מאמר מחקר

ניתוחים אינטגרטיביים של טרנסקריפטומיקה במסה, ברמה התאית ובמיקום מרחבי מציעים את PPARG כגן פרוגנוסטי מועמד הקשור להזדקנות תאית באוסטאוסרקומה

0 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73062

⸱

25 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine Department, Liuzhou People's Hospital, 2Spinal Surgery Department, Liuzhou People's Hospital, 3Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

באמצעות ניתוחים טרנסקריפטומיים של דגימות כוללות (bulk), של תאים בודדים ומרחביים, יחד עם מידול הישרדות מבוסס למידה חישובית ותיקוף ניסויי, מחקר זה מציע את PPARG כגן פרוגנוסטי פוטנציאלי הקשור להזדקנות תאים באוסטאוסרקומה, ומקשר בין ביטויו המופחת לבין הישרדות ירודה ב-TARGET-OS ומאפיינים כליים ומיקרו-סביבתיים.

תקציר

אוסטאוסרקוממה נותרת מאתגרת במקרים של מחלה גרורתית, חוזרת או עמידה לטיפול. מחקר זה נועד לזהות גנים פרוגנוסטיים הקשורים להזדקנות תאית (senescence) ולאפיין את ההקשרים המרחביים שלהם. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי מזווג בוצע ב-GSE99671 באמצעות DESeq2, ולאחריו ביצוע חיתוך עם קבוצת גני ההזדקנות CellAge. נתונים טרנסקריפטומיים מקוהורט TARGET-OS הושגו מ-UCSC Xena. גנים מועמדים הוערכו באמצעות רגרסיית Cox חד-משתנית, ניתוח Kaplan-Meier, ניתוח receiver operating characteristic תלוי-זמן, רגרסיית LASSO Cox, ניתוח LASSO חוזר ומודל random survival forest, כאשר משתנים קליניים נלווים שולבו במודלי Cox מתוקננים. לצורך האפיון נעשה שימוש בהעשרה פונקציונלית, ניתוח מיקרו-סביבה חיסונית, טרנסקריפטומיקה של תא בודד, טרנסקריפטומיקה מרחבית של SP_BS3, תיקוף ביטוי ב-GSE36001, ותיקוף באמצעות qRT-PCR ו-Western blot בתאי אוסטאוסרקוממה 143B ובתאי אוסטאובלסטים. ב-GSE99671, נמצאו 2,248 גנים עם ביטוי דיפרנציאלי ב-adjusted P < 0.05, והחיתוך שלהם עם 866 גני CellAge הניב 105 גנים עם ביטוי דיפרנציאלי הקשורים להזדקנות. ב-TARGET-OS, ביטוי נמוך של PPARG היה קשור לסיכון גבוה יותר לתמותה (univariate HR = 0.603, 95% CI = 0.454–0.802, P = 0.000494; adjusted HR = 0.224, 95% CI = 0.085–0.589, P = 0.00241). הוספת PPARG למודל הקליני העלתה את ה-C-index מ-0.707 ל-0.829. PPARG היה בעל ביטוי מופחת (downregulated) הן ב-GSE99671 והן ב-GSE36001, ו-qRT-PCR ו-Western blotting אישרו ביטוי נמוך יותר של mRNA וחלבון PPARG בתאי אוסטאוסרקוממה 143B בהשוואה לתאי אוסטאובלסטים. ניתוח תאים בודדים מיקם את PPARG בתאים אנדותלליים, פריציטים, מקרופאגים/מונוציטים ותאים סטרומליים הקשורים לגידול. ניתוח טרנסקריפטומי מרחבי הראה מתאמים חיוביים חלשים אך מובהקים בין ביטוי PPARG לבין מדדי הזדקנות של CellAge ומדדים הקשורים לאנדותל ולפריציטים. ממצאים אלו מציעים את PPARG כסמן פרוגנוסטי מועמד המופק מ-CellAge, הקשור להישרדות שאינה נוחלה למאפייני מיקרו-סביבה וסקולרית באוסטאוסרקוממה, ותומכים בבחינת הרלוונטיות הפוטנציאלית שלו לסיווג סיכונים ולמיקרו-סביבה של הגידול הקשורה להזדקנות תאית. GSE36001 סיפק תיקוף ביטוי חיצוני בלבד; לא בוצע תיקוף הישרדות עצמאי.

מבוא

אוסטאוסרקוממה היא הגידול הזлоגיני הראשוני השכיח ביותר בעצמות בקרב ילדים, מתבגרים ומבוגרים צעירים1. למרות שטיפול כימותרפי רב-תרופתי בשילוב עם ניתוח שיפר את התוצאות במחלה מוקדית2,3, חולים עם אוסטאוסרקוממה גרורתית, חוזרת או עמידה לטיפול ממשיכים לסבול משיעורי הישרדות נמוכים לטווח ארוך3,4. ראיות חדשות מצביעות על כך שעיצוב מחדש אפיגנטי המושרה על ידי עקה חמצונית יכול להקל על הסתגלות גרורתית ועל התקדמות הגידול, מה שמדגיש את הפלסטיות המולקולרית המורכבת העומדת בבסיס פנוטיפים אגרסיביים של סרטן5. מספרם של ביומארקרים חזקים שהם גם ניתנים לפירוש קליני וגם מספקים מידע ביולוגי נותר מוגבל. לפיכך, זיהוי מאפיינים מולקולריים הלוכדים את ההטרוגניות של האוסטאוסרקוממה ואת הסיכון הפרוגנוסטי על פני שכבות נתונים מרובות נותר חשוב.

הזדקנות תאית (Cellular senescence) היא תוכנית של עצירה יציבה של מחזור התא, המושרה על ידי תפקוד לקוי של הטלומרים, נזק ל-DNA, עקה חמצונית, הפעלת אונקוגנים ולחץ טיפולי6. הזדקנות עשויה להגביל שגשוג חריג; עם זאת, תאים מזדקנים יכולים גם לעצב מחדש את הסביבה המיקרוסקופית של הגידול באמצעות תוכניות של דלקת, כימוקינים, גורמי גדילה ושחזור של המטריצה החוץ-תאית7,8. באוסטאוסרקוממה, גנים הקשורים להזדקנות עשויים לשקף הן מצבים של עקה פנימית לתאי הגידול והן רכיבים לא-ממאירים בסביבה המיקרוסקופית, אך הרלוונטיות הפרוגנוסטית שלהם והארגון המרחבי שלהם לא הוערכו באופן שיטתי.

הגן PPARG מקודד עבור peroxisome proliferator-activated receptor gamma, רספטור גרעיני המופעל על ידי ליגנד ומעורב במטבוליזם של ליפידים, בבקרת דלקת, בדיפרנציאציה תאית ובמודולציה חיסונית9. תפקידו של PPARG בסרטן תלוי בהקשר10. במצבים מסוימים, PPARG קשור למצבי דיפרנציאציה ואנטי-דלקת, בעוד שבמצבים אחרים הוא עשוי לתמוך בתוכניות סרטניות או סטרומליות אדפטיביות. עם זאת, דפוס הביטוי שלו, ערכו הפרוגנוסטי והמיקום התאי והמרחבי שלו באוסטאוסרקומה טרם אופיינו באופן מלא.

במחקר הנוכחי, זוהו גנים בעלי ביטוי Differentially Expressed ב-GSE99671 והם הובאו לחפיפה עם סט הגנים של השחקה CellAge, מה שהניב 105 גנים בעלי ביטוי Differentially Expressed הקשורים לשחקה. לאחר מכן, נעשה שימוש בנתוני הישרדות של TARGET-OS, בגישות מרובות של למידת מכונה ומודלים של הישרדות, ובתיקון קליני כדי להגדיר את PPARG כגן הליבה. PPARG אופיין בהמשך באמצעות ניתוחים פונקציונליים וניתוחים של המיקרו-סביבה החיסונית ב-bulk, טרנסקריפטומיקה של תא בודד, טרנסקריפטומיקה מרחבית, תיקוף ביטוי חיצוני מ-GSE36001, וכן תיקוף באמצעות qRT-PCR ו-Western blot בקו תאי האוסטאוסרקומה 143B ובתאי אוסטאובלסטים אנושיים.

פרוטוקול

מחקר זה השתמש במאגרי נתונים ציבוריים ובקווי תאים לצורך ניתוח ותיקוף ולא כלל משתתפים אנושיים או דגימות רקמה קליניות; לפיכך, לא נדרש אישור ועדת אתיקה.

ניתוח ביטוי דיפרנציאלי ב-GSE99671 ובחיתוך עם CellAge
נתוני ספירה גולמיים ומידע על קיבוץ דגימות עבור GSE99671 התקבלו מ-GEO11,12. נותחו שמונה עשרה זוגות של דגימות אוסטאוסרקומה ודגימות נורמליות תואמות. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי מזווג בוצע באמצעות DESeq2 עם נוסחת העיצוב ~ pair_id + condition, כאשר pair_id ייצג את השפעות הפרטים המזווגים ו-condition השווה בין רקמת גידול לרקמה נורמלית13. גנים עם ספירת קריאות של לפחות 10 בלפחות שלוש דגימות נשמרו. ביטוי דיפרנציאלי הוגדר כ- P מתוקנן < 0.05, וסף מחמיר יותר של P מתוקנן < 0.05 ו- |log2FC| ≥ 1 הוחל לצורך ויזואליזציה. גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי הועברו לחיתוך עם 866 גני ההזדקנות של CellAge לאחר שסמלי הגנים הומרו לאותיות רישיות14. ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי בוצע ב-R (גרסה 4.3.2) באמצעות DESeq2 (גרסה 1.40.2), וערכי P מתוקננים חושבו באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg.

