הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דגירה In vitro עם נוזל קריא (Rumen Fluid) וצביעה היסטולוגית של רכיבי דופן תא נבחרים בגבעולים של תלתן (Medicago sativa L.)

122 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73286

⸱

18 בספטמבר 2026

 , 
1Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota - Twin Cities, 2United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים ויזואלית את השקיעה של מרכיבי דופן התא ליגנין ופקטין בחתכים רוחביים של גבעולי אלפאס (Medicago sativa L.). המטרה היא לזהות רקמות ספציפיות בגבעול שניתן יהיה להכווין אליהן פיתוח של זני אלפאס חדשים בעלי מאפייני עיכול רצויים של הגבעול.

תקציר

הצטברות של רכיבי דופן התא ככל שהצמחים גדלים מגבילה את התזונה מהמספוא עבור רuminants. בפרט, שקיעת ליגנין ברקמות הצמח מעכבת את פירוק הפחמימות של דופן התא, תאית (cellulose) והמיצלולוז (hemicellulose), ובכך מפחיתה את כמות האנרגיה הזמינה מהמספוא. עם זאת, רכיב הפקטין של דופן התא, הניתן לעיכול גבוה, זמין בקלות לפירוק. מידע על שקיעת ליגנין ופקטין בסוגים שונים של תאי גבעול עשוי לספק תובנות מכניסטיות לגבי הגורמים העומדים בבסיס השונות בעיכול הגבעול בין זני אלפאלופה. דגירה In vitro של חתכי גבעול בנוזל קיבה מדמה את התהליכים שמרכיבי הגבעול עוברים בקיבה. בשילוב עם צביעה היסטולוגית ומיקרוסקופיה, שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של שינויים בפירוק הרקמה לאורך זמן ואת מיקומם של הליגנין והפקטין בגבעול. צבע Wiesner מגיב עם יחידות אלדהיד של גואיסיל (G) בליגנין וצובע אותן בוורוד פוקסיה. באופן דומה, ruthenium red מקיים אינטראקציה עם קבוצות הקרבוקסיל של הפקטין, וצובע את הפקטין בגבעול בגוונים הנעים בין ורוד לכתום וחום. פרוטוקול זה מתאר את עיכול חתכי גבעול של אלפאלופה לאחר חשיפה למיקרובים של הקיבה, ולאחריו צביעה לוויזואליזציה של תבניות ליגנין ופקטין בדפנות התאים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות רקמות גבעול שבהן ליגנין ופקטין נוכחים או חסרים, דבר המקל על השוואות בין זני אלפאלופה.

מבוא

דופן תא עוטפת כל תא צמחי. תאית (cellulose), המיצלולוז (hemicellulose), ליגנין ופקטין הם מרכיבים של דופן התא והם תורמים לסיב הצמחי, חלק הכרחי בתזונתו של בעל מע反ר (ruminant). בעוד שפקטינים הם פוליסכרידים בני עיכול גבוה (מסיסים)1, ליגנין הוא פולימר שאינו ניתן לעיכול המגביל את פירוק הסיבים2. לכן, ליגנין מפחית את יכולת העיכול של הצמח ובסופו של דבר מקטין את האנרגיה הזמינה לבעל המע反ר מהמספוא. עם זאת, ליגנין תומך בתפקודים פיזיולוגיים חשובים של הצמח, כגון הובלת מים ברחבי הצמח באמצעות חיזוק אלמנטים של טרכאות (tracheid elements)3. עבודות קודמות הראו כי שינויים בסיבי הגבעול המפחיתים ליגנין או מגבילים פקטין עשויים לשפר את יכולת העיכול של הגבעול ואת הערך התזונתי של המספוא4. לפיכך, פרוטוקול זה מתמקד בשני מרכיבי דופן התא הללו. ריכוזים כוללים של ליגנין ופקטין בדופן תאי הגבעול אינם מספקים מידע מספיק כדי להסביר את המנגנונים העומדים בבסיס יכולת העיכול של סיבי הגבעול5. דגירה In vitro עם נוזל קיבלה (rumen fluid) וצביעה היסטולוגית יכולות לספק תובנות ברמה התאית על ידי ויזואליזציה של הבדלים במרכיבי דופן התא בין צמחים בעלי יכולת עיכול שונה של סיבי הגבעול4,6. בפרוטוקול הנוכחי, אלפאלפא (Medicago sativa L.), קטנית מספוא רב-שנתית נפוצה, משמשת כמין מודל להדגמת דפוסי ליגנין ופקטין ברקמות הגבעול, המכילות יותר ליגנין אך פחות פקטין מאשר העלים.

