מאמר מחקר

קפסולות Yangjing מקלות על תפקוד לקוי של ספרמטוגנזה בעכברים על ידי עיכוב של מסלול QKI-5/p38 MAPK באמצעות ויסות חיובי (upregulation) של IncRNA NONMMUT031883.2

11 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73166

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מעריך את ההשפעות המגנות של קפסולות Yangjing על תפקוד ספרמטוגני פגוע שנוצר על ידי ציקלופוספמיד בעכברים, ובודק את המעורבות של מסלול האיתות lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

תקציר

ליקויים בספרמטוגנזה הם גורם חשוב לאי פוריות גברית, וציקלופוספמיד (CP) עלול לפגוע בספרמטוגנזה על ידי השראה של אפופטוזה חריגה של ספרמטוגוניה. קפסולות Yangjing (YC) שימשו לשיפור התפקוד הרבייתי, אך המנגנון המולקולרי העומד בבסיסן נותר לא ברור. מחקר זה בחן את ההשפעות המגנות של YC במודל עכברים של ליקויים בספרמטוגנזה המושרים על ידי CP ובתאי ספרמטוגוניה מסוג GC-1. נבחנו ספירת תאי זרע וניידותם, פוריות זכרית, רמות הורמוני מין בנסיוב, ושינויים היסטופתולוגיים באשכים ובאפידידימיס. בבדיקות של תאי GC-1 הוערכו חיוניות התאים, שחרור לקטט דהידרוגנאז, אפופטוזה וחלבונים הקשורים לאפופטוזה. נעשה שימוש ב-Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, בניסויי RNA pull-down, באימונופלואורסצנציה וב-Western blotting כדי לבחון את lncRNA NONMMUT031883.2, את Quaking-5 (QKI-5) ואת שרטור האותות של p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK). YC שיפר בצורה התלויה במינון את איכות הזרע, רמות הורמוני המין בנסיוב, את המורפולוגיה של איברי הרבייה, את ההיסטופתולוגיה של האשכים ואת הפוריות בעכברים שטופלו ב-CP. בתאי GC-1, YC הגביר את חיוניות התאים והפחית נזק תאי ואפופטוזה. נמצא כי lncRNA NONMMUT031883.2 מקייים אינטראקציה פיזית עם QKI-5, וטיפול ב-YC הגביר את הביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2 בעודו מפחית את הביטוי של QKI-5 ואת הפספורילציה של p38. טיפול ב-YC עיכב אפופטוזה שהושרה על ידי knockdown של lncRNA NONMMUT031883.2 בתאי GC-1, בעוד שביטוי יתר של QKI-5 הפחית את ההשפעות האנטי-אפופטוטיות של YC. ממצאים אלו מרמזים כי YC מקל על ליקויים בספרמטוגנזה המושרים על ידי CP, וכי השפעותיו המגנות מתווכות על ידי ויסות של נתיב ה-lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

מבוא

שיבוש ספראטוגני (Spermatogenic dysfunction) מתייחס לליקוי רבייתי הנגרם מחריגות בייצור, בהבשלה או בתפקוד של תאי זרה במערכת הרבייה הזכרית. הוא מאופיין בספירת זרע מופחתת, בניידות מופחתת ובשיעור מוגבר של מורפולוגיה לקויה של תאי זרה1,2. הפתוגנזה של שיבוש ספראטוגני היא מורכבת וקשורה לגורמים גנטיים, הפרעות אוטואימוניות, רעלים סביבתיים, נזק מושרה כימותרפיה ונגעים באיברי הרבייה3-5. תרופות כימותרפיות כגון ציקלופוספמיד (CP) עלולות לגרום לנזק ישיר לצינוריות השוכן (seminiferous tubules) בtestes ולהוביל לאפופטוזיס של ספראטוגוניה, ובכך לתרום לשיבוש ספראטוגני זכרי6,7. כיום משתמשים בטיפולים הורמונליים חלופיים, בתוספי נוגדי חמצון ובטכנולוגיות רבייה מסייעות כהתערבויות קליניות. עם זאת, לגישות אלו יעילות לא עקבית ותופעות לוואי משמעותיות8,9,10. לפיכך, זיהוי התערבויות בטוחות ויעילות והבהרת מטרותיהן המולקולריות הם בעלי חשיבות קלינית לשיפור תוצאות הפוריות בחולים עם שיבוש ספראטוגני.

רפואה סינית מסורתית הצהירה על פוטנציאל בהגנה על תפקוד הרבייה הגברי ובטיפול בליקויים בספרמטוגנזה, הודות לתכונותיה רב-מטרתיות ולרעילותה הנמוכה יחסית11,12. קפסולת Yangjing (YC) היא תרופה סינית פטנטית מסורתית המורכבת מ- Rehmannia glutinosa, Epimedium, שליה, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis וצמחי מרפא סיניים נוספים. היא משמשת לחיזוק הכליות והתמצית (essence), להזנת הדם והמוח, ולויסות תפקוד הרבייה13. מחקרים קודמים הראו כי YC יכולה לווסת רמות של הורמוני מין בבעלי חיים זכרים, לשפר את איכות הזרע, לתקן נזקים ברקמת האשכים ולהגן מפני פגיעה ברבייה המושאת על ידי חומרים כימיים14,15. תאי ספרמטוגוניה מהווים את הבסיס לספרמטוגנזה, ואפופטוזה חריגה של תאי ספרמטוגוניה היא אירוע מרכזי בהתפתחות של ליקויים בספרמטוגנזה16. כמו כן, דווח כי YC משפרת את חיוניות תאי הספרמטוגוניה, מגבירה את שיעור התאים בשלב S ומעכבת אפופטוזה17. עם זאת, השפעותיה המגנות והמנגנונים המולקולריים הספציפיים שלה בליקויים בספרמטוגנזה המושרים על ידי CP נותרו לא ברורים.

RNA שאינו מקודד לחלבון ארוך (lncRNAs) הם מולקולות RNA באורך של יותר מ-200 נוקלאוטידים שחסרה להן היכולת לקודד לחלבון18. lncRNAs יכולים לווסת ביטוי גנים באמצעות מנגנונים הכוללים השתקה כרומוזומלית, שינוי כרומטין, הטבעה גנומית והפעלה תעתוקית19,20. החלבון קוואקינג-5 (QKI-5), הקושר RNA, משתתף בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כולל שגשוג תאים ואפופטוזיס, על ידי ויסות של שחלוף חלופי (alternative splicing) של גנים במורד הדרך21. נתיב p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) מעורב בוויסות אפופטוזיס וכן ממלא תפקיד חשוב בפוריות זכרית ובהתפתחות האשכים22,23. מחקר קודם הראה כי ביטוי יתר של QKI-5 מפעיל את נתיב p38 MAPK בתאי קרצינומה של התאים הכבדיים24. בנוסף, נמצא כי lncRNA NONMMUT074098.2 נקשר ל-QKI-5 בספרמטוגוניה, בעוד ששתיקה (knockdown) של QKI-5 עיכבה את נתיב p38 MAPK והפחיתה אפופטוזיס של ספרמטוגוניה25. מחקר זה השתמש במודל עכברים עם שיבוש ספרמטוגני המושרה על ידי CP כדי לבחון האם YC מווסת את הביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2 ואת ציר הסיגנלינג QKI-5/p38 MAPK, ובכך מפחית אפופטוזיס חריג של ספרמטוגוניה ומקל על שיבוש ספרמטוגני המושרה על ידי CP (איור 1). המטרה הייתה להבהיר את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס ההשפעות המגינות של YC על הספרמטוגנזה ולהרחיב את ההבנה לגבי תפקידו הפרמקולוגי בהגנה על התפקוד הרבייתי הזכרי.

figure-introduction-1
איור 1: תרשים סכמטי של מערך הניסוי. הפאנל העליון מסכם את הניסויים in vitro בתאי ספרמטוגוניה מסוג GC-1. השתמשו בהשקתה (Knockdown) של lncRNA NONMMUT031883.2 כדי להשרות אפופטוזה ונזק תאי, ולאחר מכן בוצעה השקתה של QKI-5 כדי להעריך את השפעותיו על האפופטוזה והפגיעה התאית. הפאנל התחתון מסכם את הניסויים in vivo במודלים של עכברים עם תפקוד ספרמטוגני לקוי שהושרה על ידי ציקלופוספמיד (CP). העכברים קיבלו טיפול ב-Yangjing Capsule ו/או התערבות באמצעות lncRNA NONMMUT031883.2 או QKI-5. לאחר מכן הוערכו פוריות, רמות הורמונים בסרום, רקמות אשכים ואפדידימיס, תרחיף זרע, מאגרי זרע, איכות הזרע ונזק היסטופתולוגי באשכים. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

כל ניסויי בעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE ולמדריך של המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health) לטיפול ולהשתמש בבעלי חיים במעבדה. כל הפרוטוקולים הניסוייים נסקרו ואושרו על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של Southeast University (מספר אישור 20230216022).

1. הכנת סרום המכיל YC
שתי קפסולות Yangjing (YC; 0.5 g לקפסולה) נפתחו, ו-0.8 g מתוכן נשקלו. תמיסת סליין נורמלית נוספה עד לנפח סופי של 10 mL, והתערובת עברה ערבול ב-vortex ביסודיות להכנת סספנזיה בריכוז 80 mg/mL. עכברי BALB/c זכרים, נטולי פתוגנים ספציפיים (SPF), במשקל 22–25 g ובגיל 8 שבועות, הוחזקו בטמפרטורה של 22 °C ובלחות של 55%–60% תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות, עם מזון ומים שסופקו ad libitum. לאחר שבוע של הסתגלות, העכברים קיבלו YC באמצעות הזנה פומית (oral gavage) במינון של 800 mg/kg משקל גוף בנפח של 10 mL/kg פעם אחת ביום למשך 5 ימים רצופים. שעתיים לאחר המנה האחרונה, העכברים הורדמו באמצעות הזרקה תוך-פריטונית של 1% sodium pentobarbital, ודגימות דם נאספו להכנת סרום המכיל YC. הסרום עובשן בטמפרטורה של 56 °C למשך 30 min, סונן דרך ממברנה של 0.22 µm, ואוחסן בטמפרטורה של −80 °C עד לשימוש.

2. תרבית תאים והחדרה (transfection)
תאי ספרמטוגונוני GC-1 של עכבר גודלו ב-DMEM המכיל 1% penicillin-streptomycin ו-10% fetal bovine serum. כל התרביות שומרו בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה המכילה 5% CO₂ (v/v).