קוהורט TARGET-OS ומודל פרוגנוסטי
נתונים טרנסקריפטומיים וקליניים של TARGET-OS התקבלו מ-UCSC Xena15. ערכי ביטוי עבור 105 הגנים שהובעו באופן דיפרנציאלי הקשורים לסנסינציה (הזדקנות תאית) הופקו. נכללו שמונים וחמישה חולים עם נתונים מלאים של זמן הישרדות, סטטוס הישרדות וביטוי של הגנים המועמדים, עם 27 מקרי מוות. ערכי ביטוי גנים סטנדרטיים נותחו באמצעות רגרסיית Cox חד-משתנית16, ניתוח הישרדות Kaplan-Meier וניתוח מאפייני תפעול מקלט (ROC) תלוי-זמן17. רגרסיית LASSO Cox18, ניתוח יציבות LASSO חוזר ומודל יער הישרדות אקראי (random survival forest) שימשו להערכת יציבות הבחירה וחשיבות המשתנים19. ציון ה-hub המשולב והדירוג הקליני-משולב חושבו באמצעות הקריטריונים הבינאריים המפורשים המפורטים להלן. ניתוחי הישרדות בוצעו ב-R באמצעות החבילות survival (גרסה 3.5-7), timeROC (גרסה 0.4), glmnet (גרסה 4.1-8) ו-randomForestSRC (גרסה 3.2.2). עבור סינון Cox חד-משתני של 105 הגנים המועמדים, הוחל תיקון שיעור גילוי שגוי (FDR) של Benjamini-Hochberg, וגנים עם FDR < 0.05 נחשבו למשמעותיים סטטיסטית.

עיבוד מקדים של המודל, חלוקה לקבוצות PPARG וניתוח ROC תלוי-זמן
מתוך 85 חולים עם 27 מקרי מוות, גנים עם שונות אפס הוצאו, ערכי ביטוי חסרים של גנים מועמדים הושלמו באמצעות חציונה (median-imputed), וכל גן מועמד עבר סטנדרטיזציה של z-score. לצורך ניתוח Kaplan-Meier, הביטוי חולק לשתי קבוצות על בסיס החציונה של העמותה: ערכים הגבוהים מהחציונה הוקצו לקבוצת הביטוי הגבוה, וערכים השווים לחציונה או נמוכים ממנו הוקצו לקבוצת הביטוי הנמוך (PPARG: n = 42 גבוה ו-n = 43 נמוך). מבחני Log-rank היו דו-זנביים. ניתוחי ROC תלויי-זמן בוצעו באמצעות timeROC עם event cause = 1, שקלול marginal inverse-probability-of-censoring, זמני הערכה של 365, 1,095 ו-1,825 ימים, ו-iid = FALSE. כדי להבטיח שערכי סמן גבוהים יותר יעידו באופן עקבי על סיכון גבוה יותר, נעשה שימוש בערכי ביטוי סטנדרטיים עבור גנים עם מקדמי Cox חיוביים, ועבור גנים מגינים עם מקדמים שליליים הערכים הוכפילו ב-1-.

LASSO ו-LASSO חוזר
מודל Cox LASSO הותאם באמצעות glmnet עם family = "cox", alpha = 1, סטנדרטיזציה מוקדמת של z-score (ולכן standardize = FALSE), תיקוף צולב של חמישה קיפולים (five-fold cross-validation), type.measure = "deviance" וגרעין אקראי (random seed) 123. עבור פתרון המקדם הראשוני נעשה שימוש ב-lambda.min. ניתוח יציבות חזר על אותו תיקוף צולב של חמישה קיפולים 300 פעמים; חזרה b השתמשה בגרעין 1000 + b (b = 1,...,300). עבור כל גן, תדירות הבחירה הייתה פרופורציית החזרות עם מקדם שאינו אפס ב-lambda.min; נרשמה גם בחירה שאינה אפס ב-lambda.1se.

יער הישרדות אקראי (Random survival forest)
יער הישרדות הותאם לכל 105 הגנים המועמדים הסטנדרטיים באמצעות randomForestSRC (גרסה 3.2.2), תוך שימוש ב-seed 123, ntree = 1,000, importance = TRUE, ו-na.action = "na.impute". ברירות המחדל של החבילה נשמרו עבור נתוני הישרדות: פיצול log-rank, mtry = 11 (התקרה של השורש הריבועי של 105 המנבאים), גודל צומת קצה מינימלי = 15, nsplit = 10 נקודות פיצול אקראיות, דגימה ללא החזרה עם שבר דגימה של 0.632, וחשיבות משתנה מסוג anti-split.

ציון מרכז משולב (Integrated hub score)
כל אחד מ-105 הגנים המועמדים שהביטוי שלהם השתנה וקשורים ל-CellAge קיבל נקודה אחת עבור כל אחד משישה קריטריונים בינאריים: (1) חברות בחיתוך של ביטוי דיפרנציאלי/CellAge (כל המועמדים קיבלו נקודה זו כיוון שנדרש P מתוקנן < 0.05 לפני הניקוד); (2) ערך P נומינלי < 0.05 במודל Cox חד-משתני; (3) ערך P < 0.05 במבחן log-rank של Kaplan-Meier; (4) AUC תלוי-זמן ממוצע ל-3 ו-5 שנים ≥ 0.65; (5) תדירות בחירה של repeated-LASSO ב-lambda.min באחוזון ה-70 ומעלה בקרב המועמדים ו-> 0; ו-(6) חשיבות ב-random-survival-forest באחוזון ה-70 ומעלה בקרב המועמדים ו-> 0. לכל הקריטריונים היה משקל יחידה שווה, מה שהניב ציון מרכז שבין 0 ל-6; גנים שקיבלו ציון ≥ 4 המשיכו לשלב התאמה קלינית (18 גנים). דווחו גם ערכי FDR של Cox חד-משתני, וערך FDR < 0.05 שימש לסימון מובהקות בבדיקות מרובות, אך מדד הניקוד שהוגדר מראש השתמש ב-P נומינלי < 0.05.

דירוג משולב קליני
לאחר מיזוג רשומות הביטוי והנתונים הקליניים, הניתוחים המתוקננים כללו 40 חולים עם רשומות משתנים מלאות ו-13 מקרי מוות. הניקוד הסופי היה ניקוד ה-hub הראשוני בתוספת נקודה אחת עבור כל אחד משבעה קריטריונים: Adjusted Cox P < 0.05, Adjusted Cox P < 0.10, Sensitivity Cox P < 0.05 לאחר הסרת ניתוח מכריע, Sensitivity Cox P < 0.10, ממוצע AUC ל-3 ו-5 שנים ≥ 0.65, Likelihood-ratio-test P < 0.10 עבור המודל המשולב (קליני פלוס גן) לעומת המודל הקליני בלבד, ו-delta AIC < 0. מכיוון שספי השלבים 0.05 ו-0.10 היו מקננים, ערך P < 0.05 תרם שתי נקודות, ובכך נתן משקל רב יותר לראיות Adjusted ו-Sensitivity Cox משמעותיות בבירור. הטווח הכולל היה בין 0 ל-13; תיקו נפתרו על ידי ערך Adjusted Cox P נמוך יותר, ולאחר מכן על ידי ממוצע AUC ל-3/5 שנים גבוה יותר. PPARG קיבל את כל שש הנקודות הראשוניות ואת כל שבע נקודות השילוב הקליני (13/13), ודורג במקום הראשון. השיפור ב-C-index דווח באופן תיאורי ולא הוקצה לו ניקוד.

התאמה קלינית
גנים מרכזיים (hub genes) מועמדים שולבו עם משתנים קליניים מ-TARGET-OS, כולל מין, גיל, מצב המחלה בעת האבחנה, מיקום הגידול הראשוני, אזור גידול ספציפי וניתוח מכריע. ארבעים מטופלים עם רישומים קליניים ונתוני ביטוי מלאים, כולל 13 מקרי מוות, נכללו בניתוחים עם ההתאמה הקלינית. מודלי Cox הכוללים משתנים קליניים בלבד הושוו למודלים הכוללים משתנים קליניים בתוספת ביטוי גנים. ערכי C-index, קריטריון האינפורמציה של אקאיקה (AIC) וערכי P של מבחן יחס נסיון (likelihood ratio test) שימשו להערכת השיפור במודל. ניתוח רגישות בוצע לאחר הסרת משתנה הניתוח.