In vitro inkובציה עם נוזל קיבלה (rumen fluid) מדמה את עיכול העשב בקיבתו של בעל מעי רשת, ומאפשרת לבחון את השפעות האנטומיה של העשב על העיכול. על ידי יצירת תנאים במבחנה הדומים לאלו הקיימים בקיבלה, ניתן להוציא בנקודות זמן שונות חתכים רוחביים של הגבעול המודבקים למסליילי זכוכית, כדי להעריך את מידת פירוק הרקמה בעקבות החשיפה לנוזל הקיבלה6. שיטה זו מספקת גישה פשוטה, מהירה וזולה יחסית להדמיית המבנים האנטומיים של גבעולי אלפאלפה7 ולבחינת האופן שבו סוגי תאים המכילים רכיבי דופן תא שונים משתנים ככל שהגבעול מעוכל.

צביעה היסטולוגית של חתכים רוחביים של הגבעול מאפשרת ויזואליזציה של רכיבי הדופן התאית. פלורוגלוצינול וחומצה כלורית (HCl) משולבים ליצירת צביעת Wiesner, המדגישה רקמות גבעול המכילות יחידות ליגנין עשירות בגואיאציל8 על ידי תגובה עם מונומרים של G C6C3 aldehyde (coniferaldehyde)9. ליגנין מורכב ממספר תת-יחידות מונומריות; עם זאת, לאורך מאמר זה, המונח "ליגנין" מתייחס אך ורק למונומר מסוג G-unit, שכן זהו המונומר המגיב לצביעת Wiesner10 ולכן הוא זה המיוצג ויזואלית באמצעות פרוטוקול זה. רקמות מסוימות, כגון צינורות xylem, הן תמיד מולגננות6. אחרת, השקעת ליגנין ברקמות גבעול של אלפאס (lucerne) מתחילה ברגע שהצמיחה המשנית (קמביאלית) נפתחת, וזה חופף להפסקת ההתארכות של מפרקי הגבעול6. Ruthenium red נקשר לחומרים פקטיים, המכילים קבוצות קרבוקסיל שלעתים נמצאות באסטריפיקציה וחולקות כמה שרשראות צד11. קבוצות הקרבוקסיל של פקטינים הנמצאים בלאמלה האמצעית ובדפנות התא הראשוניות מגיבות עם ruthenium red11. פקטין מעורב בהתארכות תאים ולכן הוא נוכח בתאים במהלך צמיחה ראשונית. לאורך כתב היד, המונח "פקטין" מתייחס באופן כללי למערך הפקטינים שעשויים להיות נוכחים. שילוב של צביעה היסטולוגית עם דגירה של רומן in vitro מקל על תצפית במיקומם של רכיבי הדופן התאית בגבעול ומדגיש כיצד סוגי תאים שונים משתנים במהלך עיכול ברומן. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות תאי גבעול המכילים ליגנין ופקטין ולאפיין דפוסים בין זני אלפאס וזמני דגירה שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נערך בהתאם להנחיות המוסדיות לניסויים בבעלי חיים (IACUC 2301-40689B).

1. סימון מבחנות הדגימה

  1. הכנה וסימון של מבחנות דגימה לאינקובציה, אחסון וצביעה
    1. סמנו מראש חמש סדרות נפרדות של מבחנות צנטריפוגה קוניות חד-פעמיות עם פקק הברגה בנפח 50 mL עבור כל דגימה. הוסיפו לכל מבחנה את מזהה הדגימה ואת זמן האינקובציה עבור השימושים המתוארים להלן.
    2. סמנו את מבחנות ההמתנה לפני האינקובציה והוסיפו 35 mL של מים אולטרה-טהורים.
    3. סמנו את מבחנות האינקובציה לשימוש בסעיפים 3 ו-4. ארגנו את המבחנות במעמדים נפרדים לפי זמן האינקובציה (0, 4, 8, 24, 48, או 96 h).
      הערה: השתמשו בטוש קבוע בדרגת תעשייה כדי למנוע מהסימונים להימחק באמבט המים.
    4. סמנו את מבחנות האחסון לאחר האינקובציה והוסיפו 35 mL של תערובת 50:50 של 100% glycerol ומים אולטרה-טהורים. השתמשו במבחנות אלו לאחסון חתכים רוחביים שעברו עיכול על סליידים עד לצביעה.
    5. סמנו את מבחנות קדם-הצביעה והוסיפו 35 mL של תערובת 50:50 של ethanol 200-proof ומים אולטרה-טהורים. השתמשו במבחנות אלו להוצאת glycerol מהחתכים הרוחביים לפני הצביעה.
    6. סמנו את מבחנות ההידרציה והוסיפו 35 mL של מים אולטרה-טהורים.