סנתו ובנו RNA בעל לולאה קצרה ספציפי ל-LncRNA (sh-lncRNA), פלסמיד לביטוי יתר של QKI-5 (OE-QKI-5), RNA מפריע קטן ל-QKI-5 (si-QKI-5), ובקרות שליליות תואמות להם (sh-NC, OE-NC ו-si-NC). תאי GC-1 עברו טרנספקציה עם sh-lncRNA או sh-NC, עם si-QKI-5 או si-NC, או עם OE-QKI-5 או OE-NC, בהתאם להוראות של רכיב הטרנספקציה. לאחר דגירה של 48 h, הוערכה יעילות הטרנספקציה על ידי מדידת הביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2 או QKI-5.

עבור קבוצת sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposide, תאי GC-1 עברו טרנספקציה עם sh-lncRNA ו-si-QKI-5 ולאחר מכן טופלו ב-100 µM etoposide למשך 12 שעות26. עבור בדיקות חיות תאים עוקבות, תאי GC-1 תורבדו במצע מועשר ב-5%, 10% או 20% סרום המכיל YC, והוגדרו כקבוצות YC במינון נמוך (L-YC), YC במינון בינוני (M-YC) ו-YC במינון גבוה (H-YC), בהתאמה. ריכוזי הסרום המכיל YC (5%, 10% ו-20% YC) נקבעו על בסיס תוצאות של ניסויי מדרג ריכוזים מקדימים. עבור קבוצות sh-lncRNA + H-YC + OE-NC ו-sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5, תאי GC-1 עברו טרנספקציה עם sh-lncRNA בתוספת OE-NC או sh-lncRNA בתוספת OE-QKI-5 למשך 48 שעות, ולאחר מכן נחשפו ל-20% סרום המכיל YC למשך 24 שעות.

3. בדיקת Cell Counting Kit-8
תאי GC-1 נזרעו לתוך פלטות עם 96 בארות בריכוז של 5 × 103 תאים/באר ואומודו למשך 24 h. לאחר היצמדות התאים, המצע המקורי הוחלף ב-100 µL של מצע מלא המועשר בסרום המכיל YC, והתאים דגרו למשך 6, 12 או 24 h. לאחר הדגירה, הוספו 10 µL של ריאגנט Cell Counting Kit-8 לכל בארה, והתאים דגרו ב-37 °C בחשכה למשך 2 h. הבליעה ב-450 nm נמדדה באמצעות קורא מיקרו-פלטות.

4. בדיקת לקטט דהידרוגנאז (Lactate dehydrogenase assay)
לאחר טרנספקציה עם sh-NC או sh-lncRNA למשך 48 h, נאסף מצע התרבית של תאי GC-1, והעליל הופק באמצעות סבב צנטריפוגה. בהתאם להוראות של ערכה לבדיקת לקטט דהידרוגנאז, ערבב בעדינות את העליל עם תמיסת העבודה לזיהוי והעבר אותו לפלטה בעלת 96 בארות. הפלטה דגרה בטמפרטורה של 25 °C בחושך למשך 30 min. הבליעה ב- 490 nm נמדדה באמצעות קורא מיקרו-פלטות, ושחרור הלקטט דהידרוגנאז חושב כדי להעריך את הנזק התאי.

5. צביעה ב-Calcein AM/propidium iodide
לאחר טרנספקציה עם sh-NC או sh-lncRNA למשך 48 h, נבחנה הישרדות תאי GC-1 באמצעות צביעה ב-Calcein AM/propidium iodide (PI). התאים נזרעו בלוחות של 12 באריים בריכוז של 5 × 104 cells/well וגודלו עד שהגיעו ל-60%–70% confluence. התאים נשטפו בעדינות עם phosphate-buffered saline, ולכל באר הוספו 500 µL של תמיסת צביעה Calcein AM/PI. התאים דגרו ב-37 °C בחשיכה למשך 30 min ונצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. תאים חיים ומתים נספרו באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, וחושב שיעור התאים השורדים.

6. ציטומטריית זרימה
תאי GC-1 נאספו באמצעות צנטריפוגציה ונשטפו בעדינות ב-phosphate-buffered saline. משקע התאים הושהה מחדש ב-500 µL של תמיסת קישור (binding buffer) בריכוז של 5 × 105 תאים/mL. לאחר מכן הוספו Annexin V-APC ו-PI בכמות של 5 µL כל אחד, והסוספנזיה עורבבה היטב והודגרה ב-25 °C בחשכה למשך 10 דקות. אפו פטוזיס נותח באמצעות ציטומטריית זרימה תוך שימוש באורכי גל של עירור/פליטה של 633/660 nm עבור APC ו-488/630 nm עבור PI. שיעור האפופטוזיס הוערך באמצעות תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה.

7. בדיקת פעילות Caspase-3
לאחר הטיפולים המצוינים, נאספו כ-1 × 106 תאי GC-1, נשטפו והושהו מחדש ב-phosphate-buffered saline. התאים ערבובו עם 100 µL של reagent II מתוך ערכת בדיקת פעילות caspase-3 ועברו ליזיס על קרח למשך 15 min. לאחר סבב צנטריפוגה, נאספו 50 µL מהסופרנאט של הליזיס ועורבבו עם 40 µL של reagent I ו-10 µL של reagent III. התערובת הודגרה ב-37 °C למשך 2 h. בליעיות ב-405 nm נמדדו באמצעות קורא מיקרו-פלייטים, ופעילות ה-caspase-3 הוערכה בהתאם להוראות הערכה.

8. בדיקת RNA pull-down
הגדילים sense ו-antisense של lncRNA NONMMUT031883.2 סונתזו בהתאם לרצף המתאים וסומנו בביוטין. תאים הולחו בבופר ליזיס לתאי אימונו-פרספיטציה על קרח למשך 30 min, והסופרנאט המכיל חלבונים נאסף על ידי צנטריפוגציה. חרוזי מגנט של Streptavidin נשטפו שלוש פעמים עם בופר קישור ל-RNA ודגרו בבופר קישור המכיל 1% bovine serum albumin למשך 30 min.

את החרו지를 שעברו טיפול מקדמי שילבו עם הגושים המסומנים בביוטין והדגירו אותם בטמפרטורה של 25 °C למשך 30 min. גושים שאינם קשורים הוסרו באמצעות הפרדה מגנטית. לאחר מכן הוסף העל-נוזל של ליזאט התאים, והתערובת הודגרה בטמפרטורה של 4 °C למשך 4 h ליצירת קומפלקסים של חרוז מגנטי-RNA-חלבון. את החרוזים המגנטיים שטפו שלוש פעמים עם בופר שטיפה כדי להסיר חלבונים שנקשרו באופן לא ספציפי. את בופר השטיפה הסירו באמצעות הפרדה מגנטית, והוסיפו בופר טעינת דגימות של 2× SDS. את הדגימות חיממו בטמפרטורה של 95 °C למשך 10 min, ואת העל-נוזל אספו באמצעות הפרדה מגנטית לצורך ניתוח Western blot בהמשך.

9. בניית מודל עכבר של תפקוד לקוי בספרומטוגנזה
לאחר 5 ימי אקלום, עכברים זכרים מסוג BALB/c, נקיים מפתוגנים ספציפיים, במשקל 22–25 g ובגיל 8 שבועות, קיבלו ציקלופספמיד (CP) בהזרקה תוך-פריטוניאל במינון של 50 mg/kg פעם ביום למשך 7 ימים, כדי לבסס מודל של תפקוד לקוי בספרומטוגנזה14,27. עכברים שבהם המודל הוקם בהצלחה חולקו באופן אקראי, באמצעות טבלת מספרים אקראיים, לקבוצות הבאות: CP, 200 mg/kg YC, 400 mg/kg YC, 800 mg/kg YC, 800 mg/kg YC + sh-NC, ו-800 mg/kg YC + sh-lncRNA, כאשר בכל קבוצה שש עכברים.

עכברים בקבוצות שטופלו ב-YC קיבלו את המנה התואמת של YC באמצעות הזנה פומית (oral gavage) פעם אחת ביום למשך 30 ימים13. עבור הקבוצות 800 mg/kg YC + sh-NC ו-800 mg/kg YC + sh-lncRNA, לאחר הקמה מוצלחת של המודל, העכברים הרדימו באמצעות שאיפה של 2% isoflurane. לאחר אישור שכל עכבר אינו מראה רפלקס נסיגה של הרגל ושקצב הנשימה יציב, גולח את אזור הניתוח וחומש ב-povidone-iodine. בתנאי סטריליות, בוצע חתך בקו האמצע הוונטרלי דרך העור ודופן הגוף, קדמית לאיברי המין. האשך נחשף על ידי מניפולציה זהירה של כרית השומן האפידידימלית, תוך הקפדה להימנע מפגיעה וסקולרית. באמצעות מיקרו-מניפולטור, הוצגו לראייה הרפרוניו-טובולי (seminiferous tubules), ו-1 µL של תרחיף אדנו-ויראלי (1 × 1010 TU/mL) הוזרקו לאט באמצעות מחט למיקרו-הזרקה28. המחט הושארה במקומה למשך 5 דקות לאחר ההזרקה לפני שנסיגה לאט, וההמוסטזיס הושג באמצעות מקלון צמר סטרילי. אותו הליך בוצע לאחר מכן באשך הנגדי. לאחר מכן נתפר החתך, והעכברים הושארו להתאושש על פד חימום לאחר הניתוח. עכברי ביקורת קיבלו נפח שווה של תמיסת סליין באמצעות הזנה והזרקה מדי יום.

10. הערכת פוריות
לאחר השלמת מתן התרופה, עכברים זכרים בכל קבוצה הועמדו להרבייה חופשית עם עכברי נקבה מסוג BALB/c ביחס של 1:2 למשך 7 ימים. נוכחות של פקק רחמי (vaginal plug) בנקבות נוטרה ותועדה מדי יום. לאחר אישור הצלחת ההרבייה, הזכרים הוסרו, והנקבות שוכנו באופן פרטני עד ללידה טבעית. תשע נקבות הרריות לכל קבוצה הושגו ונכללו בניתוח. גודל השגר הממוצע נרשם כדי להעריך את פוריות הזכרים בכל קבוצה.