העשרה פונקציונלית וניתוח של המיקרו-סביבה החיסונית
דגימות TARGET-OS סווגו לפי רמת הביטוי של PPARG. ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות ה-PPARG-high וה-PPARG-low שימש ליצירת רשימות גנים מדורגות לצורך ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA)20. המסלולים שהוצגו היו Nemeth Inflammatory Response LPS Up, Burton Adipogenesis 5, Burton Adipogenesis 6, Krieg KDM3A Targets Not Hypoxia, Reactome: Transcriptional Regulation By TP53, Fulcher Inflammatory Response Lectin Vs LPS Dn, Hollmann Apoptosis Via CD40 Dn, Zhou Inflammatory Response Live Dn, WP: Fatty Acids And Lipoproteins Transport In Hepatocytes, Sweet Lung Cancer KRAS Up, KEGG Medicus Pathogen HIV Tat To TLR2/4 NF-kB Signaling Pathway ו-Reactome: Fatty Acids. חושב ציון senescence כללי של CellAge, וניתוח מתאם של Spearman שימש להערכת הקשרים בין PPARG לבין גני senescence או חתימות של המיקרו-סביבה החיסונית21. הבדלים בציוני המיקרו-סביבה בין קבוצות ה-PPARG-high וה-PPARG-low הוערכו באמצעות מבחנים לא-פרמטריים עם תיקון לבדיקות מרובות.

ניתוח טרנסקריפטומי של תא בודד
מאגר נתונים טרנסקריפטומי של תאים בודדים מגידול אוסטאוסרקומת אדם שפורסם נותח באמצעות אובייקט שעבר עיבוד מוקדם, עבורו כבר בוצעו בקרת איכות, הפחתת ממדיים, מקבץ (clustering) ואנוטציה ידנית22,23,24. סך הכל נכללו 68,336 תאים ו-32,297 גנים. לצורך פרשנות הטקסט המרכזי, האנוטציות פושטו ל-13 סוגי תאים עיקריים: תאי B, CAFs, תאים במחזור תא, תאים אנדותליאליים, תאים אריתרואידיים, מקרופאגים/מונוציטים, תאי אוסטאוסרקומת ממאירים, תאים מיוגניים, נויטרופילים, תאים דמויי אוסטאוקלסטים, פריציטים, תאי T/NK ותאי סטרומה הקשורים לגידול. להדמיית המיקום של PPARG נעשה שימוש בהפחתת ממדיים, ביטוי מאפיינים ובגרפי נקודות וכינור (violin plots). תאים חיוביים ל-PPARG הוגדרו כתאים עם ביטוי הגבוה מאפס. הבדלים בין סוגי תאים הוערכו באמצעות מבחני Kruskal-Wallis ו-Wilcoxon rank-sum עם תיקון Benjamini-Hochberg. ניתוחי תאים בודדים בוצעו ב-R באמצעות Seurat (גרסה 5.0.1).

ניתוח טרנסקריפטומיקה מרחבית
דגימת הטרנסקריפטומיקה המרחבית SP_BS3 שימשה לבניית אובייקט ביטוי מרחבי25,26. ספי סף לבקרת איכות היו nFeature_Spatial ≥ 200 ואחוז mt. ≤ 30, מה שהותיר 4,572 נקודות (spots) לניתוח. הנתונים נורמלו, נבחרו 3,000 גנים בעלי שונות גבוהה, ובוצעו סקיילינג של הנתונים, ניתוח רכיבים ראשיים (PCA), בניית גרף שכנות, אשכול (clustering) של נקודות מרחביות והפחתת ממדיות. ציון CellAge מרחבי להזדקנות חושבה לאחר הסרת PPARG מקבוצת הגנים כדי למנוע קורלציה מעגלית. חתימות של תאי אנדותל, פריציטים, מקרופאגים/מונוציטים, סטורמה הקשורה לגידול, אוסטאוסרקומה ממאירה וחתימות דמויות אוסטאוקלסט נבנו ודורגו. ניתוח קורלציית Spearman שימש להערכת הקשרים בין ביטוי PPARG לציונים המרחביים. העברת תוויות בוצעה תוך שימוש במערך הנתונים של תא בודד כייחוס ובמערך הנתונים המרחבי כשאילתה, כדי להסיק ציוני סוגי תאים חזויים עבור כל נקודה23,24. ניתוחים של טרנסקריפטומיקה מרחבית בוצעו ב-R באמצעות Seurat (גרסה 5.0.1), ותיקון FDR של Benjamini-Hochberg הוחל על כל ערכי ה- P של הקורלציות המרחביות.

תיקוף ביטוי חיצוני ב-GSE36001
סט הנתונים GSE36001 מ-GEO שימש אך ורק כקוהורט בלתי תלוי לתיקוף ביטוי; מכיוון שתוצאות הישרדות לא היו זמינות, הוא לא שימש לתיקוף פרוגנוסטי11,27. סט הנתונים כלל 19 דגימות של אוסטאוסרקומה ושש דגימות ביקורת נורמליות. נעשה שימוש באנוטציה של פלטפורמת GPL6102 כדי להמיר מזהי גששים (probes) לסמלי גנים. כאשר מספר גששים מופו לאותו גן, נשמר הגשש בעל ממוצע הביטוי הגבוה ביותר. ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות הגידול והביקורת הוערך באמצעות limma28. הניתוחים בוצעו ב-R באמצעות limma (גרסה 3.56.2), וערכי P מתוקננים חושבו באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg.

תיקוף באמצעות qRT-PCR ו-Western blot
תיקוף ניסויי בוצע באמצעות שורת תאי anosteosarcoma אנושית 143B ותאי osteoblast אנושיים. תאי osteosarcoma גודלו במצע Dulbecco's modified Eagle's המועשר ב-10% fetal bovine serum ו-1% penicillin-streptomycin בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂, והועברו (passaged) באמצעות 0.25% trypsin-EDTA בהגעה ל-80%–90% confluence. תאי osteoblast אנושיים הוחזקו תחת תנאי תרבית מומלצים. כל שורות התאים אושרו כנקיות מזיהום mycoplasma. עבור qRT-PCR, RNA כולל הוצא באמצעות ריאגנט להוצאת RNA המבוסס על phenol-guanidinium, וריכוז וטוהר ה-RNA הוערכו באופן ספקטרופוטומטרי. מיקרוגרם אחד של RNA כולל הועבר לתבנית DNA (reverse-transcribed) באמצעות ריאגנט לביצוע reverse-transcription בהתאם לפרוטוקול המומלץ. qRT-PCR בוצע באמצעות כימיה המבוססת על צבע פלואורסצנטי נקשר ל-DNA תחת תנאי מחזורים הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 °C למשך 30 s, ולאחריה 40 מחזורים ב-95 °C למשך 5 s ו-60 °C למשך 30 s, עם ניתוח melt-curve לאישור ספציפיות ההגברה. כל תגובה בוצעה בשלוש חזרות טכניות, ונערכו שלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים. GAPDH שימש כביקורת פנימית, וביטוי PPARG יחסי חושב באמצעות שיטת 2-ΔΔCt29. הפרימר הפורוורד (forward primer) של PPARG היה 5'-CGAAGACATTCCATTCACAAGAACAG-3', והפרימר הריברס (reverse primer) היה 5'-AGATGCAGGCTCCACTTTGATTG-3'.

ביצעו Western blotting כדי לבחון את ביטוי החלבון PPARG. תאים לויסו בבפר RIPA (radioimmunoprecipitation assay) בתוספת מעכבי פרוטאז, וריכוזי החלבון נקבעו באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA). כמויות שוות של חלבון (30 µg לכל נתיב) הופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד וסודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE) בריכוז 10% והועברו לממברנות PVDF (polyvinylidene difluoride). לאחר חסימה עם 5% חלב דל שומן למשך 1 h בטמפרטורת החדר, דגרו את הממברנות למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד PPARG (1:1,000) ו-GAPDH (1:5,000), ולאחר מכן דגרו עם נוגדן משני המצומד ל-HRP (horseradish peroxidase) (1:5,000) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. פסי החלבון הודגמו באמצעות גילוי כימילומנצנציה, ובוצעו שלושה ניסויים עצמאיים. עוצמת הפסים כוונטה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות30. הבדלים בין קבוצות נותחו באמצעות מבחני Student's t דו-זנביים למדגמים בלתי תלויים. הנתונים הוצגו כממוצע ± סטיית תקן (SD) משלושה ניסויים עצמאיים, וערך P < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. ניתוחים סטטיסטיים של נתוני הניסויים בוצעו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי (גרסה 9.0).

ניתוח סטטיסטי
אלא אם צוין אחרת, כל הניתוחים הביואינפורמטיים בוצעו ב-R (גרסה 4.3.2). ערכי P דו-זנביים < 0.05 נחשבו למשמעותיים סטטיסטית. מתאמים הוערכו באמצעות מקדם המתאם של Spearman (ρ). תיקון לבדיקות מרובות בוצע באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg FDR במידת הצורך. נתונים ניסיוניים הוצגו כממוצע ± SD והושוו באמצעות מבחני Student's t לא מזווגים דו-זנביים. ניתוחים סטטיסטיים ניסיוניים בוצעו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי (גרסה 9.0).