2. חיתוך גבעול בחתך רוחב והצמדתו לשקופיות

  1. באמצעות פינצטה, בחרו מקטע גבעול אחד בכל פעם מהגבעולים מדגם והוציאו את מרכז המקטע.
    הערה: השתמשו בארבעה גבעולים לכל דגימה כחזרות טכניות עבור כל חזרה ביולוגית. בחרו את ארבעת הגבעולים באופן אקראי מכל הגבעולים האפשריים לכל דגימה. השתמשו בסט נוסף של גבעולי סטנדרט כביקורת עבור כל סבבי האינקובציה.
  2. גזרו שני מלבנים של בידוד קצף פוליסטירן נוקשה מוקצף, כל אחד באורך של כ-2.5 cm ובעובי של 0.6 cm. גזרו חריץ קטן לאורך כל פיסה כך שמפרק גבעול יתאים בדיוק בין שתי פיסות הקצף.
  3. הניחו את "סנדוויץ'" הגבעול על השולחן של מיקרוטום הזזה המסוגל להפיק חתכים בעובי 100 μm. בעזרת מכחול עדין, הניחו טיפה של מים על הגבעול ועל להב המיקרוטום כדי להקל על ביצוע חיתוך נקי.
  4. חתכו חתכים רוחביים של הגבעול בעובי 100 μm. השתמשו במכחול כדי להעביר כל חתך רוחבי לכלי פטרי מסומן מראש המכיל מים אולטרה-טהורים לאחסון זמני, והסירו כל שארית קצף מהכלי.
    הערה: החליפו את להב המיקרוטום אם הקצף נקרע, שכן קרע עשוי להעיד על להב קהה.
  5. סמנו ידנית שתי זכוכיות סטנדרטיות בגודל 25 mm × 75 mm עבור כל דגימה בכל נקודת זמן של אינקובציה (2 צביעות × 6 נקודות זמן = 12 זכוכיות לדגימה עבור כל אחת מהחזרות הביולוגיות). כללו בכל תווית את מזהה הדגימה, זמן האינקובציה והצבע.
  6. גזרו חתיכה של סרט דביק דו-צדדי ברוחב 2 mm ואורך 2.5 cm. מקמו את הצד הקצר של הסרט במרחק של 0.5 cm מהחלק התחתון של הזכוכית, כאשר הצד הדביק פונה כלפי מטה, ולחצו בחוזקה על צד נייר השעווה של הסרט בעודכם לובשים כפפות כדי להבטיח הצמדה.
    הערה: בצעו שלב זה על משטח שטוח כדי למנוע שבירה של זכוכיות המיקרוסקופ.
  7. השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה כדי לכוון את כל החתכים הרוחביים לאותו כיוון. הסירו את נייר השעווה מהסרט הדו-צדדי, ובשמירה על הכיוון של החתכים הרוחביים, העבירו אותם לסרט שעל הזכוכית המסומנת מראש בעזרת מכחול עדין שהורטב. שמרו על החתכים הרוחביים לחים מעט.
  8. הניחו את נייר השעווה מעל החתכים הרוחביים וגלגלו עליו קלות את המכחול כדי להצמיד את החתכים הרוחביים בחוזקה לסרט הדו-צדדי. הסירו את נייר השעווה והניחו את הזכוכית המוכנה המכילה ארבעה חתכים רוחביים לתוך מבחנה השמירה המסומנת מראש שתוארה בשלב 1.1.2, תוך וידוא שהמים האולטרה-טהורים מכסים את החתכים הרוחביים המורכבים.
  9. עבור צביעה הן ב-ruthenium red והן ב-Wiesner stain, הניחו שתי זכוכיות גב-אל-גב בכל מבחנת שמירה כאשר הסרט הדו-צדדי פונה החוצה.
    הערה: לאחר הרכבת כל הזכוכיות והנחתן במבחנות המכילות מים אולטרה-טהורים, אחסנו את הזכוכיות למשך הלילה בטמפרטורת החדר במידת הצורך.

