fibrillary acidic protein mutation and overexpression in the pathogenesis of Alexander disease. Int J Mol Sci. 2026;27(10).
  34. Perng M, et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 2006;79(2):197-213.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מוטציות ב-GFAPתפקוד לקוי של אסטרוציטיםעקה חמצוניתסיבי רוזנתלטרנסדוקציה לנטיביריליתתרבית אסטרוציטיםמחלה נוירודגנרטיבית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.