תוצאות

GSE99671 זיהה 105 גנים המבטאים ביטוי Differentially Expressed הקשורים להזדקנות תאית (CellAge)
GSE99671 כלל 36 דגימות מ-18 רקמות זוגיות. לאחר סינון של ערכי ספירה נמוכים, נשמרו 16,683 גנים. בערך P מותאם < 0.05, 2,248 גנים הראו ביטוי Differentially Expressed. תחת סף מחמיר יותר של P מותאם < 0.05 ו- |log2FC| ≥ 1, 594 גנים היו מובהקים, כולל 102 גנים בעלי ביטוי מוגבר (upregulated) ו-492 גנים בעלי ביטוי מופחת (downregulated) בגידולים (איור 1A,B). חיתוך של 2,248 הגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי עם 866 גני CellAge הניב 105 גנים בעלי ביטוי Differentially Expressed הקשורים להזדקנות תאית (איור 1C). PPARG הראה ביטוי מופחת ב-GSE99671, עם log2FC = -0.644, P = 0.00451, וערך P מותאם = 0.0309. ב-13 מתוך 18 הזוגות, ביטוי PPARG היה גבוה יותר ברקמה נורמלית מאשר ברקמת גידול, עם ערך P של מבחן Wilcoxon זוגי = 0.0294 (איור 1D).

סריקת פרוגנוזה רב-מודלית זיהתה את PPARG כגן המועמד המרכזי
ב-TARGET-OS נכללו 85 חולים עם 27 מקרי מוות. סריקה משולבת של 105 הגנים הקשורים לסנסנס (הזדקנות תאית) שהביטו ביטוי דיפרנציאלי, באמצעות רגרסיית Cox חד-משתנית, ניתוח Kaplan-Meier, ניתוח ROC להישרדות, LASSO, LASSO חוזר ומודל יער הישרדות אקראי (random survival forest), הניבה 18 גני מועמדים מרכזיים (hub genes) לפני התאמה קלינית (איור 2A). PPARG נמצא קשור להישרדות כוללת בניתוח Cox חד-משתני (HR = 0.603, 95% CI = 0.454–0.802, P = 0.000494, FDR = 0.0447), מה שמעיד כי ביטוי גבוה יותר של PPARG קשור לסיכון נמוך יותר לתמותה. ניתוח Kaplan-Meier להשוואה בין קבוצות הביטוי הגבוה והנמוך הניב P = 0.00784 (איור 2B). ערכי AUC תלויי-זמן ב-1, 3 ו-5 שנים היו 0.603, 0.760 ו-0.776, בהתאמה (איור 2C). PPARG הראה תדירות בחירה של 0.920 ב-LASSO חוזר וחשיבות של 0.0398 ביער הישרדות אקראי (איור 2D–F). ציון ה-hub הראשוני של PPARG היה 6/6 מכיוון שהוא עמד בכל שישה קריטריוני סריקה שהוגדרו מראש.

התאמה קלינית תמכה בקשר הפרוגנוסטי של PPARG
לאחר שילוב של משתנים קליניים משותפים (covariates), PPARG נותר קשור באופן מובהק להישרדות הכוללת (adjusted HR = 0.224, 95% CI = 0.085–0.589, P = 0.00241; איור 2G). למודל הקליני בלבד היה C-index של 0.707 ו-AIC של 89.921 (טבלה נספחת 1). הוספת PPARG העלתה את ה-C-index ל-0.829, הפחיתה את ה-AIC ל-78.466, ושיפרה באופן מובהק את התאמת המודל על פי מבחן יחס הנראות (likelihood ratio test) (P = 0.000244; טבלה נספחת 2, איור 2H,I). ניתוח רגישות לאחר הסרת ניתוחים דפיניטיביים שימר את הקשר המגן של PPARG (HR = 0.249, P = 0.00185; טבלה נספחת 3, איור 2J). PPARG הגיע לניקוד האינטגרציה הקלינית הגבוה ביותר של 13 (ניקוד hub ראשוני של 6 בתוספת שבע נקודות אינטגרציה קלינית) והראה AUC סופי של 0.770 ו-0.813 ל-3 ו-5 שנים בהתאמה (איור 2K).

מאפיינים תפקודיים ומיקרו-סביבתיים חיסוניים הקשורים ל-PPARG
בניתוח GSEA שהשווה בין קבוצות עם PPARG גבוה ו-PPARG נמוך, נצפו Nemeth Inflammatory Response LPS Up, Burton Adipogenesis 5, Burton Adipogenesis 6, Krieg KDM3A Targets Not Hypoxia, Reactome: Transcriptional Regulation By TP53, Fulcher Inflammatory Response Lectin Vs LPS Dn, Hollmann Apoptosis Via CD40 Dn, Zhou Inflammatory Response Live Dn, WP: Fatty Acids And Lipoproteins Transport In Hepatocytes, Sweet Lung Cancer KRAS Up, KEGG Medicus Pathogen HIV Tat To TLR2/4 NF-kB Signaling Pathway, ו-Reactome: Fatty Acids (איור 3A). בנתוני bulk TARGET-OS, PPARG לא נמצא במתאם מובהק עם ציון ה-CellAge הכולל של הסנצנציה (Spearman ρ = 0.022, P = 0.837; איור 3B), אך הוא נמצא במתאם עם מספר גנים בודדים של CellAge (איור 3C). ניתוח של המיקרו-סביבה החיסונית הראה מתאמים חיוביים בין PPARG לבין מקרופאגים (ρ = 0.485, FDR = 2.7 × 10-5), תאי CD8 T (ρ = 0.410, FDR = 5.88 × 10-4), החתימה הדמוית-אוסטאוקלסט (ρ = 0.383, FDR = 0.00120), נויטרופילים (ρ = 0.376, FDR = 0.00120), ותאי דנדריטיים (ρ = 0.370, FDR = 0.00123). גידולים עם PPARG גבוה הראו חתימות גבוהות יותר של תאים דמויי-אוסטאוקלסט, מקרופאגים, תאי CD8 T, תאים דנדריטיים, מונוציטים, נויטרופילים, תאי NK ותאים אנדותליאליים לאחר תיקון FDR (טבלה משלימה 4, איור 3D,E).

טרנסקריפטומיקה של תא בודד מיקמה את PPARG במדורים וסקולריים ובסביבה המיקרובית
מערך הנתונים של התא הבודד הכיל 68,336 תאים ו-32,297 גנים. ביטוי PPARG היה שונה באופן משמעותי בין סוגי תאים (איור 4A). הביטוי הממוצע הגבוה ביותר נצפה בתאי אנדותל (ביטוי ממוצע = 0.540; יחס חיובי = 44.33%), פריציטים (ביטוי ממוצע = 0.439; יחס חיובי = 41.61%), מקרופגים/מונוציטים (ביטוי ממוצע = 0.363; יחס חיובי = 31.62%), ותאי סטרומה הקשורים לגידול (ביטוי ממוצע = 0.361; יחס חיובי = 44.10%; איור 4B–E). תת-אוכלוסייה של תאי אוסטאוסרקומה ממאירים ביטאו PPARG (ביטוי ממוצע = 0.163; יחס חיובי = 16.70%), אך הביטוי בתאי אוסטאוסרקומה ממאירים לא היה גבוה באופן משמעותי מזה של תאים אחרים (FDR = 0.151). ממצאים אלו הצביעו על כך שביטוי PPARG באוסטאוסרקומה שיקף בעיקר מצבים וסקולריים, מיאלואידיים וסטרומליים של הסביבה המיקרובית, ולא היה מוגבל לתאים ממאירים (איור 4F).

טרנסקריפטומיקה מרחבית קישרה את PPARG למצבים מרחביים הקשורים להזדקנות תאית ולנישות כלי דם
לאחר בקרת איכות, נשמרו 4,572 נקודות מרחביות של SP_BS3 והן קובצו לשבעה צבירים מרחביים (איור 5A). איור 5B מראה את ההתפלגות המרחבית של nFeature_Spatial (גנים שזוהו לנקודה). בנפרד, מתוך 866 גנים של CellAge, נמצאו 845 תואמים במטריצת הביטוי המרחבית (97.58%). PPARG הראה ביטוי מרחבי מוקדי (איור 5C). מדד ההזדקנות המרחבי של CellAge, שחושב לאחר הסרת PPARG, הראה מתאם חיובי חלש אך מובהק סטטיסטית עם ביטוי PPARG (ρ = 0.0692, P = 3.0 × 10-6, FDR = 1.9 × 10-5; איור 5D). ניתוח דירוג נישות מרחביות הראה מתאמים חיוביים בין PPARG לבין מדד התאים האנדותליאליים (ρ = 0.0433, FDR = 0.00592) ומדד הפריציטים (ρ = 0.0367, FDR = 0.0181), בעוד ש-PPARG נמצא במתאם שלילי עם מדד האוסטאוסרקומה הממאירה (ρ = -0.0592, FDR = 0.000219) ומדד הסטרומה של הגידול (ρ = -0.0531, FDR = 0.000774; טבלה משלימה 5, איור 5E). ניתוח העברת תוויות הראה באופן דומה מתאמים חיוביים עם מדד הניבוי האנדותליאלי (ρ = 0.0507, FDR = 0.00120) ומדד הניבוי לפריציטים (ρ = 0.0394, FDR = 0.0123), יחד עם מתאם שלילי עם מדד הניבוי לתאי אוסטאוסרקומה ממאירה (ρ = -0.0699, FDR = 1.1 × 10-5; איור 5F–H).