3. הכנה לדגירה in vitro של חתכי רוחב של הגבעול

  1. השתמשו במבחנות צנטריפוגה חד-פעמיות עם מכסה הברגה בנפח 50 mL שהוכנו לדגירה (ראו 1.1.3). קבצו את כל מבחנות הדגימות עבור כל פרק זמן דגירה על גבי רैक פלסטיק בודד.
  2. השתמשו במאזני אנליזה עם דיוק של ארבעה ספרות אחרי הנקודה כדי לשקול 0.2 g של סטנדרט גבעול תירס גרוס ב-1 mm על נייר שקילה, והעבירו בזהירות את החומר לכל מבחנת דגירה, למעט המבחנות של 0 h, המשמשות כביקורת ללא דגירה. סגרו את המבחנות והניחו אותן בצד עד לשימוש.
    הערה: סטנדרט גבעול התירס מספק אנרגיה לתמיכה במיקרוביים של הרוםן במהלך הדגירה, מכיוון שמסת הביומה של חתכי הרוחב של הגבעול אינה מספיקה כדי לשמור על פעילות מיקרוביאלית.
  3. מלאו אמבט מים במחזוריות בכמות מים מספיקה והביאו אותה לשיווי משקל בטמפרטורה של 39 °C לפני תחילת הדגירה. כווןנו את עומק המים כך שיכסו את סימון ה-35 mL במבחנות ה-50 mL, והשתמשו במאוורר במידת הצורך כדי לשמור על סירקולציה אחידה של המים ועל הטמפרטורה.
  4. הכנת באפר מקדוגאל (McDougall’s buffer) עבור תמיסת ההחדרה
    1. הכינו את באפר מקדוגאל לא יותר מיומיים לפני תחילת הדגירות.
      הערה: ערבבו את באפר מקדוגאל עם נוזל רומן ביחס של 4:1 להכנת תמיסת ההחדרה. התאימו את נפח הבאפר למספר הדגימות, והכינו מספיק תמיסת החדרה כדי לספק 30 mL לכל מבחנה.
    2. מדדו 1,600 mL של מים אולטרה-טהורים. העבירו 1 L לבקבוק ארלנמאייר שטוח בנפח 3 L ושמרו 600 mL להעברה ושטיפת ריאגנטים.
    3. הניחו מגנט שקיעה בבקבוק הארלנמאייר והציבו את הבקבוק על פלטת ערבוב.
    4. הניחו משפך פלסטיק בבקבוק הארלנמאייר. הוסיפו 15.7 g נתרן ביקרבונט (NaHCO₃), 5.9 g נתרן פוספט דיבסיק אנידרוס (Na₂HPO₄), 0.91 g אשלגן כלוריד (KCl), 0.75 g נתרן כלוריד (NaCl), 0.19 g מגנזיום סולפט heptahydrate (MgSO₄·7H₂O), ו-0.06 g סידן כלוריד דיהידרט (CaCl₂), תוך הוספת ריאגנט אחד בכל פעם והמתנה להמסה מלאה של כל ריאגנט לפני הוספת הבא אחריו. השתמשו בחלקים מ-600 mL של המים האולטרה-טהורים ששמרו כדי לשטוף את המשפך לאחר כל הוספה.
    5. לאחר הוספת סידן כלוריד דיהידרט, הכניסו מפיץ CO₂ כדי להקל על ההמסה ובצעו ספארגציה (sparge) לתמיסה. ברגע שהתמיסה תהיה צלולה, המשיכו בספארגציה למשך 10–15 min נוספים.
    6. סגרו את הבקבוק היטב ואבטחו את הפקק באמצעות סרט הדבקה, כיוון שחימום הבאפר עלול להעלות את הלחץ בתוך המכל.
    7. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 20 °C למשך עד יומיים. הניחו את התמיסה באמבט מים של 39 °C ביום שלפני השימוש, או הניחו אותה ישירות באמבט מים של 39 °C אם תהיה בשימוש למחרת.