בסיום תקופת הניסוי, העכברים הורגעו במוות (euthanized) באמצעות הזרקה תוך-peritoneal של pentobarbital sodium במינון של 100 mg/kg. שיטת ההרעגה במוות זו אושרה על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של Southeast University (מספר אישור 20230216022). האשכים והאפידידימיס (epididymides) הופרדו בזהירות, צולמו ונשקלו. מדדי האשכים והאפידידימיס חושבו כיחס שבין משקל האיבר למשקל הגוף. אפידידימיס אחד מכל עכבר נאסף, נחתך לחתיכות, הונח ב-1 mL של phosphate-buffered saline שחומם מראש (37 °C), ודגר למשך 20 דקות כדי לאפשר לזרעים לשחות החוצה29. תרחיף הזרעים ערבב בעדינות, ו-10 µL מתרחיף הזרעים הונחו על פלטת ספירת תאי דם שחוממה מראש. הזרעים נספרו ידנית תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 200×, והתוצאות בוטאו כ-106/L. בנוסף, אחוז תאי הזרע בעלי תנועתיות פרוגרסיבית ביחס למספר הכולל של תאי הזרע חושב כניידות הזרעים (sperm motility)13.

11. קביעת רמות הורמוני מין
דם נאסף מהווריד האורביטלי של עכברים בכל קבוצה והושאר בטמפרטורה של 25 °C למשך 30 דקות. סרום נאסף על ידי צנטריפוגציה ב-3,000 × g למשך 10 דקות30. רמות טסטוסטרון, הורמון לוטאיניזציה (LH) והורמון מעורר זקיקים (FSH) בסרום נמדדו באמצעות ערכות ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) המתאימות.

12. בדיקת יציבות RNA
תאי GC-1 נזרעו לפלטות תרבית בעלות 96 בארות, עברו טרנספקציה עם si-QKI-5 או si-NC, וגודלו למשך 48 h. לאחר מכן הוסף Actinomycin D בריכוז של 5 µg/mL, והתאים נאספו בנקודות הזמן 0, 3, 6 ו-9 h. RNA כולל בודד, ורמת הביטוי היחסית של lncRNA NONMMUT031883.2 נקבעה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) לאחר ביצוע שעתוק הפוך. רמת ה-RNA היחסית בכל נקודת זמן חושבה כך שרמת הביטוי ב-0 h היא 100%.

13. תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי
תאי GC-1 ורקמות אשכים של עכבר נשטפו עם phosphate-buffered saline ועברו ליסיס לבידוד RNA כולל. DNA משלים נוצר על ידי שעתוק הפוך באמצעות AMV reverse transcriptase. הגברה של תגובת שרשרת פולימראז בוצעה באמצעות מערכת real-time PCR וערכה של qPCR, כאשר ה-DNA המשלים שימש כתבנית להגברה. U6 שימש כרפרנס פנימי עבור lncRNA NONMMUT031883.2, ו-GAPDH שימש כרפרנס פנימי עבור QKI-5. ביטוי יחסי של הגן מטרה חושב באמצעות שיטת 2−ΔΔCt25. RNA בודד בנפרד גם מהfrakציות הציטופלזמיות והגרעיניות כדי לקבוע את המיקום התסובלולרי של lncRNA NONMMUT031883.2. רצפי הפריימרים מופיעים בטבלה 1.

GeneForward primer (5' to 3')Reverse primer (5' to 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

טבלה 1: רצפי פריימרים ששימשו לתגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי (RT-qPCR). רצפי הפריימרים הקדמיים והאחוריים מפורטים בכיוון 5′–3′ עבור lncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5, U6, ו-GAPDH.

14. צביעת המטוקסילן ואאוזין
רקמות אשכים ואפדידימיס של עכברים הושקעו ב-4% paraformaldehyde וקובעו ב-4 °C למשך 24 h. לאחר שטיפה ב-phosphate-buffered saline, הרקמות עברו דהידרציה בסדרה מדורגת של אתנול, נטמנו בפרפין ונחתכו לפרוסות בעובי 5 µm. הפרוסות חוממו ב-60 °C למשך 60 min ועברו הסרת שעווה ב-xylene למשך 30 min.

לאחר הידרציה באמצעות סדרת אתנול מדורגת, נצבעו החתכים בהמטוקסילין למשך 5 min, טופלו בתמיסת דיפרנציאציה של חומצה כלורית-אתנול למשך 10 s, נשטפו במי ברז כדי להשיג כחול (bluing), ונצבעו ב-1% eosin למשך 2 min. לאחר מכן, החתכים עברו דהידרציה ב-95% ethanol ובאתנול מוחלט, וטוהרו ב-xylene למשך 30 min. לאחר ייבוש באוויר, החתכים הועלו על זכוכית באמצעות דבק ניטרלי (neutral gum). שינויים מורפולוגיים באשכים ובאיפידידימיס נבחנו תחת מיקרוסקופ.

15. אימונופלואורסצנציה
חתכי פראפין של אשכים מעכבר הוסרו מהשעווה ועברו הידרציה באמצעות סדרת אתנול מדורגת, לאחר מכן בוצע שחזור אנטיגנים באמצעות מיקרוגל בבופר ציטראט ב-pH 6.0. לאחר קירור טבעי לטמפרטורת החדר, החתכים דגרו עם 0.3% Triton X-100 למשך 10 min. החתכים נחסמו עם 5% bovine serum albumin ב-25 °C למשך 60 min, נשטפו ב-phosphate-buffered saline, ודגרו למשך הלילה ב-4 °C עם נוגדן ראשוני נגד Ki67. למחרת, הוחל נוגדן immunoglobulin G משני המסומן בפלואורוךרום, והחתכים דגרו ב-37 °C בחשכה למשך 60 min. לאחר שטיפה ב-phosphate-buffered saline, החתכים נצבעו בצביעה נגדית עם DAPI למשך 10 min ונבחנו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. עוצמת הפלואורסצנציה נותחה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.

עבור צביעה אימונופלואורסצנטית של תאי GC-1, התאים נזרעו לתוך פלטות בעלות 12 בארות בריכוז של 1 × 105 תאים/בארת ודגרו למשך 24 h. התאים קובעו עם 4% paraformaldehyde למשך 30 min, עברו פרמיליזציה עם 0.3% Triton X-100 למשך 10 min, נחסמו עם 5% bovine serum albumin, ודגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדן ראשוני נגד QKI-5. שאר הפרוצדורה בוצעה כפי שתואר עבור חיתוכי רקמת האשכים.

16. צביעת TUNEL
חתכי פראפין של אשכים של עכבר הועברו לתהליך הסרת שעווה (dewaxing), הידרציה באמצעות סדרת אתנול מדורגת, והדגרה עם 0.1% Triton X-100 למשך 5 min להגברת חדירות ממב createNative התא. תמיסת עבודה של Proteinase K בריכוז 20 µg/mL ללא DNase הוחלה באופן אחיד על החתכים, אשר הודגרו לאחר מכן בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 min. תמיסת זיהוי TUNEL נוספה, והחתכים הודגרו בטמפרטורה של 37 °C בחשיכה למשך 90 min. לאחר הדגרה עם DAPI למשך 10 min, הוחל מדיום קיבוע למניעת דהייה (antifade mounting medium), ורקמת האשכים נבחנה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.

תאי GC-1 נזרעו בלוחות בעלי 12 בארות וקובעו באמצעות 4% paraformaldehyde למשך 30 min. לאחר חדירה (permeabilization) באמצעות 0.1% Triton X-100 למשך 5 min, הוחל על התאים תמיסת גילוי TUNEL, ולאחריה דגירה בחושך למשך 60 min. לאחר מכן, התאים נצבעו ב-DAPI למשך 10 min ונצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.

17. Western blotting
רקמות אשכים של עכברים ותאי GC-1 עברו ליזיס בבופר ליזיס של תאים לאימונופרספיטציה על קרח למשך 30 min והשתבשו באמצעות אולטרסוניקציה. לאחר צנטריפוגציה, נאסף העילאי המכיל חלבונים, וריכוז החלבון נקבע באמצעות ערכה לבדיקת חומצה ביקינכונינית. העילאי החלבוני עורבב עם בופר טעינה של SDS וחומם במים רותחים למשך 10 min. לאחר הפרדה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, הועברו החלבונים לממברנות פוליבינילידן פלואוריד ונחסמו עם 5% bovine serum albumin למשך 2 h31.

את הממברנות דגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד cleaved caspase-3 (1:500), Bcl-2 (1:1000), caspase-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), phosphorylated p38 (1:1000), או p38 (1:500). למחרת, הממברנות נשטפו ב-Tris-buffered saline המכיל Tween 20 ודגרו עם goat anti-rabbit immunoglobulin G בדילול של 1:10000 למשך 2 h ב-25 °C. תמיסת עבודה של enhanced chemiluminescence הוחלה על פני השטח של הממברנה, ופסו הלבון של החלבונים צולמו באמצעות מערכת להדמיית ג'לים. עוצמת הפסים נותחה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, וביטוי חלבון יחסי נורמל ל-GAPDH (1:3000).

נעשה שימוש ב-Cycloheximide בריכוז של 50 µg/mL כדי לעכב את סינתזת החלבונים. כדי לקבוע את זמן מחצית החיים של QKI-5, נאספו תאים בנקודות זמן של 0, 3, 6 ו-9 שעות, ולאחר מכן נקבעו רמות החלבון של QKI-5 באמצעות Western blotting25.

18. ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים נותחו סטטיסטית ושורטטו באמצעות תוכנות לניתוח סטטיסטי, גרפיקה וניתוח תמונות. מבחן Shapiro-Wilk שימש להערכת נורמליות הנתונים. נתונים ניסיוניים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. ניתוח שונות חד-כיווני (One-way ANOVA) שימש להערכת הבדלים בין הקבוצות. מבחן LSD-t שימש להשוואות זוגיות לאחר מכן (post hoc) כאשר השוניות היו הומוגניות, בעוד שמבחן Dunnett’s T3 שימש כאשר השוניות היו הטרוגניות. ערך של p < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

תוצאות

השתקת lncRNA NONMMUT031883.2 משרה אפופטוזה של ספירמטוגוניים
תאי GC-1 עברו טרנספקציה עם sh-lncRNA כדי להשתיק את ביטויו של lncRNA NONMMUT031883.2. בהשוואה לתאים שעברו טרנספקציה עם sh-NC, הרמה השעתוקית של lncRNA NONMMUT031883.2 פחתה באופן ניכר בעקבות טרנספקציה של sh-lncRNA, מה שאישר השתקה מוצלחת (איור 2A). בעקבות השתקת lncRNA NONMMUT031883.2, חיוניות תאי GC-1 פחתה באופן משמעותי (איור 2B), בעוד ששחרור LDH עלה באופן משמעותי, מה שמעיד על נזק תאי רב יותר (איור 2C). צביעת Calcein-AM/PI הראתה מספר מוגבר של תאי GC-1 חיוביים ל-PI ושיעור מופחת של תאים שורדים בקבוצת ה-sh-lncRNA (איור 2D, E). שיעור האפופטוזה של תאי GC-1 עלה באופן ניכר בעקבות השתקת lncRNA NONMMUT031883.2 (איור 2F, G). שיעור החיוביות ב-TUNEL היה גם הוא גבוה משמעותית בקבוצת ה-sh-lncRNA, מה שמעיד על הגברת האפופטוזה (איור 2H, I). בנוסף, השתקת lncRNA NONMMUT031883.2 העלתה באופן משמעותי את פעילות caspase-3 בתאי GC-1 (איור 2J). בקבוצת ה-sh-lncRNA, ביטוי Bax עלה באופן ניכר, ביטוי Bcl-2 פחת, והיחס בין cleaved caspase-3 ל-caspase-3 עלה באופן משמעותי (איור 2K, L). תוצאות אלו מעידות כי השתקת lncRNA NONMMUT031883.2 משרה אפופטוזה בתאי GC-1. כל הנתונים הכמותיים הושגו עם n = 6.

figure-results-1
איור 2: השתקה של lncRNA NONMMUT031883.2 משרה אפופטוזה של ספירמטוגוניה. (A) ניתוח של תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR) של ביטוי lncRNA NONMMUT031883.2 בתאי GC-1. (B) בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8) של חיוניות תאי GC-1 בעקבות השתקת lncRNA NONMMUT031883.2. (C) שחרור של לקטט דהידרוגנאז (LDH) מתאי GC-1 בעקבות השתקת lncRNA NONMMUT031883.2. (D, E) צביעת Calcein-AM/propidium iodide (PI) של הישרדות תאי GC-1 (20×; סרגל קנה מידה, 100 µm). (F, G) ניתוח פלוו-ציטומטרי של אפופטוזה בעקבות השתקת lncRNA NONMMUT031883.2. (H, I) ניתוח TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) של תאי GC-1 (40×; סרגל קנה מידה, 50 µm). (J) פעילות Caspase-3 בעקבות השתקת lncRNA NONMMUT031883.2. (K, L) ניתוח Western blot של ביטוי Bcl-2, Bax, caspase-3 ו-cleaved caspase-3 בעקבות טרנספקציית sh-lncRNA. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; n = 6. ***p < 0.001 לעומת sh-NC. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

ה-LncRNA NONMMUT031883.2 מקיים אינטראקציה עם QKI-5
האינטראקציה בין lncRNA NONMMUT031883.2 לבין QKI-5 נבדקה כדי להשכיח את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס אפופטוזיס של ספרמטוגוניה. לאחר הפרדה של הפракציות הגרעיניות והציטופלזמיות, ניתוח qRT-PCR הראה כי lncRNA NONMMUT031883.2 ממוקם בעיקר בגרעינים של תאי GC-1 (איור 3A). ניתוח אימונופלורסצנציה הראה שגם QKI-5 היה מרוכז בגרעין, מה שמספק בסיס מרחבי לאינטראקציה בין lncRNA NONMMUT031883.2 לבין QKI-5 (איור 3B). זמן המחצית של lncRNA NONMMUT031883.2 נמדד לאחר טיפול באקטינומיצין D כדי להעריך האם QKI-5 מווסת את יציבות ה-lncRNA. להשתקה של QKI-5 לא הייתה השפעה ניכרת על זמן המחצית של תמליל ה-lncRNA (איור 3C). בעקבות עיכוב של סינתזת חלבונים על ידי ציקלוהקסימיד, השתקה של lncRNA NONMMUT031883.2 לא שינתה את ביטוי חלבון QKI-5 (איור 3D, E). לאחר מכן, יעילות הלכידה של גשש antisense מסומן בביוטין המכוון ל-lncRNA NONMMUT031883.2 הוערכה באמצעות qRT-PCR. גשש ה-antisense העשיר ביעילות את ה-lncRNA המטרה ולכן שימש לבדיקת RNA pull-down העוקבת (איור 3F). RNA pull-down ואחריו Western blotting הראו אינטראקציה פיזית ספציפית בין lncRNA NONMMUT031883.2 לבין QKI-5 (איור 3G, H). תוצאות אלו מעידות כי lncRNA NONMMUT031883.2 ו-QKI-5 נמצאים יחד בגרעינים של תאי GC-1 ומקיימים אינטראקציה ספציפית. הנתונים הכמותיים של איור 3C ו-איור 3D, F הושגו עם n = 3, ושאר הנתונים הכמותיים הושגו עם n = 6.

figure-results-2
איור 3: LncRNA NONMMUT031883.2 מקשר עם QKI-5. (A) ניתוח qRT-PCR של ההפצה הגרעינית והציטופלזמית של lncRNA NONMMUT031883.2 בתאי GC-1. (B) ניתוח אימונופלורסצנציה של הלוקליזציה התת-תאית של QKI-5 בתאי GC-1 (40×; סרגל קנה מידה, 50 µm). (C) ניתוח qRT-PCR של זמן מחצית החיים של lncRNA NONMMUT031883.2 בעקבות טיפול באקטינומיצין D והשקתה (knockdown) של QKI-5 (n = 3). (D, E) ניתוח Western blot של ביטוי חלבון QKI-5 בעקבות טיפול בציקלוהקסימיד והשקתה (knockdown) של lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) תיקוף באמצעות qRT-PCR של יעילות ההעשרה של גש probe אנטי-סנס המסומן בביוטין המכוון ל-lncRNA NONMMUT031883.2. (G, H) ניתוח RNA pull-down ו-Western blot של האינטראקציה בין lncRNA NONMMUT031883.2 לבין QKI-5. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקנית; n = 6. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

השחלה של QKI-5 מעכבת אפופטוזיס של ספרמטוגוניה על ידי דיכוי נתיב p38 MAPK
נבחן תפקידם של QKI-5 ונתיב ה-p38 MAPK במורד בתוך אפופטוזיס של ספרמטוגוניה. בעקבות טרנספקציה של si-QKI-5, רמות חלבון QKI-5 הופחתו באופן משמעותי בתאי GC-1, מה שאישר השחלה מוצלחת (איור 4A, B). השחלה של LncRNA NONMMUT031883.2 הגבירה באופן משמעותי את היחס p-p38/p38, בעוד שהשחלה סימולטנית של QKI-5 הפחיתה יחס זה, מה שמעיד על עיכוב של הפעלת נתיב p38 MAPK (איור 4C, D). השחלה של QKI-5 הקלה על הנזק לתאי GC-1 שנגרם כתוצאה מהשחלת lncRNA NONMMUT031883.2, בעוד שטיפול ב-etoposide, המעודד אפופטוזיס, הפחית באופן משמעותי את חיוניות התאים (איור 4E). השחלה של QKI-5 הפחיתה באופן משמעותי את שיעור האפופטוזיס של תאי GC-1, בעוד שטיפול ב-etoposide הגביר את האפופטוזיס באופן ניכר (איור 4F, G). טרנספקציה של si-QKI-5 הפחיתה באופן משמעותי גם את פעילות caspase-3, בעוד שטיפול ב-etoposide הגביר את פעילות caspase-3 (איור 4H). השחלה של QKI-5 הפחיתה את ביטוי Bax, הגבירה את ביטוי Bcl-2 והפחיתה באופן משמעותי את היחס cleaved caspase-3/caspase-3, בעוד שטיפול ב-etoposide הפך דפוסי ביטוי אלו (איור 4I, J). תוצאות אלו מעידות כי השחלה של QKI-5 מדכאת אפופטוזיס בספרמטוגוניה של GC-1 על ידי עיכוב נתיב p38 MAPK. כל הנתונים הכמותיים התקבלו עבור n = 6.

figure-results-3
איור 4: השקת QKI-5 מעכבת אפופטוזיס של ספרמטוגוניה על ידי דיכוי מסלול p38 MAPK. (A, B) ניתוח Western blot של ביטוי QKI-5 בתאי GC-1 לאחר טרנספקציה עם si-NC או si-QKI-5. (C, D) ניתוח Western blot של ביטוי p38 מזופספוריל (p-p38) ו-p38 כולל. (E) ניתוח CCK-8 של חיוניות תאי GC-1 בקבוצות הטיפול השונות. (F, G) ניתוח פלוו-ציטומטרי של אפופטוזיס לאחר טיפול ב-etoposide. (H) פעילות Caspase-3 בקבוצות הטיפול השונות. (I, J) ניתוח Western blot של ביטוי Bax, Bcl-2, caspase-3 ו-cleaved caspase-3 בתאי GC-1. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; n = 6. ***p < 0.001 לעומת si-NC או sh-NC; ###p < 0.001 לעומת sh-lncRNA; &&&p < 0.001 לעומת sh-lncRNA + si-QKI-5. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.

YC מעכב אפופטוזיס של ספרמטוגוניה via מסלול ה-lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
בעקבות טיפול של תאי GC-1 בסרום המכיל YC למשך 6, 12 ו-24 שעות, חיוניות התאים עלתה בהדרגה עם עליית ריכוזי ה-YC וזמני חשיפה ממושכים יותר. לפיכך, ריכוזים אלו נבחרו לניסויים הבאים, עם משך טיפול של 24 שעות (איור 5A). טיפול ב-YC למשך 24 שעות העלה באופן ניכר את רמת השעתוק של lncRNA NONMMUT031883.2 בתאי GC-1 (איור 5B) והגביר את יכולת הקישור שלו ל-QKI-5 (איור 5C, D). בעקבות הטיפול ב-YC, הביטוי של QKI-5 ויחס ה-p-p38/p38 פחתו באופן ניכר בתאי GC-1, מה שמרמז על עיכוב של מסלול ה-p38 MAPK (איור 5E, F). טיפול ב-YC הפחית באופן ניכר גם את שיעור האפופטוזיס (איור 5G, H), הפחית את פעילות ה-caspase-3 (איור 5I), העלה את הביטוי של Bcl-2, והפחית את הביטוי של Bax ואת יחס ה-cleaved caspase-3/caspase-3 (איור 5J, K).