ביטוי חיצוני ותיקוף ניסויי תמכו בהורדה בביטוי של PPARG
GSE36001 כלל 19 דגימות של אוסטאוסרקומה ושש ביקורות נורמליות. PPARG היה מופחת באופן משמעותי באוסטאוסרקומה (logFC = -1.429, P = 0.00730, ערך P מתוקנן = 0.0435; איור 6A). בתיקוף מבוסס תאים, ביטוי mRNA של PPARG היה נמוך באופן משמעותי בתאי אוסטאוסרקומה 143B מאשר בתאי אוסטאובלסטים אנושיים, כפי שנמדד ב-qRT-PCR (P < 0.001; איור 6B). ביטוי החלבון PPARG היה גם הוא מופחת באופן משמעותי בתאי 143B כפי שנמדד ב-Western blotting (P < 0.01; איור 6C,D). ממצאים אלו מקוהורט חיצוני, ומרמות mRNA וחלבון, תמכו בעקביות בביטוי מופחת של PPARG באוסטאוסרקומה. GSE36001 לא כלל תוצאות הישרדות ולכן סיפק תיקוף ביטוי חיצוני בלבד, ולא תיקוף פרוגנוסטי עצמאי.

זמינות נתונים:
כל מערכי הנתונים ששימשו במחקר זה זמינים לציבור. GSE99671 ו-GSE36001 הושגו ממאגר הנתונים Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi/acc=GSE99671; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi/acc=GSE36001). נתוני טרנסקריפטומיקה ונתונים קליניים של TARGET-OS הורדו מ-UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu/). גנים הקשורים להזדקנות תאית הושגו מ-CellAge: The Database of Cell Senescence Genes, חלק מ-Human Ageing Genomic Resources (https://genomics.senescence.info/cells/). מערכי הנתונים של טרנסקריפטומיקה מרחבית ותאי-בודד של אוסטאוסרקומה אנושית הושגו מהאטלס שפורסם וממאגר ה-GitHub הנלווה לו (https://github.com/zhengxj1/A-Single-Cell-and-Spatially-Resolved-Atlas-of-Human-Osteosarcomas). קבוצות גנים לניתוח העשרה הושגו מ-MSigDB (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). הנתונים המעובדים שהופקו במחקר זה וסקריפטי הניתוח ששימשו לשחזור התוצאות המדווחות נאספו והוגשו כ-קובץ משלים 1.

figure-results-1
איור 1: זיהוי גנים בעלי ביטוי Differentially Expressed וגנים מועמדים הקשורים להזדקנות (senescence) ממאגר הנתונים CellAge באוסטאוסרקומה. (A) תרשים Volcano המציג גנים בעלי ביטוי שונה בין רקמות אוסטאוסרקומה לרקמות ביקורת לא-גידוליות תואמות במערך הנתונים GSE99671. גנים עם ביטוי מוגבר (upregulated) או מופחת (downregulated) באופן מובהק מודגשים בהתאם לקריטריוני הסף שהוגדרו מראש. (B) מפת חום (Heatmap) המציגה את דפוסי הביטוי של גנים נבחרים בעלי ביטוי שונה במדגמי אוסטאוסרקומה ובמדגמי ביקורת תואמים ב-GSE99671. (C) תרשים ונ (Venn diagram) המציג את החפיפה בין הגנים בעלי הביטוי השונה ב-GSE99671 לבין גנים הקשורים להזדקנות ממאגר CellAge. (D) השוואת ביטוי מזווגת של PPARG בין רקמות אוסטאוסרקומה לרקמות ביקורת לא-גידוליות תואמות ב-GSE99671. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוחי הישרדות מותאמים קלינית ולמידה מכונה מזהים את PPARG כגנו מרכזי (hub gene) פרוגנוסטי הקשור להזדקנות תאית באוסטאוסרקומה. (A) תרשים יער (Forest plot) המציג תוצאות רגרסיית Cox חד-משתנית עבור גנים מועמדים הקשורים להזדקנות תאית בקוהורט TARGET-OS. (B) עקומת הישרדות קפלן-מאייר (Kaplan–Meier) המשווה את ההישרדות הכוללת בין מטופלים עם ביטוי גבוה של PPARG למטופלים עם ביטוי נמוך של PPARG. (C) עקומות ROC תלויות-זמן המעריכות את הביצועים הניבויים של PPARG עבור הישרדות כוללת. (D) עקומת תיקוף צולב (Cross-validation) של רגרסיית LASSO Cox לבחירת גנים מועמדים פרוגנוסטיים. (E) ניתוח יציבות LASSO חוזר המראה תדרי בניית lambda.min על פני 300 חזרות של חלוקה לחמישה חלקים (five-fold). (F) ניתוח יער הישרדות אקראי (Random survival forest) המציג ציוני חשיבות של משתנים מ-1,000 עצים. (G) תרשים יער המציג תוצאות מרגרסיית Cox מותאמת קלינית עבור גני hub מועמדים. (H) שינויים ב-AIC לאחר הוספת גני hub בודדים למודל הקליני. (I) שיפור ב-C-index לאחר הוספת גני hub בודדים למודל הקליני. (J) דירוג ציון קליני-אינטגרטיבי סופי (טווח 0–13) של גן ה-Hub המועמד. (K) עקומות ROC תלויות-זמן של PPARG בתת-קבוצת ניתוח קליני של 40 מטופלים, המראות ערכי AUC ל-3 ו-5 שנים; לא ניתן היה להעריך את ה-AUC לשנה אחת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח העשרה תפקודית וניתוח מיקרו-סביבה חיסונית הקשורים ל-PPARG. (A) תרשים בועות GSEA המשווה בין קבוצות עם PPARG גבוה ו-PPARG נמוך ומציג את: Nemeth Inflammatory Response LPS Up, Burton Adipogenesis 5, Burton Adipogenesis 6, Krieg KDM3A Targets Not Hypoxia, Reactome: Transcriptional Regulation By TP53, Fulcher Inflammatory Response Lectin Vs LPS Dn, Hollmann Apoptosis Via CD40 Dn, Zhou Inflammatory Response Live Dn, WP: Fatty Acids And Lipoproteins Transport In Hepatocytes, Sweet Lung Cancer KRAS Up, KEGG Medicus Pathogen HIV Tat To TLR2/4 NF-kB Signaling Pathway, ו-Reactome: Fatty Acids. (B) מתאם בין PPARG לבין מדד ההזדקנות הכללי של CellAge בנתוני bulk TARGET-OS. (C) מתאמים בין PPARG לבין גנים בודדים של CellAge. (D) מתאמים בין PPARG לבין חתימות של מיקרו-סביבה חיסונית. (E) הבדלים במדדי המיקרו-סביבה בין קבוצות עם PPARG גבוה ו-PPARG נמוך. המתאמים הוערכו באמצעות מקדם המתאם של Spearman (ρ), וערכי P מתוקננים חושבו באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg. קיצורים: GSEA = Gene Set Enrichment Analysis; NF-κB = nuclear factor kappa-B; JAK-STAT = Janus kinase-signal transducer and activator of transcription; IL-12 = interleukin-12; FDR = false discovery rate. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מיקום של PPARG במדורי תאים שונים בנתוני טרנסקריפטומיקה של תא בודד באוסטאוסרקומה. (A) ויזואליזציית UMAP של סוגי תאים עיקריים במערך נתונים טרנסקריפטומי של תא בודד מאוסטאוסרקומה אנושית לאחר אנוטציה ידנית פשוטה. (B) FeaturePlot המראה את ההפצה הגלובלית של ביטוי PPARG על פני תאים בודדים. (C) DotPlot המראה את ביטוי PPARG על פני סוגי תאים עיקריים. (D) תרשים כינור (Violin plot) המראה את רמות ביטוי PPARG בסוגי תאים שונים. (E) תרשים עמודות המראה את הפרופורציה של תאים חיוביים ל-PPARG בכל סוג תא עיקרי. (F) ויזואליזציית UMAP המראה ביטוי PPARG בתאי אוסטאוסרקומה ממאירים. קיצור: UMAP = uniform manifold approximation and projection. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: לוקליזציה טרנסקריפטומית מרחבית של PPARG ומאפיינים מרחביים הקשורים להזדקנות תאיים (senescence) באוסטאוסרקומה. (A) התפלגות מרחבית של אשכולות (clusters) המוגדרים על ידי הטרנסקריפטום בחתך טרנסקריפטומי מרחבי של אוסטאוסרקומה SP_BS3. (B) התפלגות מרחבית של גנים שזוהו לכל נקודה (spot), כפי שמוצג על ידי nFeature_Spatial. (C) תבנית ביטוי מרחבית של PPARG על פני נקודות ה-SP_BS3. (D) התפלגות מרחבית של מדד ההזדקנות התאית (senescence score) המופק מ-CellAge. (E) ניתוח קורלציה בין ביטוי PPARG לבין מדד ההזדקנות התאית המרחבי המופק מ-CellAge או מדדי נישה אקולוגית תאית. (F) מפת חיזוי של העברת תיוגים (label-transfer) המראה את סוג התא הדומיננטי המופק מתאי יחיד עבור כל נקודה מרחבית. (G) ניתוח קורלציה בין ביטוי PPARG, מדד ההזדקנות התאית המופק מ-CellAge, ומדדי חיזוי סוג התא המופקים מהעברת תיוגים. (H) התפלגות מרחבית של נקודות עם ביטוי גבוה של PPARG ונקודות עם ביטוי נמוך של PPARG. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: ביטוי חיצוני ותיקוף ניסויי של downregulation של PPARG באוסטאוסרקומה. (A) תרשים קופסה המראה רמות ביטוי של PPARG בדגימות אוסטאוסרקומה (n = 19) ודגימות ביקורת נורמליות (n = 6) במאגר הנתונים GSE36001. (B) ניתוח qRT-PCR של ביטוי PPARG mRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים 143B ובתאי ביקורת של אוסטאובלסטים אנושיים. (C) Western blot מייצג המראה ביטוי חלבון של PPARG ו-GAPDH בתאי ביקורת של אוסטאובלסטים אנושיים ובתאי אוסטאוסרקומה 143B. GAPDH שימש כביקורת טעינה. (D) כימות דנסיטומטרי של פסי ה-Western blot המראה רמות חלבון PPARG יחסיות שנורמלו ל-GAPDH. ב-(B) וב-(D), הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים בלתי תלויים. P < 0.01 ו-P < 0.001 לעומת קבוצת ביקורת האוסטאובלסטים האנושיים, כפי שנקבע באמצעות מבחן Student's t-test לא מזווג דו-זנבי. קיצורים: qRT-PCR = quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction; GAPDH = glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; SD = סטיית תקן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: ביצועי מודל Cox קליני בלבד בקוהורט TARGET-OS. C-index, AIC וסיכום מודל של מודל Cox שנבנה באמצעות משתנים קליניים בלבד, כולל מין, גיל, מצב המחלה בעת האבחנה, מיקום הגידול הראשוני, אזור גידול ספציפי וסטטוס ניתוח דפיניטיבי. קיצור: AIC = Akaike information criterion. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: השוואה בין מודלי Cox קליניים בלבד למודלי Cox קליניים בתוספת גנים. תוצאות השוואת מודלים לאחר הוספה של גני צומת (hub genes) מועמדים בודדים למודל הקליני, כולל C-index, AIC, סטטיסטיקות של מבחן יחס הסבירות ומדדי שיפור המודל. קיצור: AIC = Akaike information criterion. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 3: ניתוח רגישות לאחר הסרת משתנה הניתוח המכריע. תוצאות רגרסיית Cox לרגישות, המעריכות האם הקשרים הפרוגנוסטיים של הגנים המועמדים כמרכזיים (hub genes), ובמיוחד PPARG, נותרו יציבים לאחר שמשתנה הניתוח המכריע הוצא מהמודל הקליני המתואם. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 4: חתימות של מיקרו-סביבה חיסונית וסטרומלית הקשורות ל-PPARG ב-TARGET-OS. תוצאות מתאם והשוואת קבוצות בין ביטוי PPARG לבין חתימות ssGSEA חיסוניות, סטרומליות, וסקולריות, דלקתיות וקשורות ל-SASP, כולל מקדמי מתאם של Spearman, ערכי P, ערכי P מתוקננים, והשוואות בין PPARG-high ל-PPARG-low. קיצורים: SASP = senescence-associated secretory phenotype; ssGSEA = single-sample gene set enrichment analysis. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 5: ניתוח מתאמי טרנסקריפטומיקה מרחבית של PPARG ב-SP_BS3. תוצאות מתאם בין ביטוי PPARG לבין מדד הזקנה המרחבי המופק מ-CellAge, מדדי נישה אקולוגית של תאים ומדדי חיזוי סוג תא המופקים מהעברת תוויות (label-transfer) בחתך טרנסקריפטומיקה מרחבי של אוסטאוסרקומה SP_BS3. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