4. אינקובציה In vitro של חתכים רוחביים של הגבעול

  1. ביום האינקובציה, מקריבים 47 mL של מים ו-4 mL של 1 N NaOH לתוך כלי ביקר בנפח 100 mL במכססה, ומוסיפים 0.625 g של cysteine-HCl. בכלי ביקר שני בנפח 100 mL, מוסיפים 0.625 g של sodium sulfide ל-47 mL של מים, ושומרים על שני התמיסות נפרדות עד להכנת תמיסת ההקלעה.
  2. ממלאים תרמוס מבודד במים חמים כדי ליצור סביבה חמה להעברת מיקרואורגניזמים מהרומן מהפרה למעבדה. מכינים דלי בנפח חמישה גאלון להעברת המים החמים מהתרמוס.
  3. נוסעים לרפת כדי לאסוף נוזל רומן מהפרה עם קנולה שהוקצתה לניסוי על ידי הנהלת הרפת.
    הערה: יש לאסוף את נוזל הרומן בערך באותה שעה ביום ומאותה פרה לאורך כל הניסוי כדי למזער שונות. יש לתאם עם הנהלת הרפת כדי להקדים ולהודיע מתי תהיו ברפת לאיסוף נוזל הרומן.
  4. מזהים את הפרה הניסויית ולובישים ציוד הגנה אישי מתאים, כולל חלוק מעבדה, הגנה על העיניים, כיסויי נעליים וכפפות עד לאורך הכתפיים.
    הערה: הגבילו את הפרוצדורות בשלבים 4.4–4.8 לאנשי צוות המורשים תחת פרוטוקול ה-IACUC הרלוונטי.
  5. מעבירים את המים החמים מהתרמוס לדלי בנפח חמישה גאלון. מכינים שתי שכבות של גזה בדרגה 50 (בד גבינה) לסינון חומר הרומן.
  6. איסוף נוזל רומן מהפרה עם קנולה
    1. פותחים בזהירות את הקנולה ומניחים את הפקק בדלי בנפח חמישה גאלון עם המים החמים כדי למנוע זיהום של הפקק. בעזרת יד עם כפפה, מסירים מספיק חומר מהרומן כדי להגיע לממשק המוצק-נוזל של הרומן.
    2. במרגע ההגעה לממשק המוצק-נוזל, אוספים מספר חפניות של חומר וסוחטים אותו דרך שתי שכבות של גזה בדרגה 50, שכל אחת מהן היא בקירוב ריבוע של 45 cm, לתוך תרמוס עם פקק הברגה שחומם מראש. משליכים את החומר השהוי לאחר סחיטת נוזל הרומן דרך הגזה.
    3. חוזרים על שלב 4.6.2 עד שמתקבלים 1 L של נוזל רומן בתרמוס עבור כל קבוצה של 60 מבחנות הקלעה, תוך התאמת הנפח לפי הצורך בהתבסס על מספר הדגימות המיועדות לאינקובציה.
      הערה: לפרות עם קנולה יש מגבלות ספציפיות על כמות נוזל הרומן שניתן להוציא בשבוע נתון. תקשרו עם מנהל הרפת כדי להבטיח שכמות נוזל הרומן שנשלפה אינה עולה על המגבלה עבור הפרה.
  7. לאחר איסוף מספיק נוזל רומן, סוגרים את התרמוס היטב כדי לשמר את טמפרטורתו. מחזירים את הקנולה ומשתמשים במים החמים בדלי בנפח חמישה גאלון לצורך ניקיון.
  8. משליכים כיסויי נעליים, כפפות וגזה מלוכלכים למכל הפסולת המתאים בעת עזיבת הרפת. חוזרים למעבדה בהקדם האפשרי כדי לשמר את טמפרטורת נוזל הרומן ואת התנאים האנוקסיים.
  9. עם החזרה למעבדה, מערבבים את שתי תמיסות חומרי החיסור (ראו 4.1) במכססה ומערבבים אותן להכנת תמיססת החיסור.
  10. מניחים כלי ביקר מזכוכית בנפח של לפחות 2 L המכיל מגנט ערבוב גדול על פלטת ערבוב מחוממת המוגדרת ל-<30 °C, ומניחים דיפוזר CO₂ מעל הנוזל. מוסיפים 1,600 mL של McDougall’s buffer ומערבבים באיטיות מבלי לאפשר לדיפוזר ה-CO₂ לבוא במגע עם הנוזל.
    הערה: ניתן להשתמש בכלי ביקר מפוליפרופילן בטמפרטורה נמוכה זו. השתמשו ב-CO₂ כדי לדחוק את ה-O₂ ולסייע בשמירה על תנאים אנוקסיים.
  11. מרפדים משפך גדול בשתי שכבות של בד גבינה בדרגה 50 ומניחים אותו מעל משורה בנפח 2 L. מסננים 400 mL של נוזל רומן ומוסיפים אותם ל-McDougall's buffer (ראו 3.4.7) להכנת תמיססת ההקלעה.
  12. מוסיפים 80 mL מתמיססת החיסור (ראו 4.9) לתמיססת ההקלעה ומערבבים באיטיות. מונעים מהדיפוזר של ה-CO₂ לבוא במגע עם הנוזל.
  13. במכססה, מסירים את הפקקים ממבחנות האינקובציה ומארגנים אותן בתוך רקים נפרדים לפי זמן האינקובציה. פותחים את פקקי מבחנות ההמתנה של טרום-האינקובציה כהכנה להעברת השקופיות (ראו 1.1.2).
  14. בוחרים באופן אקראי מבחנת המתנה אחת של טרום-אינקובציה בכל פעם ומשתמשים בפינצטה כדי להעביר את השקופיות הזכוכית המורכבות למבחנת האינקובציה המתאימה (ראו 1.1.3). מניחים כל מבחנת אינקובציה המכילה את השקופיות המורכבות בתוך רק דגימות קטן ומניחים את מבחנת ההמתנה של טרום-האינקובציה בצד.
    הערה: השתמשו בשני אנשים לביצוע שלבים 4.14–4.15. במידת האפשר, מזערימו את קירור תערובת נוזל הרומן-בופר.
  15. שואבים 30 mL של תמיססת הקלעה לתוך מזרק של 60 mL המצויד במחט רחבה וקהה. מזלפים את התמיסה באיטיות לאורך דופן מבחנת האינקובציה, שוטפים את המבחנה ב-CO₂ למשך כ-20 s, סוגרים את המבחנה ומחזירים אותה לרק.
  16. מניחים את הרקים המכילים את המבחנות המוכלאות באמבט מים בטמפרטורה של 39 °C. מניעים את המבחנות בעדינות לפחות פעם אחת ביום ומחליפים את מיקומי הרקים מדי יום כדי למזער חימום לא אחיד.
    הערה: היווצרות בועות גז במבחנות מעידה על תסיסה פעילה.
  17. בסיום כל תקופת אינקובציה, מוציאים את הרק המתאים מאמבט המים. פותחים מבחנה אחת בכל פעם, מוציאים כל שקופית ושוטפים בעדינות מוצקים ותמיססת הקלעה שאריות בעזרת ultrapure water.
  18. מניחים את השקופיות השטופות בתוך מבחנות האחסון שלאחר-האינקובציה המכילות את תערובת הגליצרול-מים המתוארת בשלב 1.1.4.