כדי להעריך פנימיות נוספת של המסלול, תאי GC-1 עברו טרנספקציה עם OE-NC או OE-QKI-5. ביטוי חלבון QKI-5 עלה באופן משמעותי בתאים שעברו טרנספקציה של OE-QKI-5, מה שאישר ביטוי יתר מוצלח (איור 5L, M). נוקדאון של lncRNA NONMMUT031883.2 הפחית באופן משמעותי את חיוניות התאים, בעוד שטיפול ב-YC הפך אפקט זה. ביטוי יתר של QKI-5 החליש את האפקט הציטופרוטקטיבי של YC (איור 5N). טיפול ב-YC הפחית גם את האפופטוזה שהושרה על ידי נוקדאון של lncRNA NONMMUT031883.2 (איור 5O, P), הפחית את פעילות caspase-3 (איור 5Q), הפחית את ביטוי Bax, הגביר את ביטוי Bcl-2, והפחית את היחס בין cleaved caspase-3 ל-caspase-3 (איור 5R, S). לעומת זאת, ביטוי יתר של QKI-5 החליש את האפקטים האנטי-אפופטוטיים של YC. תוצאות אלו מעידות על כך ש-YC מעלה את ביטוי lncRNA NONMMUT031883.2 ומקדם את קישורו ל-QKI-5, ובכך מעכב את מסלול p38 MAPK ומדכא אפופטוזה בתאי GC-1. כל הנתונים הכמותיים התקבלו עם n = 6.

figure-results-4
איור 5YC מעכב אפופטוזיס של ספרמטוגוניות באמצעות מסלול ה-lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) ניתוח CCK-8 של חיוניות תאי GC-1 לאחר חשיפה לסרום המכיל קפסולות Yangjing (YC) למשך 6, 12 ו-24 שעות. (ב) ניתוח qRT-PCR של ביטוי lncRNA NONMMUT031883.2 בתאי GC-1 לאחר 24 שעות של טיפול ב-YC. (C, D) ניתוח RNA pull-down של קישור ה-lncRNA NONMMUT031883.2 ל-QKI-5 בעקבות טיפול ב-YC. (E, F) ניתוח Western blot של ביטוי QKI-5, p-p38 ו-p38 לאחר טיפול ב-YC. (G, H) ניתוח פלוו-ציטומטרי של אפו פטוזיס בתאי GC-1 לאחר טיפול ב-YC. (I) פעילות קספאז-3 (Caspase-3) לאחר טיפול ב-YC. (J, K) ניתוח Western blot של ביטוי Bcl-2, Bax, caspase-3 ו-cleaved caspase-3 בעקבות טיפול ב-YC. (L, M) ניתוח Western blot של ביטוי QKI-5 לאחר טרנספקציה עם OE-NC או OE-QKI-5. (N) ניתוח CCK-8 של חיות תאי GC-1. (O, P) ניתוח באמצעות פלואו Cytometry של אפופטוזה בתאי GC-1 בעקבות ביטוי יתר של QKI-5. (Q) פעילות קספאז-3 (Caspase-3) בעקבות ביטוי יתר של QKI-5. (R, S) ניתוח Western blot של ביטוי Bax, Bcl-2, caspase-3 ו-cleaved caspase-3 לאחר ביטוי יתר של QKI-5. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; n = 6. ***p < 0.001 לעומת ביקורת; ###p < 0.001 לעומת sh-lncRNA; &&&p < 0.001 לעומת sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

YC משפר תפקוד ספרמטוגנזי פגוע כתוצאה מ-CP בעכברים
השפעותיהן המגנות של YC נבחנו בעכברים עם הפרעה בספרומטוגנזה. האשכים והאפידידימיס של העכברים בקבוצת ה-CP הראו ניוון בולט, נפח מופחת ומראה עמום. בעקבות טיפול במינונים שונים של YC, המורפולוגיה, המלאות והצבע של איברי הרבייה השתפרו בהדרגה (איור 6A). המשקלים היחסיים של האשכים והדרכוֹם (epididymides) עלו באופן מובהק, כאשר ההשפעה הגדולה ביותר נצפתה בקבוצת ה-800 מ"ג/ק"ג YC (איור 6B, C).

שיעור עיוות הזרע עלה באופן משמעותי בקבוצת ה-CP, כאשר פגמים שכיחים כללו עיוות של הראש, התכרבללות של הזנב ונזק מבני. מספר הזרע והניידות היו גם הם מופחתים באופן ניכר. לאחר טיפול ב-YC, מורפולוגיית הזרע השתפרה (איור 6D), מספר תאי הזרה עלה (איור 6E), וניידות הזרע השתפרה באופן משמעותי (איור 6F). ניסויי הזיווג הראו כי הפוריות וגודל השגרה פחתו באופן ניכר בקבוצת ה-CP, בעוד שטיפול ב-YC שיפר את הפוריות (איור 6G). רמות טסטוסטרון, הורמון מעורר זקיקים (FSH) והורמון לוטאיזציה (LH) בסרום היו גם הן נמוכות באופן משמעותי בקבוצת ה-CP ועלו בעקבות טיפול ב-YC (איור 6H-J). ממצאים אלו מעידים כי YC משפר את הניוון של איברי הרבייה, את איכות הזרע, את הפוריות ואת הפרשת הורמוני המין בעכברים עם שיבוש בספרומטוגנזה. הנתונים הכמותיים של איור 6G התקבלו עם n = 9, ושאר הנתונים הכמותיים התקבלו עם n = 6.

figure-results-5
איור 6: YC משפר תפקוד ספרמטוגני פגוע עקב CP בעכברים. (A-C) מורפולוגיה של איברי הרבייה בקבוצת הביקורת, קבוצת ה-cyclophosphamide (CP), וקבוצת הטיפול ב-YC (A), מדד האשכים (B), ומדדB האפידידימיס (C). (D-F) מורפולוגיית זרע (D) (40×; סרגל קנה מידה, 50 µm), צפיפות זרע (E), וניידות זרע (F). (G) פוריות זכרים שנבדקה בניסויי הזגיה (n = 9). (H-J) רמות של הורמון מעורר זקיקים (FSH), טסטוסטרון והורמון לוטאיניזציה (LH) בנסיוב שנמדדו באמצעות ערכות ELISA. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; n = 6. ***p < 0.001 לעומת ביקורת; #p < 0.05, ##p < 0.01, ו-###p < 0.001 לעומת CP. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

YC משפר נזק היסטופתולוגי באשכים בעכברים עם הפרעה בספרומטוגנזה
השפעה רפואית של YC על נזק לרקמת האשכים הוערכה באמצעות צביעה היסטולוגית. צביעת המטוקסילין ואוזין הראתה מבנה רקמה שלם, שכבות תאיות מובחנות ומספר תאים הולם בקבוצת הביקורת. לעומת זאת, קבוצת ה-CP הראתה ניוון בולט של השפנפנים (seminiferous tubules) וחלוף מבני, הפחתה במספר התאים וקריסה של חללB האפידידימיס. בעקבות טיפול ב-YC, הנזק לאשכים ולאפידידימיס פחת, מבנה השפנפנים שוקם בהדרגה, והתאים הפכו למסודרים יותר ומספרם גדל (איור 7A, B).

הפרופורציה של תאים חיוביים ל-TUNEL ברקמת האשכים עלתה באופן משמעותי בקבוצת ה-CP וירדה באופן משמעותי לאחר טיפול ב-YC (איור 7C, D). הביטוי של Bax ויחס cleaved caspase-3/caspase-3 עלו בולטם בקבוצת ה-CP, בעוד שהביטוי של Bcl-2 פחת. טיפול ב-YC הפך דפוסי ביטוי אלו (איור 7E, F). ניתוח אימונופלואורסצנציה הראה כי עוצמת הפלואורסצנציה של Ki67 פחתה באופן ניכר בקבוצת ה-CP ועלתה באופן משמעותי לאחר טיפול ב-YC, מה שמרמז על השקום של פרוליפרציית תאי ספרומטוגנזה (איור 7G, H). ממצאים אלו מצביעים על כך ש-YC מפחית נזק היסטופתולוגי הנגרם על ידי CP באשכים ובאפידידימיס, מעכב אפופטוזיס מופרז ומעודד פרוליפרציה של תאי ספרומטוגנזה. כל הנתונים הכמותיים התקבלו עם n = 6.

figure-results-6
איור 7YC משפר נזק היסטופתולוגי המושרה על ידי CP ברקמת אשחקים של עכברים. (A, B) צביעת המטוקסילן ואאוזין (HE) של האשכים (א) והאפידידימיסים (ב) לאחר טיפול ב-YC (20×; סרגל קנה מידה, 100 µm). (C, D) ניתוח TUNEL של אפופטוזה ברקמת אשכים של עכבר (40×סרגל קנה מידה, 50 µm). (E, F) ניתוח Western blot של ביטוי Bax, Bcl-2, caspase-3 ו-cleaved caspase-3 ברקמת אשכים לאחר טיפול ב-YC. (G, H) ניתוח אימונופלואורסצנציה של ביטוי Ki67 ברקמת אשכים של עכבר (40×; סרגל קנה מידה, 50 µm). הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; n = 6. ***p < 0.001 לעומת ביקורת; p < 0.001 לעומת CP. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

YC משפר תפקוד ספרמטוגני ונזק פתולוגי באשכים בעכברים באמצעות מסלול ה-lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
המעורבות של מסלול ה-lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK בהשפעות של YC נבחנה לעומק. ביטוי ה-lncRNA NONMMUT031883.2 פחת באופן משמעותי ברקמת אשכים של עכברים מקבוצת ה-CP, בעוד שביטוי QKI-5 ויחס ה-p-p38/p38 עלו באופן ניכר (איור 8A-D). לאחר טיפול ב-YC, ביטוי ה-lncRNA NONMMUT031883.2 עלה, בעוד שביטוי QKI-5 ויחס ה-p-p38/p38 ירדו.

כדי להעריך באופן מעמיק יותר את ספציפיות המסלול, ביצעו knockdown של lncRNA NONMMUT031883.2 בעכברים באמצעות sh-lncRNA. רמת הביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2 פחתה באופן משמעותי, מה שאישר את הצלחת ה-knockdown (איור 8E). לאחר ה-knockdown של lncRNA NONMMUT031883.2, רמת ה-QKI-5 ברקמת האשכים לא השתנתה באופן משמעותי, אך רמת ה-p-p38/p38 עלתה באופן משמעותי (איור 8F, G). טיפול ב-Sh-lncRNA החליש את ההשפעות של 800 mg/kg YC, מה שהוביל לביטוי מופחת של lncRNA NONMMUT031883.2 ברקמת האשכים (איור 8H) ולעלייה ברמות p-p38/p38 (איור 8I, J). טיפול ב-YC העלה באופן משמעותי את מספר הפרספרמיה ואת ניידותן לאחר השראת CP, בעוד שה-knockdown של lncRNA NONMMUT031883.2 החליש השפעות אלו (איור 8K, L). טיפול ב-YC העלה גם את רמות הטסטוסטרון, ההורמון המעורר זקיקים (FSH) והורמון הלוטאיזין (LH) בקבוצת ה-CP, בעוד שה-knockdown של lncRNA החליש השפעות אלו (איור 8M-O).