מחקר זה הציע את PPARG כגן פרוגנוסטי מועמד הקשור להזדקנות תאית (senescence) באוסטאוסרקומה, וזאת באמצעות שילוב של ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, חיתוך גנים ממאגר CellAge, מידול הישרדות של TARGET-OS, התאמה קלינית, לוקליזציה מולטי-אומיקה ותיקוף ניסויי. מסגרת אנליטית זו תואמת את הדגש הנוכחי על מחקרי אוסטאוסרקומה מבוססי מידע מולקולרי ושימוש במשאבי גני-הזדקנות מאורגנים לצורך פרשנות של ביולוגיה הקשורה להזדקנות תאית14,31. PPARG הראה ביטוי מופחת באוסטאוסרקומה בהשוואה לרקמה נורמלית, וביטוי נמוך יותר של PPARG היה קשור להישרדות כללית גרועה יותר ב-TARGET-OS. ממצאים אלה העלו כי PPARG אינו רק משונה ברמה התעתית באוסטאוסרקומה, אלא עשוי לשאת מידע פרוגנוסטי רלוונטי מבחינה קלינית. עם זאת, מכיוון שבחירת המועמדים והערכת המודל בוצעו באותה קהילת TARGET-OS (85 חולים, 27 מקרי מוות), השיפור שנצפה בביצועי המודל היה רגיש לאופטימיות ולהתאמת-יתר (overfitting); לפיכך, יש להתייחס לערך הפרוגנוסטי של PPARG כמייצר היפותזות עד שיוכח בקהילת הישרדות עצמאית של אוסטאוסרקומה. למרות זאת, יש לפרש את הביולוגיה של PPARG באופן תלוי-הקשר, שכן מחקרי אוסטאוסרקומה ניסוייים דיווחו הן על השפעות אנטי-גידוליות של מודולציית PPAR-gamma/nuclear-receptor והן על תוכניות אוסטאוקלסטים הקשורות ל-PPARG שעשויות לתמוך בהתקדמות המחלה32,33,34.

ניואנס חשוב היה שאין לפרש את PPARG כמסמך חלופי פשוט למדד ה-CellAge הכולל. בנתוני bulk TARGET-OS, PPARG לא נמצא במתאם מובהק עם מדד ההזדקנות הגלובלי של CellAge, בעוד שבטרנסקריפטומיקה מרחבית, PPARG הראה מתאם חלש אך מובהק עם מדד CellAge שחושב לאחר ה exclusion של PPARG. הבדל זה עשוי לשקף השפעות של הרכב תאי בנתוני bulk, את טבעם הרב-תפקודי של מערכי גני הזדקנות, והעשרה מקומית של נישות מיקרו-סביבתיות בנקודות מרחביות. מחקרי קונצנזוס ומחקרי טרנסקריפטומיקה הדגישו כי הזדקנות תאית היא הטרוגנית, דינמית ותלויה בסוג התא, בגורם העקה ובסביבת הרקמה, בעוד שתוכניות SASP יכולות להפעיל השפעות מנוגדות במהלך התקדמות הסרטן25,35,36,37. לכן, PPARG הוגדר באופן שמרני כגן פרוגנוסטי הקשור להזדקנות שנגזר מ-CellAge, ולא כמניע מוכח של הזדקנות. בהתאם לכך, ההגדרה של PPARG כקשור להזדקנות שיקפה את השייכות שלו למערך הגנים של CellAge ולא מעורבות מכניסטית מוכחת בהזדקנות, ואין להשתמש ב-PPARG כמסמך חלופי כמותי לפעילות הזדקנות כוללת.

באופן כללי יותר, תוצאות מרחביות אלו הדגימו את ההבחנה בין מובהקות סטטיסטית לרלוונטיות ביולוגית. עם 4,572 נקודות מרחביות, אפילו מתאמים חלשים מאוד עשויים לחרוג מספי מובהקות קונבנציונליים; לדוגמה, המתאם בין PPARG לבין מדד ההזדקנות המרחבי CellAge (ρ = 0.0692) הסביר רק כ-0.48% מהשונות, אך הגיע לערך P של 3.0 × 10-6 מכיוון שמספר הנקודות הגדול סיפק עוצמה סטטיסטית ניכרת. לפיכך, יש להתייחס לקשרי נקודות (spot-level) כאלה כאותות שניתן לזהותם סטטיסטית אך הם צנועים מבחינה ביולוגית ומשמשים להצבת השערות, וגודל האפקט שלהם, ולא ערכי ה-P לבדם, הוא שצריך להנחות את הפרשנות הביולוגית. אין להשוות מובהקות סטטיסטית במאגרי נתונים גדולים ברמת הנקודה להשפעות ביולוגיות חזקות.

ניתוחים ברמה של תא בודד (Single-cell) וניתוחים מרחביים סיפקו הקשר ביולוגי עבור PPARG. ביטוי של PPARG היה מועשר בתאי אנדותל, פריציטים, מקרופאגים/מונוציטים ותאי סטרומה הקשורים לגידול, והיה קשור מרחבית למדדי אנדותל ופריציטים. תוצאות אלו הצביעו על כך שהמידע הפרוגנוסטי הנשא על ידי PPARG עשוי להיות מקושר למדורים וסקולריים ומיקרו-סביבתיים באוסטאוסרקומה. פרשנות זו הייתה תואמת לאטלסים עדכניים של תאים בודדים/מיפוי מרחבי של אוסטאוסרקומה, ולראיות רחבות יותר לכך שנישות חיסוניות, וסקולריות וסטרומליות מעצבות את ההטרוגניות של הגידול, את התגובה לטיפול ואת התקדמות המחלה25,38,39. מאחר שתאי אוסטאוסרקומה ממאירים ביטאו PPARG רק בתת-אוכלוסייה של תאים ולא הראו ביטוי גבוה באופן משמעותי מתאים אחרים, פרשנות המתמקדת אך ורק בתאי הגידול הייתה חלקית. לעומת זאת, הירידה בביטוי (downregulation) של PPARG ברמת ה-bulk שנצפתה ב-GSE99671 וב-GSE36001 עשויה הייתה לשקף בחלקה הבדלים בהרכב תאי הסטרומה, כלי הדם, מחית העצם, תאים אדיפוגניים או תאי מערכת החיסון בין רקמות גידול לרקמות נורמליות, ולאו דווקא ירידה אמיתית בביטוי בתאי אוסטאוסרקומה ממאירים. כיוון שטוהר הגידול ושכיחות סוגי התאים לא הותאמו באופן מפורש בניתוחי ה-bulk, לא ניתן היה לשלול אפשרות זו, והיא הצדיקה חקירה ממוקדת.