5. צביעת חתך רוחבי עבור ליגנין

  1. אם השקופיות אוחסנו בתמיסת גליצרין-מים ביחס של 50:50, העבירו את שתי השקופיות המכילות את חיתוכי הרוחב המורכבים למבחנות שטיפה לפני צביעה המכילות את תמיסת האתנול-מים ultrapure (ראו סעיף 1.1.5). אחסנו את המבחנות למשך לילה במקרר כדי להסיר את הגליצרין לפני הצביעה.
  2. הכינו תמיסת פלורוגלוצינול (PG) בריכוז של 3% על ידי המסה של 0.3 g של PG ב-10 mL של אתנול מוחלט בבקרחון ארלנמאייר בנפח של 25 mL העטוף בנייר אלומיניום כדי להגן על הרכיב הפוטו-סנסטיבי מפני אור. סגרו את הבקרחון בפקק וסמנו אותו בשם התמיסה, תאריך ההכנה ושם המכין, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 20 °C.
  3. הוציאו את השקופיות מהמבחנות המקוררות והעבירו אותן באופן זמני למבחנות ההידרציה המתוארות בשלב 1.1.6, המכילות 100% מי ultrapure.
    הערה: שמרו על חיתוכי הרוחב הידרטיים במהלך הטיפול כדי למזער חמצון, שעלול לפגוע בחיתוכים ולהשפיע על הדימות העוקב.
  4. הכינו את צבע ויסנר (Wiesner stain) בתוך מזהם באמצעות פיפטה, על ידי ערבוב של 50 μL של 3% PG באתנול (ראו סעיף 5.2) עם 25 μL של חומצה כלורית (HCl) בתוך כלי קיבול (beaker) בנפח של 50 mL.
    הערה: התאימו את הכמויות למספר השקופיות תוך שמירה על יחס של 2:1 בין PG ל-HCl.
    אזהרה: טיפול בחומצה כלורית חייב להתבצע במזהם מכיוון שהיא קורוזיבית למתכות, גורמת לכוויות חמורות בעור ולנזקי עיניים, ועלולה לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. הימנעו משאיפת אדים או תרסיסים, לבשו כפפות מגן מתאימות, ביגוד, הגנה לעיניים ולהגנה על הפנים, ושטפו היטב עור חשוף לאחר הטיפול.
  5. הוציאו שקופית אחת מהמבחנה וספגו בעדינות את הזכוכית מסביב לסרט הדבק הדו-צדדי באמצעות נייר סופג בעל סיב nisk-lint כדי למנוע מהצבע לזלוג מהסרט. הניחו את השקופית על מגש פלסטיק קטן והשתמשו בפיפטה כדי להניח מספר טיפות של צבע ויסנר מעל חיתוכי הרוחב. 
  6. הפעילו טיימר ל-12 min וכסו את השקופיות בנייר אלומיניום להגנה מאור. בדקו את חיתוכי הרוחב במהלך הצביעה והניפו שוב את הצבע לפי הצורך כדי למנוע התייבשות.
    הערה: מנעו את התייבשות חיתוכי הרוחב מכיוון שחמצון עלול לפגוע ברקמה ולהשפיע על הדימות העוקב.
  7. לאחר 12 min, הסירו בעדינות את עודפי צבע ויסנר באמצעות נייר סופג בעל סיב nisk-lint. שטפו את הרקמה לפני ההרכבה כדי למזער את חשיפת עדשת היעד של המיקרוסקופ לאדי HCl קורוזיביים.
  8. הניחו 1–2 טיפות של תמיסת גליצרין-מי ultrapure בריכוז של 50% מעל כל חיתוך רוחב וכסו בזכוכית כיסוי בגודל 24 mm × 30 mm (עובי מס' 1.5). עברו מיד לניתוח מיקרוסקופי ולדימות.
    הערה: בצעו את רכישת התמונות בתוך 6–8 h מכיוון שצביעת ויסנר רגישה לזמן ועשויה להפוך לצהובה ולהתפשט מחיתוך הרוחב עם הזמן.