צביעת המטוקסילן ואאוזין הראתה כי YC שיפר את הנזק לאשכים שנוצר כתוצאה מ-CP, כולל ניוון של הצינוריות המוסיפיות וחוסר סדר בסידור תאי הספירמטוגנזה. השתקת lncRNA NONMMUT031883.2 החלישה השפעות מגינות אלו (איור 8P). בעקבות טיפול ב-YC, הביטוי של Bax ויחס ה-cleaved caspase-3/caspase-3 פחתו, בעוד שהביטוי של Bcl-2 עלה. השתקת lncRNA NONMMUT031883.2 הפכה את ההשפעות הללו על חלבונים הקשורים לאפופטוזיס (איור 8Q, R). ממצאים אלו מעידים כי YC משפר את איכות הזרע ומפחית את הנזק לרקמת האשכים לאחר השראת CP על ידי ויסות חיובי (upregulation) של lncRNA NONMMUT031883.2, ויסות שלילי (downregulation) של QKI-5 ועכבה של נתיב ה-p38 MAPK. כל הנתונים הכמותיים התקבלו עם n = 6.

figure-results-7
איור 8: YC משפר את ספרמטוגנזה ומפחית נזק היסטופתולוגי באשכים באמצעות מסלול lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) ניתוח qRT-PCR של ביטוי lncRNA NONMMUT031883.2 ברקמת אשכים של עכברים. (B-D) ניתוח Western blot של ביטוי QKI-5, p-p38, ו-p38 ברקמת אשכים של עכברים לאחר טיפול ב-YC. (E) תיקוף qRT-PCR של knockdown של lncRNA NONMMUT031883.2 ברקמת אשכים של עכברים לאחר מתן sh-lncRNA. (F, G) ניתוח Western blot של רמות QKI-5 ו-p-p38/p38 ברקמת האשכים של העכברים לאחר knockdown של lncRNA NONMMUT031883.2. (H) ניתוח qRT-PCR של ביטוי lncRNA NONMMUT031883.2 ברקמת אשכים של עכברים לאחר טיפול ב-YC ומתן sh-lncRNA. (I, J) ניתוח Western blot של ביטוי p-p38 ו-p38 ברקמת אשכים של עכברים. (K, L) ספירת זרעים (K) וניידות זרעים (L) בקבוצות הטיפול השונות. (M-O) רמות FSH, טסטוסטרון ו-LH בנסיב נמדדו באמצעות ערכות enzyme-linked immunosorbent assay. (P) צביעת HE של רקמת אשכים בעכברים שטופלו ב-CP (20×; סרגל קנה מידה, 100 µm). (Q, R) ניתוח Western blot של ביטוי Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3, ו-caspase-3 ברקמת אשכים של עכברים. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; n = 6. ***p < 0.001 לעומת ביקורת; p < 0.001 לעומת CP; p < 0.001 לעומת 800 mg/kg YC + sh-NC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

זמינות נתונים:
הנתונים הגולמיים התומכים בממצאי מחקר זה מסופקים כ Supplementary File 1.

קובץ משלים 1: נתונים מקוריים. קובץ Excel זה מכיל את הנתונים המספריים הגולמיים העומדים בבסיס האנליזות הכמותיות המוצגות בדמויות 2–8. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

ליקוי תפקוד ספרמטוגני נרכש המושרה על ידי כימותרפיה הוא גורם חשוב לאובדן פוריות זכרי32,33,34. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הספציפיים עדיין אינם מובנים במלואם. ממצאי מחקר זה מדגימים כי קפסולת Yangjing (YC) משפרת בצורה תלוית-מינון הפרעות הורמונליות מיניות, נזק היסטופתולוגי לאשכים ופגיעה בפוריות בעכברים זכרים שהושרה על ידי ציקלופוספמיד (CP). שיפורים אלו היו קשורים לעלייה בביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2 ולעיכוב של מסלול ה-QKI-5/p38 MAPK, מה שמרמז כי YC עשוי לפעול דרך ציר זה כדי להפחית אפופטוזה לא תקינה של ספרמטוגוניה.

הרעילות הרבייתית של CP תועדה באופן נרחב. המטבוליט שלו, אקרולאין, עלול להצטבר ברקמת האשכים ולהשראות אפופטוזה של תאי נבט באמצעות עקה חמצונית, נזק ל-DNA ומסלולים אחרים. ספרמטוגוניה, כתאי המוצא של הספרמטוגנזה, רגישים במיוחד להשפעות הציטוטוקסיות של CP35,36. Cao et al. מצאו כי סיגנל נקודת הבקרה של נזקי DNA היה מועשר משמעותית ברקמת אשכים של חולים עם אזוספירמיה לאחר כימותרפיה ב-CP, בעוד שגנים הקשורים להתפתחות זרע הראו ביטוי מופחת באופן משמעותי והשלמות המבנית של הרנבולים ( seminiferous tubules) הופרה37. Bcl-2 הוא חלבון אנטי-אפופטוטי הפועל על ידי שמירה על שלמות ממב ratification המיטוכונדריה38. Bax הוא חלבון פרו-אפופטוטי, ועלייה בביטויו עשויה לקדם שחרור של cytochrome c מהמיטוכונדריה לציטופלזמה, להפעיל את קסקדת הקספאזים ולהשריא אפופטוזה39,40. Saleh et al. הדגימו כי חשיפה ל-CP גרמה לניוון של הרנבולים ולבצקת בינאיית בעכברים, בליווי הפחתה בביטוי של Bcl-2 ועלייה בביטוי של Bax, מה שהוביל בסופו של דבר להפחתה בספירת הזרעים ובניידותם41. לפיכך, עיכוב של אפופטוזה מופרזת של ספרמטוגוניה המושרית על ידי CP עשוי להוות מטרה חשובה להגנה על התפקוד הרבייתי לאחר כימותרפיה. במחקר הנוכחי, התערבות באמצעות YC הפחיתה באופן תלוי-מינון חריגויות בהפרשת הורמוני מין בסרום שהושרו על ידי CP, תיקנה נזקים ברנבולים ושיפרה את ניידות הזרעים ואת הפוריות הזכרית. YC הגביר גם את ביטוי Bcl-2 והפחית את ביטוי Bax, את היחס בין cleaved caspase-3 ל-caspase-3 ואת מספר התאים החיוביים ל-TUNEL ברקמת האשכים. In vitro, סרום המכיל YC הפחית באופן ניכר את האפופטוזה של תאי GC-1 והגביר את חיוניות התאים, מה שתומך עוד יותר בהשפעה מעכבת על אפופטוזה של ספרמטוגוניה.

RNA ארוכים שאינם מקודדים (lncRNAs) ממלאים תפקידים רגולטוריים חשובים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כולל ספרמטוגנזה ואפופטוזיס של תאי נבט42,43. ביטוי חריג של lncRNA עלול לפגוע בתפקוד הספרמטוגני של האשכים דרך ויסות של עקה חמצונית ומסלולי אפופטוזיס, המהווים מנגנון מולקולרי חשוב של אי-פוריות גברית44. Wang et al. מצאו כי lncRNA DNM3OS מווסת את ציר miR-214-5p/E2F2, מה שמוביל להפחתה בפעילות תאי הספרמטוגוניה ולהגברת האפופטוזיס וההזדקנות התאית, ובסופו של דבר תורם לאזווספירמיה לא-חסימתית45. מחקרים קודמים הראו גם כי השתקה של lncRNA NONMMUT074098.2 בספרמטוגוניה משרה אפופטוזיס25. מחקרים אלו מעידים כי lncRNAs הם רגולטורים חשובים של אפופטוזיס של ספרמטוגוניה ושל ספרמטוגנזה. במחקר הנוכחי, השתקה של lncRNA NONMMUT031883.2 השרתה אפופטוזיס של ספרמטוגוניה. ביטויו הופחת באופן משמעותי ברקמת אשכים של עכברים בעקבות השראת CP, בעוד שהתערבות YC שיקמה חלקית את ביטויו. בנוסף, התערבות YC הקלילה את האפופטוזיס החריג של הספרמטוגוניה שהשרירה השתקת lncRNA NONMMUT031883.2, מה שמרמז כי ההשפעה המגינה של YC עשויה להיות קשורה לוויסות של lncRNA זה.

QKI-5 הוא חלבון קושר RNA השייך למשפחת STAR, והוא משתתף במספר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי ויסות השחור (splicing), היציבות והיעילות התרגומית של mRNA מטרה.46,47מחקרים קודמים קבעו כי QKI-5 הוא רגולטור חשוב במערכת הרבייה, וכי ביטוי חריג שלו עשוי לעודד אפו פטוזיס של תאי נבט ולפגוע בתפקוד הזרע באמצעות הפעלת מסלול ה-p38 MAPK במורד הזרם.25ליתיום ואחרים. מצאו כי עיכוב של הפעלת מסלול p38 MAPK הפחית את הנזק לרקמת האשכים שנגרם על ידי CP ושיקם את תפקודי מחסום הדם-אשכים בחולדות48ממצאים אלו מרמזים כי ציר ה-QKI-5/p38 MAPK עשוי להיות מסלול חשוב המווסת אפופטוזה של ספירמטוגוניה ויעד פוטנציאלי לטיפול בדיספונקציה של הספירמטוגנזה. במחקר הנוכחי, ביטוי QKI-5 ופספורילציה של p38 עלו באופן משמעותי ברקמת אשכים של עכברים בעקבות השראת CP, בעוד שהתערבות באמצעות YC הפחיתה את ביטוי QKI-5 ואת הפעלת מסלול p38 MAPK. LncRNA NONMMUT031883.2 נקשר ישירות ל-QKI-5, בעוד שביטוי QKI-5 לא השפיע על היציבות של ה-lncRNA, מה שמרמז כי lncRNA NONMMUT031883.2 עשוי לווסת את תפקוד QKI-5 באמצעות אינטראקציה ישירה. השתקת (knockdown) QKI-5 הקלו בנזק לתאי GC-1 שנגרם מהשתקת lncRNA NONMMUT031883.2, בעוד שביטוי יתר (overexpression) של QKI-5 הפחית את ההשפעות המגנות של YC על תאי GC-1. וכהל. דיווחו כי lncRNA NONMMUT074098.2 מווסת אפוֹפְּטוֹזָה של תאי נבט על ידי קישור ל-QKI-525הממצאים הנוכחיים מראים כי lncRNA NONMMUT031883.2 נקשר גם הוא ל-QKI-5 ומעורב בבקרה על אפופטוזה של ספרמטוגוניה. יחד, נתונים אלו מרמזים כי YC עשוי להעלות את הביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2, לעכב את מסלול ה-QKI-5/p38 MAPK, להפחית אפופטוזה חריגה של ספרמטוגוניה, ולהקל על תפקוד ספרמטוגני לקוי המושרה על ידי CP. עם זאת, יש לציין כי YC הוא פורמולציה צמחית רב-מרכיבית שסביר להניח כי פועלת על מספר מטרות. לא ניתן לשלול מנגנונים אחרים, כגון השפעות נוגדות חמצון ישירות של מרכיבי YC, ויסות של מסלולי איתות אחרים, או בקרה אפיגנטית שאינה תלויה בציר lncRNA-QKI-5, אשר עשויים לתרום להשפעות המגנות שנצפו.