ניתוחים של המיקרו-סביבה התפקודית והחיסונית היו עקביים עם פרשנות זו. PPARG נמצא במתאם עם חתימות של מקרופאגים, תאי T מסוג CD8, תאים דנדריטיים, נויטרופילים, תאי NK ותאים אנדותליאליים, וניתוח GSEA הדגיש מסלולים הקשורים לדלקת, NF-κB, סיגנלינג של JAK-STAT/IL-12, ויסות של TP53 ונקודות בקרה של נזק ל-DNA. יחד, תוצאות אלו הצביעו על כך ש-PPARG עשוי לסמן מצב מיקרו-סביבתי מורכב הכולל עקה הקשורה להזדקנות תאית (senescence), חדירה חיסונית, ומדורי כלי דם וסטרומה. פרשנות זו הייתה סבירה מבחינה ביולוגית מכיוון של-PPAR-gamma יש תפקידים מבוססים בדיכוי הפעלה דלקתית של מקרופאגים/מונוציטים, כולל השפעות על תוכניות שעתוק הקשורות ל-AP-1, STAT ו-NF-κB, ומכיוון שהמיקרו-סביבה החיסונית של האוסטאוסרקומה מכילה אלמנטים מיאלואידיים, לימפואידיים וכלי דם בעלי תפקודים המעודדים גידול ותפקודים מדכאי גידול38,40,41. תצפיות אלו ברמה של תא בודד ובמרחב היו תיאוריות ומייצרות השערות; הן לא ביססו כשלעצמן מנגנונים של נישה וסקולרית, תוכניות הזדקנות תאית או מסלולים פרוגנוסטיים.

יש להכיר במספר מגבלות. ראשית, ניתוח הפרוגנוזה העיקרי התבסס על קוהורט ציבורי רטרוספקטיבי של TARGET-OS, עם גודל מדגם ומספר אירועים מוגבלים; לכן, את הערך הפרוגנוסטי של PPARG יש לתקף בקוהורטים עצמאיים בהתאם לעקרונות המקובלים לדיווח ותיקוף של סממני גידול42. בפרט, סינון המועמדים בוצע ב-85 חולי TARGET-OS עם 27 מקרי מוות, בעוד שהערכת המודל המותאם קלינית השתמשה בתת-קבוצה חופפת של 40 חולים עם 13 מקרי מוות. מכיוון ששני הניתוחים נגזרו מאותה קוהורט מקור, שיפור ה-C-index המדווח (מ-0.707 ל-0.829) וההפחתה ב-AIC הם ככל הנראה אופטימיים. לא הייתה זמינה קוהורט הישרדות עצמאית כדי לתקף חיצונית את הערך הפרוגנוסטי של PPARG; GSE36001 שימשה רק לתיקוף ביטוי של גידול לעומת רקמה נורמלית. בנוסף, ציון ה-hub המשולב היה היוריסטיקה פנימית של דירוג לצורכי מחקר ולא כלי פרוגנוסטי מתוקף. שנית, ניתוח הטרנסקריפטומיקה המרחבית התבסס על דגימת SP_BS3 אחת; למרות שהמתאמים היו מובהקים סטטיסטית, גודלי האפקט היו קטנים ודורשים תיקוף על פני דגימות מרחביות נוספות. בפרט, הגדלת מספר דגימות הטרנסקריפטומיקה המרחבית מחולים עצמאיים תהיה חיונית להשגת הערכות חסונות יותר של קשרים חלשים אלו, ומחקרים המבוססים על קוהורטים מרחביים גדולים יותר הם מוצדקים. טרנסקריפטומיקה מרחבית מספקת הקשר מולקולרי in situ בעל ערך, אך הפרשנות נותרה מושפעת מרזולוציית הפלטפורמה, אסטרטגיית הדגימה, איכות הרקמה ובחירות האינטגרציה החישובית43. יתרה מכך, הניתוח המרחבי הסתמך על אובייקט תא בודד ציבורי שעבר עיבוד מוקדם עם הערות פשוטות ועל ניקוד חישובי והעברת תוויות; בהינתן גודלי האפקט המינימליים, נתונים אלה תמכו בהצהרות לוקליזציה תיאוריות ולא בטענות מכניסטיות לגבי נישות וסקולריות או תוכניות של סנסינס (הזדקנות תאית). שלישית, התיקוף הניסויי התבסס על קו התאים של אוסטאוסרקומ 143B ועל אוסטאובלסטים אנושיים; דרושים קווי תאים נוספים של אוסטאוסרקומ ודגימות קליניות, ותיקוף בקו תאים בודד אינו יכול לבסס ספציפיות לסוג התא, רלוונטיות פרוגנוסטית קלינית או ביולוגיה של סנסינס. רביעית, מחקר זה הדגים קשר ולא סיבתיות. הפרעה פונקציונלית של PPARG בתאי אוסטאוסרקומ ובמודלים של מיקרו-סביבה תהיה נחוצה כדי לקבוע האם PPARG מווסת ישירות תוכניות הקשורות לסנסינס, נישות וסקולריות או התקדמות הגידול. חמישית, הקשר לסנסינס הוגדר על ידי חפיפה עם סט הגנים CellAge, ו-PPARG לא נמצא במתאם עם ציון הסנסינס הכללי של CellAge ב-TARGET-OS. יתרה מכך, השוואות כלליות של גידול לעומת רקמה נורמלית לא הותאמו לטוהר הגידול או להרכב סוגי התאים, כך שההדרה (downregulation) שנצפתה עשויה לשקף חלקית הבדלים בהרכב המיקרו-סביבתי ולא שינויים פנימיים בתאי הגידול הממאירים.

PPARG הוא גן שנגזר מ-CellAge, אשר ביטוי נמוך שלו קשור להישרדות כוללת שאינה רצויה בקוהורט TARGET-OS. רמות הביטוי הנמוכות שלו בהשוואות של דגימות osteosarcoma כוללות, יחד עם העשרה שלו במדורים וסקולריים, מיאלואידיים וסטרומליים, מרמזות כי רמות PPARG כוללות עשויות לשקף בחלקן את הרכב התאים בסביבה המיקרו-סביבתית ולא את הביטוי הפנימי של התאים הממאירים. הממצאים ברמת התא הבודד והממצאים המרחביים הם תיאוריים, והקשר הפרוגנוסטי לא תוקף באופן עצמאי עבור הישרדות ודורש תיקוף בקוהורט חיצוני עם תוצאות הישרדות. ממצאים אלה מציעים את PPARG כביומארקר פוטנציאלי להערכה פרוגנוסטית ב-osteosarcoma ולמחקר על סביבות מיקרו-סביבתיות הקשורות להזדקנות תאית (senescence), בכפוף לתיקוף חיצוני ומחקרים פונקציונליים. בטרנסקריפטומיקה מרחבית, המתאמים בין PPARG לבין ציוני הנישה הקשורה להזדקנות או הנישה הוסקולרית היו בעלי גודל אפקט חלש, אם כי מובהקים סטטיסטית בשל המספר הגדול של נקודות המרחב, ולכן יש לפרשם בזהירות.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים.

תרומות מחברים:
Yongwen Li ו-Wentao Qin הגו ותכננו את המחקר. Yongwen Li ביצע את הניתוחים הביואינפורמטיים והחישוביים. Tuo Liang ביצע את התיקוף הניסויי. Rubiao Qiu ו-Zide Zhang תרמו להכנת האיורים. Rubiao Qiu ו-Zide Zhang פיקחו על המחקר ועברו על כתב היד באופן ביקורתי. כל המחברים סקרו ואישרו את כתב היד הסופי