6. צביעת חתך רוחב לפקטין

  1. יש לבצע את שלב 5.1 כדי להסיר את תערובת הגליצרין-מים אולטרה-טהורים מהשקופיות המאוחסנות לפני הצביעה.
  2. הכינו תמיסת ruthenium red בריכוז 0.02% על ידי המסה של 0.02 g של ruthenium red ב-100 mL של מים אולטרה-טהורים בתוך בקבוק Erlenmeyer בנפח 125 mL העטוף בנייר אלומיניום כדי להגן על הרכיב הרגיש לאור מפני חשיפה. יש לסגור את הבקבוק בפקק ולסמנו בשם התמיסה, תאריך ההכנה ושם המכין, ולאחסנו בטמפרטורה של 20 °C.
  3. הוציאו את השקופיות מהמבחנות עם אתנול-מים אולטרה-טהורים שנמצאות בקירור, והעבירו את השקופיות המסומנות כראוי המכילות חתכים מורכבים למבחנות המכילות 100% מים אולטרה-טהורים (ראו 1.1.6) להמתנה זמנית.
    הערה: יש להקפיד על אמצעי הזהירות להידרציה המתוארים בשלב 5.3.
  4. הוציאו שקופית אחת מהמים האולטרה-טהורים באמצעות פינצטה וספגו את המים מסביב לסרט בעזרת נייר סופג דל סיבים כדי למנוע מהצבע לזרום על הזכוכית. הניחו את השקופית על מגש פלסטיק קטן.
  5. טפטפו מספר טיפות של תמיסת ruthenium red (ראו 6.2) כדי לכסות באופן אחיד את חתכי הרוחב. כסו את השקופיות בנייר אלומיניום למשך 10 min כדי להגן עליהן מהור, ולאחר מכן שטפו בעדינות את הצבע מהשקופית בעזרת מים אולטרה-טהורים למשך 2 min.
  6. ספגו את עודפי המים מהשקופית וטפטפו 1–2 טיפות של תערובת 50% גליצרין-מים אולטרה-טהורים על כל חתך רוחב. כסו את חתכי הרוחב עם זכוכית כיסוי בגודל 24 mm × 30 mm (עובי No. 1.5) והמשיכו לאנליזה מיקרוסקופית ולדימוג.
    הערה: יש לבצע את האנליזה המיקרוסקופית באותו היום לקבלת תוצאות אופטימליות.

7. דימוי בשדה בהיר

  1. בחנו את חתכי הרוחב תחת תאורת שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ בהגדלות של 10×, 20× ו-40×. ראו טבלה 1 עבור פרמטרים והגדרות לרכישת תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השימוש במבחנות צנטריפוגה לסימולציה של תנאי הקיר (rumen) אפשר עיכול in vitro מהיר וזול יחסית של חתכים רוחביים מגבעול Medicago sativa. באמצעות מיקרוטום, הוכנו חתכים רוחביים של גבעולי M. sativa בעובי 100 μm (איור 1A). החתכים הרוחביים של הגבעול הודבקו לשקופיות זכוכית באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי (איור 1B) והוטבלו בתמיסת אינוקולציה של נוזל קיר למשך תקופות דגירה שנעו בין 4 h ל-96 h (איור 1C). עבור הדגירה in vit...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חומר גלם של אלפאלפה ששימש במחקר הנוכחי כלל שיבוטים מחמישה קווי אלפאלפה. שני קווים ניסיוניים נבחרו לאחר שני מחזורי ברירה מנוגדת לעיכול סיבים בנייטרל דטרגנט in vitro (IVNDFD) מצמחי אם בעלי ערכי 16 h IVNDFD נמוכים ו-96 h IVNDFD נמוכים, או ערכי 16 h IVNDFD גבוהים ו-96 h IVNDFD גבוהים12. שלושה קווים מסחריים עם רקע גנטי לא ידוע נכללו אף הם במחקר, וצמחי אם נבחרו על בסיס ניתוח ספקטרוסקופיה באינפרא-אדום קרוב כדי לזהות פרטים עם (א) כמות הליגנין הגבוהה ביותר, (ב) כמות הליגנין הנמוכה ביותר, ו-(ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי המחקר נערך ללא כל מערכות יחסים מסחריות או פיננסיות שעלולות להיחשב כניגוד עניינים פוטנציאלי. אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה נועד אך ורק למטרת מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה מצד משרד החקלאות של ארה"ב (U.S. Department of Agriculture). ה-USDA הוא ספק ומעסיק המעניק שוויון הזדמנויות. כל הניסויים בוצעו בהתאם לחוקים הנוכחיים של ארצות הברית, המדינה שבה הם נערכו.