יש להכיר במספר מגבלות. המחקר נערך רק במודל עכברים ובקו התאים GC-1, והוא היה חסר תיקוף באמצעות דגימות קליניות מחוליים עם אי-פוריות. ספרמטוגנזה היא תהליך מורכב, ומחזור הספרמטוגנזה המלא של עכברים נמשך כ-35 ימים49,50. משטר ה-YC למשך 30 ימים שנעשה בו שימוש במחקר זה לא כיסה מחזור ספרמטוגנזה מלא. לפיכך, נדרשים מחקרים עתידיים שיעמיקו בשימוש בפרוטוקולי התערבות של ≥35 ימים כדי להעריך באופן שיטתי את ההשפעות הטיפוליות של YC לאורך מחזור ספרמטוגנזה שלם. בנוסף, האירועים המולקולריים המדויקים בעקבות קישור של lncRNA NONMMUT031883.2 ל-QKI-5, כגון שינויים בפעילות השחור (splicing) של QKI-5 ובמיקומו התת-תאי, וכן הזיהוי והבקרה של מטרות שחור במורד הזרם, טרם נחקרו. יתרה מכך, למרות שטיפול ב-YC העלה את הביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2, גורמי השעתוק שמעלה ומנגנוני האפיגנטיקה טרם הובהרו. נדרשים מחקרים עתידיים שישלבו ניתוח פרומוטור ובדיקות שיקוע אימונו-חלבון של כרומטין (chromatin immunoprecipitation assays) כדי להבהיר את הבסיס המולקולרי של ביטוי lncRNA NONMMUT031883.2 המושרה על ידי YC. מעבר לכך, מחקרים עתידיים צריכים להעריך את השפעות ה-YC בחולים עם אי-פוריות גברית הקשורה לכימותרפיה, ולבחון את הביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2 ברקמת אשכים או בזרע כדי לקבוע את ערכו הקליני הפוטנציאלי כסמן אבחנתי או טיפולי.

לסיכום, YC מעלה את הביטוי של lncRNA NONMMUT031883.2 ומעכב את הפעלת מסלול ה-QKI-5/p38 MAPK, ובכך מפחית אפופטוזה של ספרמטוגוניה ונזק לאשכים, ומקל על שיבוש בספרומטוגנזה בעכברים. ממצאים אלו מבהירים את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס ההשפעות המגנות של YC מפני שיבוש בספרומטוגנזה, ומרחיבים את ההבנה הנוכחית לגבי תפקידיהם של lncRNA NONMMUT031883.2 ומסלול ה-QKI-5/p38 MAPK בויסות הספרומטוגנזה. LncRNA NONMMUT031883.2 ו-QKI-5 עשויים להוות מטרות טיפוליות פוטנציאליות לשיבוש בספרומטוגנזה גברית.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים כספיים או בלתי כספיים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (מענק מספר 82374257), הסבב הרביעי של תוכנית הכשרת כישרונות אקדמיים מובילים של בית החולים הפרובינציאלי לרפואה סינית של ג'יאנגסו (מענק מספר k2026yrc74), ופרויקטים של מחקר מדעי ברפואה סינית מסורתית ובשילוב של רפואה סינית מסורתית ומערבית של פרובינציית ג'יאנגסו (מענק מספר CYTF2026019).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אקטינומיצין DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559מעכב שעתוק המשמש לבדיקות יציבות RNA
טרנסקריפטאזה הפוכה של AMVTakara, טוקיו, יפן2621אנזים לסנתזה של DNA משלים
ערכה לזיהוי Annexin V-APC/PIBioLab Technology, בייג'ינג, סיןKFS191ערכה לניתוח פלוו-ציטומטרי של אפופטוזיס
תוסף הרכבה למניעת דהייה (Antifade mounting medium)MedChemExpress, מונמות ג'נקשן, ניו ג'רזי, ארה"בHY-K1042תוכה להרכבה לשימור פלואורסצנציה
נוגדן ראשוני ל-BaxAffinity Biosciences, OH, USAAF0120נוגדן ראשוני לזיהוי Bax
ערכת BCAמקלין, שנגחאי, סיןB917925ערכה לקביעת ריכוז חלבון
נוגדן ראשוני ל-Bcl-2Affinity Biosciences, OH, USAAF0769נוגדן ראשוני לזיהוי של Bcl-2
אלבומין משרת בקרBioLab Technology, בייג'ינג, סיןBTN131070ריאגנט חסימה
ערכה לזיהוי Calcein/PIBeyotime, שנחאי, סיןC2015Mערכה לצביעת תאים חיים/מתים
ערכה לבדיקת פעילות Caspase-3BioLab Technology, בייג'ינג, סיןQN2866ערכה למדידת פעילות caspase-3
נוגדן ראשוני ל-Caspase-3Abcam, MA, USAab184787נוגדן ראשוני לזיהוי caspase-3
ריאגנט CCK-8MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301ריאגנט להערכת חיוניות תאים
נוגדן ראשוני ל-cleaved caspase-3Abcam, MA, USAab32042נוגדן ראשוני לזיהוי של caspase-3 מולחח (cleaved caspase-3)
ציקלוהקסימידמקליין, שנגחאי, סיןH823111מעכב סינתזת חלבונים המשמש לבדיקות יציבות חלבונים
ציקלופוספמידMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420משמש להשראת תפקוד לקוי של הספירמטוגנזה
ריאגנט DAPIBeyotime, שנגחאי, סיןC1006צביעה נגדית של הגרעין
מצע DMEMWuhan Sunncell Biotechnology, הוביי, סיןSNLM-302מצע תרבית תאים לתאי GC-1
תמיסת עבודה ל-ECLSolarbio, בייג'ינג, סיןSW2030מצע כימילומנסנטי לזיהוי פסי חלבון
אטופוסיד (Etoposide)MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629חומר מעורר אפופטוזה
ציטומטר זורםBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburמכשיר לניתוח אפופטוזיס
תוכנת FlowJoBD Biosciences, CA, USAגרסה 10.8תוכנה לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה
מיקרוסקופ פלואורסצנציהLeica, היידלברג, גרמניהDM3000מכשיר לדימות פלואורסצנציה
נוגדן משני מסוג IgG מסומן בפלואורסצנציהServicebio, ווהאן, סיןGB22303נוגדן משני לזיהוי באמצעות אימונופלורסצנציה
ערכה לבדיקת ELISA להורמון מעורר זקיקים (Follicle-stimulating hormone)Huamei Biotech, ווהאן, סיןCSB-E06871mערכה למדידת הורמון מעורר זקיקים (FSH) בסרום
נוגדן ראשוני ל-GAPDHAffinity Biosciences, OH, USAT0004נוגדן בקרת טעינה עבור Western blotting
תאי GC-1Wuhan Sunncell Biotechnology, הוביי, סיןSNL-302קו תאים של ספרמטוגוניה של עכבר
מערכת לדימות ג'לJinpeng Analysis Instrument, שנגחאי, סיןJP-2880מערכת דימות להדמיה של גלים ובלוטים
מערכת לדימוי ג'ליםInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500מערכת דימוי כימילומינצנציה עבור Western blots
נוגדן עיזים נגד IgG של ארנבServicebio, ווהאן, סיןGB23303נוגדן משני עבור Western blotting
תמיסת המטוקסילןBioLab Technology, בייג'ינג, סיןYT165צביעה גרעינית לניתוח היסטולוגי
תמיסת בידוד של חומצה כלורידית ואתנולBeyotime, שנגחאי, סיןC0163Sריאגנט דיפרנציאציה לצביעה בהמטוקסילין
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health), ארה"ב1.54 שעותתוכנה לכימות תמונות
בופר לליזיס תאים עבור IPBeyotime, שנגחאי, סיןP0013בופר ליזיס לאימונו-שיקוע (immunoprecipitation) והבחאת חלבון
נוגדן ראשוני ל-Ki67Affinity Biosciences, OH, USAAF0198נוגדן ראשוני לזיהוי Ki67
ערכה לבדיקת ציטוטוקסיות של LDHBeyotime, שנגחאי, סיןC0016ערכה למדידת שחרור לקטט דהידרוגנאז ונזק תאי
מיקרוסקופ אורOlympus, טוקיו, יפןCKX53משמש לספירת תאי זרע ולבחינה מורפולוגית
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001ריאגנט טרנספקציה
קורא מיקרו-פלייטיםMolecular Devices, CA, USASpectraMax Miniמכשיר למדידות ספיגה (Absorbance)
ערכה לבדיקת ELISA להורמון לוטאיניזציה (LH) בעכבריםHuamei Biotech, ווהאן, סיןCSB-E12770mערכה למדידת הורמון לוטאיזן (LH) בנסיריום
ערכת ELISA לבדיקת טסטוסטרון בעכבריםHuamei Biotech, ווהאן, סיןCSB-E05101mערכה למדידת טסטוסטרון בסרום
גומי ניטרליBioLab Technology, בייג'ינג, סיןQN1253תוכה להרכבה של חתכים היסטולוגיים
נוגדן ראשוני ל-p38Affinity Biosciences, OH, USAAF6456נוגדן ראשוני לזיהוי p38 סך הכל
פראפורמלהידMedChemExpress, מונמות ג'נקשן, ניו ג'רזי, ארה"בHY-Y0333מקבע לתאים ורקמות
ערכה PARISInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921ערכה להפרדה של RNA גרעיני וציטופלזמי
מערכת PCRABI, CA, USAABI PRISM 7300מכשיר PCR בזמן אמת
נוגדן ראשוני ל-p-p38Affinity Biosciences, OH, USAAF3455נוגדן ראשוני לזיהוי של p38 זרחפוס (phosphorylated p38)
תמיסת Proteinase KBeyotime, שנחאי, סיןST532ריאגנט להגברת חדירות הרקמה לפני צביעת TUNEL
ממברנות PVDFMillipore, MA, USAISEQ00010ממברנות להעברת חלבונים ב-Western blotting
נוגדן ראשוני QKI-5Abcam, MA, USAab126742נוגדן ראשוני לזיהוי QKI-5
תמיסת קישור ל-RNAInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040Dבופר לתגובות קישור של RNA-חלבון
תמיסות טעינה SDS (SDS loading buffer)Beyotime, שנגחאי, סיןP0286בופר טעינת דגימות עבור SDS-PAGE
חרוזי מגנט עם סטרפטאווידיןMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208חרוזי מגנט ללכידה של גששים של RNA המסומנים בביוטין
ערכה ל-qPCR מהיר עם TB GreenTakara, טוקיו, יפןCN830Sערכת ריאגנטים ל-PCR כמותי
Triton X-100מאקלין, שנחאי, סיןT824275ס reagent לחדירות (Permeabilization reagent)
ריאגנט TRIzolInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNריאגנט להפקת RNA כולל
תמיסת גילוי TUNELBeyotime, שנגחאי, סיןC1086ריאגנט לזיהוי פרגמנטציה של DNA
קסילןמאקלין, שנגחאי, סיןX821391ריאגנט להסרת פראפין ולהשקיפות רקמות