תודות

המחברים מודים בחום לחוקרים ולתורמים של פרויקטי GEO, TARGET-OS, UCSC Xena, CellAge, MSigDB, והאטלס של טרנסקריפטומיקה מרחבית ותאי-בודד של אוסטאוסרקומה אנושית, על אספקת מערכי נתונים ומשאבים הזמינים לציבור אשר אפשרו מחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הטבעי של גואנגשי (מס' 2023GXNSFAA026111).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן ראשוני Anti-GAPDHProteintech Group, Wuhan, China10494-1-APנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי GAPDH כבקרת טעינה ב-western blotting; מהיל 1:5,000.
נוגדן ראשוני Anti-PPARGProteintech Group, Wuhan, China16643-1-APנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי חלבון PPARG ב-western blotting; מהיל 1:1,000.
ערכה לבדיקת חלבון BCABeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaPC0020בדיקה קולורימטרית המשמשת לקביעת ריכוז החלבון הכולל לפני אלקטרופורזה.
DESeq2BioconductorVersion 1.40.2חבילת R המשמשת לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי של נתוני טרנסקריפטומיקה מבוססי ספירה.
מצע Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China11995מצע תרבית בסיסי המשמש לתחזוקת תאי אוסטאוסרקומה 143B.
ריאגנט זיהוי ECLBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaPE0010מצע כימילומניסנציה המשמש לזיהוי נוגדנים מצומדים ל-HRP ב-western blotting.
סרום עגל עוברי (FBS)Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd. (Sijiqing), Huzhou, Zhejiang, China11011-8611תוסף סרום המתווסף למצע התרבית לתמיכה בצמיחת תאים וביכולת ההישרדות שלהם.
glmnetCRANVersion 4.1-8חבילת R המשמשת לניתוחי רגרסיה עם עונש (penalized regression), כולל מידול LASSO ו-elastic-net.
GraphPad PrismGraphPad Software, San Diego, CA, USAVersion 9.0תוכנה המשמשת לניתוח סטטיסטי, יצירת גרפים והדמיה של נתונים ניסויים.
נוגדן שני מצומד ל-HRPProteintech Group, Wuhan, ChinaSA00001-2נוגדן שני מצומד ל-Horseradish peroxidase המשמש לזיהוי ב-western blot; מהיל 1:5,000.
תאי אוסטאובלסטים אנושייםCell Applications, Inc., San Diego, CA, USA406-05Aתאי אוסטאובלסטים אנושיים ראשוניים המשמשים כסוג תאים להשוואה/בקרה שאינם ממאירים.
קו תאי אוסטאוסרקומה אנושי 143BAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USACRL-8303קו תאי אוסטאוסרקומה אנושי המשמש לניסויי תיקוף in vitro ובדיקות מולקולריות.
ImageJNational Institutes of Health (NIH), USAVersion 1.53תוכנה לניתוח תמונות המשמשת לניתוח כמותי של תמונות ניסויים.
limmaBioconductorVersion 3.56.2חבילת R המשמשת לניתוח ביטוי דיפרנציאלי ובדיקה סטטיסטית מבוססת מודל לינארי.
פניצילין-סטRepartitionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP1400תוסף אנטיביוטי המשמש במצע תרבית תאים להפחתת זיהום חיידקי.
פריימרים ל-PPARG ו-GAPDHSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, ChinaCustom synthesis; sequences provided in the Methodsפריימרים אוליגונוקלאוטידיים בהזמנה מיוחדת המשמשים לניתוח qPCR של ביטוי PPARG ו-GAPDH.
ממברנות PVDF, 0.45 µmBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaYA1701ממברנות המשמשות להעברת חלבונים במהלך western blotting.
תוכנת הסטטיסטיקה RR Foundation for Statistical Computing, Vienna, AustriaVersion 4.3.2סביבת מחשוב סטטיסטית המשמשת לניתוחים ביו-אינפורמטיים, בניית מודלים והדמיה.
randomForestSRCCRANVersion 3.2.2חבילת R המשמשת למידול random survival forest וניתוח חשיבות מאפיינים.
ערכה לטרנסקריפציה הפוכהBeyotime Biotech Inc., Shanghai, ChinaD7168Mמשמשת לסינתזה של DNA משלים (cDNA) מ-RNA מבודד לפני qPCR כמותי.
בופר ליזיס RIPABeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaR0010בופר למיצוי חלבונים המשמש לליזיס של תאים לצורך ניתוח western blot.
SeuratSatija LaboratoryVersion 5.0.1חבילת R המשמשת לעיבוד נתוני ריצוף RNA של תא בודד, אינטגרציה, אשכול (clustering) והדמיה.
survivalCRANVersion 3.5-7חבילת R המשמשת לניתוח הישרדות, כולל מידול סיכונים פרופורציונליים של קוקס (Cox).
תערובת SYBR Green qPCR master mixBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSR1110תערובת מאסטר פלואורסצנטית המשמשת להגברה ב-PCR כמותי בזמן אמת.
timeROCCRANVersion 0.4חבילת R המשמשת ליצירת עקומות מאפייני הפעלה של מקלט (ROC) תלויות זמן וחישוב ביצועי חיזוי לאורך זמן.
ריאגנט TRIzolInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15596026CNריאגנט המשמש למיצוי RNA כולל מתאי תרבית.
Trypsin-EDTA, 0.25%Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT1300ריאגנט לפירוק תאים המשמש למעבר (passaging) ואיסוף של תאים נצמדים.

מקורות

  1. Mirabello L, Troisi RJ, Savage SA. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 2009;115:1531-1543.
  2. Bielack SS, et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. J Clin Oncol. 2002;20:776-790.
  3. Isakoff MS, Bielack SS, Meltzer P, Gorlick R. Osteosarcoma: Current Treatment and a Collaborative Pathway to Success. J Clin Oncol. 2015;33:3029-3035.
  4. Kansara M, Teng MW, Smyth MJ, Thomas DM. Translational biology of osteosarcoma. Nat Rev Cancer. 2014;14:722-735.
  5. Peng P, et al. Epigenetic remodeling under oxidative stress: Mechanisms driving tumor metastasis. MedComm - Oncology. 2024;3.
  6. Muñoz-Espín D, Serrano M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:482-496.
  7. Coppé JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 2010;5:99-118.
  8. Collado M, Serrano M. Senescence in tumours: evidence from mice and humans. Nat Rev Cancer. 2010;10:51-57.
  9. Lehrke M, Lazar MA. The many faces of PPARgamma. Cell. 2005;123:993-999.
  10. Peters JM, Shah YM, Gonzalez FJ. The role of peroxisome proliferator-activated receptors in carcinogenesis and chemoprevention. Nat Rev Cancer. 2012;12:181-195.
  11. Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 2013;41.
  12. Ho XD, et al. Whole transcriptome analysis identifies differentially regulated networks between osteosarcoma and normal bone samples. Exp Biol Med (Maywood). 2017;242:1802-1811.
  13. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
  14. Avelar RA, et al. A multidimensional systems biology analysis of cellular senescence in aging and disease. Genome Biol. 2020;21:91.
  15. Goldman MJ, et al. Visualizing and interpreting cancer genomics data via the Xena platform. Nat Biotechnol. 2020;38:675-678.
  16. Prentice RL, Zhao S. Regression Models and Multivariate Life Tables. J Am Stat Assoc. 2021;116:1330-1345.
  17. Heagerty PJ, Lumley T, Pepe MS. Time-dependent ROC curves for censored survival data and a diagnostic marker. Biometrics. 2000;56:337-344.
  18. Tibshirani R. The lasso method for variable selection in the Cox model. Stat Med. 1997;16:385-395.
  19. Jaeger BC, et al. OBLIQUE RANDOM SURVIVAL FORESTS. Ann Appl Stat. 2019;13:1847-1883.
  20. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:15545-15550.
  21. Newman AM, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods. 2015;12:453-457.
  22. Zhou Y, et al. Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma. Nat Commun. 2020;11:6322.
  23. Stuart T, et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 2019;177:1888-1902.e21.
  24. Hao Y, et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021;184:3573-3587.e29.
  25. Zheng X, et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human osteosarcomas. J Hematol Oncol. 2024;17:71.
  26. Ståhl PL, et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 2016;353:78-82.
  27. Kresse SH, et al. Integrative analysis reveals relationships of genetic and epigenetic alterations in osteosarcoma. PLoS One. 2012;7.
  28. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43.
  29. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25:402-408.
  30. Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012;9:671-675.
  31. Gill J, Gorlick R. Advancing therapy for osteosarcoma. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18:609-624.
  32. Sun L, et al. Single-cell RNA sequencing revealed PPARG promoted osteosarcoma progression: based on osteoclast proliferation. Front Immunol. 2024;15:1506225.
  33. Yuan B, et al. Nuclear receptor modulators inhibit osteosarcoma cell proliferation and tumour growth by regulating the mTOR signaling pathway. Cell Death Dis. 2023;14:51.
  34. Lu Y, et al. Oridonin exerts anticancer effect on osteosarcoma by activating PPAR-γ and inhibiting Nrf2 pathway. Cell Death Dis. 2018;9:15.
  35. Gorgoulis V, et al. Cellular Senescence: Defining a Path Forward. Cell. 2019;179:813-827.
  36. Faget DV, Ren Q, Stewart SA. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nat Rev Cancer. 2019;19:439-453.
  37. Hernandez-Segura A, et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Curr Biol. 2017;27:2652-2660.e4.
  38. Tian H, et al. Managing the immune microenvironment of osteosarcoma: the outlook for osteosarcoma treatment. Bone Res. 2023;11:11.
  39. Hanahan D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 2022;12:31-46.
  40. Ricote M, Li AC, Willson TM, Kelly CJ, Glass CK. The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation. Nature. 1998;391:79-82.
  41. Jiang C, Ting AT, Seed B. PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines. Nature. 1998;391:82-86.
  42. McShane LM, et al. REporting recommendations for tumour MARKer prognostic studies (REMARK). Br J Cancer. 2005;93:387-391.
  43. Moses L, Pachter L. Publisher Correction: Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 2022;19:628.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גנים פרוגנוסטיים לאוסטאוסרקומהגנים הקשורים להזדקנות תאיתביטוי PPARGטרנסקריפטומיקה של תא בודדטרנסקריפטומיקה מרחביתביטוי דיפרנציאלימיקרו-סביבה חיסוניתרגרסיית קוקסWestern blotqRT-PCR
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.