מקורות

  1. Bhattacharya I, Sharma SS, Majumdar SS. Etiology of male infertility: an update. Reprod Sci. 2024;31(4):942-965.
  2. Dong S, et al. Testicular aging, male fertility and beyond. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1012119.
  3. Wang X, et al. Decoding the pathogenesis of spermatogenic failure in cryptorchidism through single-cell transcriptomic profiling. Cell Rep Med. 2024;5(9):101709.
  4. Stallmeyer B, et al. Inherited defects of piRNA biogenesis cause transposon de-repression, impaired spermatogenesis, and human male infertility. Nat Commun. 2024;15(1):6637.
  5. Szlachcikowska D, Koszła O, Sołek P, Tabęcka-Łonczyńska A. Non-canonical apoptosis mediates oxaliplatin-induced disruption of spermatogenic cells: implications for male fertility. Chem Biol Interact. 2026;431:112009.
  6. Chi YN, et al. Geniposide attenuates spermatogenic dysfunction via .inhibition of endoplasmic reticulum stress in male mice. Chem Biol Interact. 2022;366:110144.
  7. Guo XB, et al. Protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes against the reproductive toxicity of cyclophosphamide is associated with the p38 MAPK/ERK and AKT signaling pathways. Asian J Androl. 2021;23(4):386-391.
  8. Lamb DJ. Chromosome defects and male factor infertility. Fertil Steril. 2025;123(6):933-942.
  9. Kathrins M, Niederberger C. Diagnosis and treatment of infertility-related male hormonal dysfunction. Nat Rev Urol. 2016;13(6):309-323.
  10. Piechka A, et al. Molecular mechanisms of cellular dysfunction in testes from men with non-obstructive azoospermia. Nat Rev Urol. 2024;21(2):67-90.
  11. Li Z, et al. The role of Cistanches Herba and its ingredients in improving reproductive outcomes: a comprehensive review. Phytomedicine. 2024;129:155681.
  12. Jiang X, et al. Shenling Baizhu San improves spermatogenic dysfunction in hyperuricemia mice by regulating Sirt3/Nrf2 to inhibit testicular ferroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;340:119310.
  13. Deng W, Sun D, Cai B, Jin B. Yangjing capsule improves oligoasthenozoospermia by promoting nitric oxide production through the PLCγ1/AKT/eNOS pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1056091.
  14. Zhao H, et al. Yangjing Capsule ameliorates spermatogenesis in male mice exposed to cyclophosphamide. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:980583.
  15. Jin B, et al. Yangjing Capsule improves testicular angiogenesis by activating the VEGFA/eNOS signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:1957267.
  16. Guo W, et al. Chlorocholine chloride exposure induced spermatogenic dysfunction via .iron overload caused by AhR/PERK axis-dependent ferritinophagy activation. Ecotoxicol Environ Saf. 2024;274:116193.
  17. Wang Z, et al. Yangjing Capsule extract promotes proliferation of GC-1 Spg cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:640857.
  18. Zhang P, et al. LncRNA-mediated adipogenesis in different adipocytes. Int J Mol Sci. 2022;23(13).
  19. Núñez-Martínez HN, Recillas-Targa F. Emerging functions of lncRNA loci beyond the transcript itself. Int J Mol Sci. 2022;23(11).
  20. Herman AB, Tsitsipatis D, Gorospe M. Integrated lncRNA function upon genomic and epigenomic regulation. Mol Cell. 2022;82(12):2252-2266.
  21. Wang JZ, et al. QKI-5 regulates the alternative splicing of the cytoskeletal gene ADD3 in lung cancer. J Mol Cell Biol. 2021;13(5):347-360.
  22. Zeng Y, et al. Nickel induces blood-testis barrier damage through ROS-mediated p38 MAPK pathways in mice. Redox Biol. 2023;67:102886.
  23. Luo D, He Z, Yu C, Guan Q. Role of p38 MAPK signaling in testis development and male fertility. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6891897.
  24. Xia C, et al. LncRNA CCAT1 enhances chemoresistance in hepatocellular carcinoma by targeting QKI-5. Sci Rep. 2022;12(1):7826.
  25. Li K, et al. A long noncoding RNA binding to QKI-5 regulates germ cell apoptosis via .the p38 MAPK signaling pathway. Cell Death Dis. 2019;10(10):699.
  26. Zhou X, et al. ANKRD49 inhibits etoposide-induced intrinsic apoptosis of GC-1 cells by modulating NF-κB signaling. Mol Cell Biochem. 2019;457(1-2):21-29.
  27. Fang C, et al. Integrative proteomics and metabolomics approach to identify the key roles of icariin-mediated protective effects against cyclophosphamide-induced spermatogenesis dysfunction in mice. Front Pharmacol. 2022;13:1040544.
  28. Li K, et al. Adeno-associated-virus-mediated delivery of CRISPR-CasRx induces efficient RNA knockdown in the mouse testis. Theranostics. 2024;14(10):3827-3842.
  29. Yi H, et al. Retinoic acid mitigates NSC319726-induced spermatogenesis dysfunction through cuproptosis-independent mechanisms. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):26.
  30. Guo Y, Wang A, Liu X, Li E. Effects of resveratrol on reducing spermatogenic dysfunction caused by high-intensity exercise. Reprod Biol Endocrinol. 2019;17(1):42.
  31. Beeraka NM, et al. Ginsenoside Rh4 suppresses Notch3 and PI3K/Akt signaling to inhibit the growth and metastasis of gastric cancer cells. J Cancer Biomol Ther. 2025;2(1):145-156.
  32. Li P, et al. Proteomic analysis of cisplatin-induced spermatogenesis defects in mice. Ann Med. 2026;58(1):2612816.
  33. Wang Z, et al. Melatonin ameliorates paclitaxel-induced spermatogenesis and fertility defects in mice. J Cell Mol Med. 2022;26(4):1219-1228.
  34. Abdi M, et al. Cyclophosphamide-induced infertility and the impact of antioxidants. Am J Reprod Immunol. 2024;92(6):e70014.
  35. Özbilgin MK, Demirören S, Üçöz M, Oztatlici M. Cyclophosphamide suppresses spermatogenesis in the testes of mice through downregulation of miR-34b and miR-34c. Andrologia. 2021;53(7):e14071.
  36. Poojary KK, et al. Curcumin nanocrystals attenuate cyclophosphamide-induced testicular toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2021;433:115772.
  37. Cao J, et al. Single-cell map of human azoospermic testes caused by cyclophosphamide chemotherapy. Sci Data. 2024;11(1):163.
  38. Dong Y, et al. New insights into polycyclic aromatic hydrocarbons: Phenanthrene targets ribosomes to induce neuronal apoptosis. Aquat. Toxicol. 2026;298:107884.
  39. Wang Y, et al. Interplay between elemental imbalance-related PI3K/Akt/mTOR-regulated apoptosis and autophagy in arsenic (III)-induced jejunum toxicity of chicken. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2018;25(19):18662-18672.
  40. Liu H, et al. Integrating network toxicology, transcriptomics and experimental validation to elucidate the potential mechanisms of fluoride-induced neurotoxicity in zebrafish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2026;306:110549.
  41. Saleh DO, et al. Cyclophosphamide-induced testicular injury: the role of chrysin in mitigating iron overload and ferroptosis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(5):5475-5489.
  42. Dong S, et al. Loss of lncRNAs 1700101O22Rik and 1700027A15Rik causes sperm malformation and subfertility. Andrology. 2025;13(5):1223-1235.
  43. Liu W, et al. A novel meiosis-related lncRNA, Rbakdn, contributes to spermatogenesis by stabilizing Ptbp2. Front Genet. 2021;12:752495.
  44. Sun TC, et al. LncRNAs induce oxidative stress and spermatogenesis by regulating endoplasmic reticulum genes and pathways. Aging (Albany NY). 2021;13(10):13764-13787.
  45. Hua R, et al. DNM3OS enhances the apoptosis and senescence of spermatogonia associated with nonobstructive azoospermia by providing miR-214-5p and decreasing E2F2 expression. Anal Cell Pathol (Amst). 2023;2023:1477658.
  46. Wang S, et al. Quaking 5 suppresses TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition and cell invasion in lung adenocarcinoma. EMBO Rep. 2021;22(6):e52079.
  47. Chen X, et al. The emerging roles of the RNA-binding protein QKI in cardiovascular development and function. Front Cell Dev Biol. 2021;9:668659.
  48. Li J, et al. Qiangjing tablets repair blood-testis barrier dysfunction in rats by regulating oxidative stress and the p38 MAPK pathway. BMC Complement Med Ther. 2022;22(1):133.
  49. Tang Z, et al. MRE11 is essential for the long-term viability of undifferentiated spermatogonia. Cell Prolif. 2024;57(9):e13685.
  50. Jiao Y, Feng Z, Zhang T, Chen X. Impact of Vitamin D(3) Supplementation on Androgens and Semen Parameters in Infertile Men: A Systematic Review and Meta-Analysis Based on Prospective Randomised Controlled Trials. Arch. Esp. 2025;78(6):772-781.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BiologyYangjing Capsulesspermatogenic dysfunctionlncRNA NONMMUT031883 2Quaking I 5p38 MAPK pathway

מאמרים קשורים