תודות

המחברים מודים ל-R. Ted Jeo על תובנותיו בנוגע לעבודות קודמות רלוונטיות. תודה למרכז הדימוג של אוניברסיטת מינסוטה - טווין סיטיז על מתן גישה לתוכנות רכישת וניתוח תמונות מיקרוסקופ לצורך הכנת התמונות לפרסום. עבודה זו נתמכה על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית – שירות המחקר החקלאי [062-21500-001-000D] והסכם שיתוף פעולה ללא סיוע (מס' 58-5062-2-016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נייר אלומינוםBoardwalk7106BW18 אינץ' × 1,000 רגל; משמש להגנה של תמיסות צביעה רגישות לאור מפני אור
קלציום כלוריד דיהידראט, מינימום 99%Sigma Life ScienceC7902-500Gמספר CAS 10035-04-8; ריאגנט עבור McDougall’בופר s
תוכנת מצלמהNikonNIS-Elements AR 5.42.04תוכנת דימות ב-64 סיביות המשמשת לרכישת תמונות ולניתוחן
גז פחמן דו-חמצניMathesonUN1013בדרגת שימוש כללית; משמש לשמירה על תנאים אנוקסיים במהלך ההכנה והאינקובציה
מקלחת מים עם סירקולטורדיוק—אמבט מים מחזיר עם בקרת טמפרטורה המשמש לשמירה על דגימות ב- 39 °C
תקן לגבעולי תירסאוניברסיטת מינסוטהלא ניתן לספק תרגום כיוון שלא הוזן טקסט מקור. נא להזין את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם.נקצר בסתיו 2023 בסנט פול, מינסוטה, ארה"ב; נטחן לגודל של 1 מ"מ ושימש כתשתית מיקרוביאלית
זכוכית כיסויThermo Scientific341924 מ"מ × 30 מ"מ, עובי מס' 1.5, 1 אונקיה
מצלמת מיקרוסקופ Digital Sight 10 צבעונית עם חיישן תמונה CMOS בפורמט רחב FXNikonMQA20000מצלמת צבע דיגיטלית המשמשת לרכישת תמונות מיקרוסקופיות בשדה בהיר (brightfield)
מיקרוסקופ דיסקשן (מיקרוסקופ להבדילה)NikonSMZ18מיקרוסקופ סטריאו המשמש להכוון ומיקום של חתכי רוחב של גבעולים
סרט דביק דו-צדדיסרט הדבקה דו-צדדי מויניל למשרד של SelloTape42702 ממ"׳ × 53 מ'; משמש לקיבוע חתכי רוחב של גבעול לשיםות זכוכית
מאזנ דיגיטליוְGH-202מאזניים אנליטיים עם רזולוציה של ארבע ספרות אחרי הנקודה
בקבוק ארלנמייר (125 מ"ל)Kimax25600בקראי 125 מ"ל; תואם לפקק מס' 5
בקבוק ארלנמייר (25 מ"ל)Pyrex4980בקבוקון בנפח 25 מ"ל; תואם פקק מס' 0
אתנול (200 proof)Fisher Scientific04-355-720אתנול מוחלט המשמש להכנת תמיסות צביעה ולשטיפות טרום-צביעה
בידוד קצף פוליסטירן קשיח מוקצף (XPS)Owens Corning14077881 אינץ' × 2 רגל × לוח קצף בעובי 2 רגל, R-5, 15 PSI; משמש לתמיכה במפרקי הגבעול במהלך חיתוך נתחים
פינצטהFisher Scientific10-316Aפינצטות מעבדה המשמשות לטיפול במקטעי גבעול, זכוכיות מיקרוסקופ וחתכים מורכבים
זכוכית למשטחי דגימהFisherBrand12550325 מ"מ × 75 מ"מ × 1 מ"מ; משמש להרכבת חתכים רוחביים של הגבעול
בקבוע עגול (6 ליטר)PyrexCLS43205L-4EAבקבוק זכוכית בנפח 6 ליטר המשמש להכנה או לטיפול בנפחים גדולים של תמיסות
גליצרין, נוזל בדרגת מעבדהFisher Science Education525342Cמספר CAS 56-81-5; גליצרול המשמש בתמיסות קיבוע ואחסון
בד גזה כפול, דרגה 50חנות JINIOHEEB0FL27KXRN100% כותנה, מולבנת בלבן; משמשת לסינון חומר מהקימע (rumen) ונוזל קימע
משיח מדורג (10 מ"ל)Pyrex700024משורה של 10 מ"ל המשמשת למדידת נפחי נוזלים
חומצה הידרוכלוריתFisherA1445-500מספר CAS 7647-01-0; משמש עם פלורוגלוצינול להכנת צבע ויסנר (Wiesner stain)
טוש פרמננטי תעשייתי חזק במיוחדSharpie13601כתף דקה; משמשת לסימון מבחנות דגירה בסימונים עמידים למים
L-cysteine hydrochloride hydrateSigma-AldrichC121800-10Gמספר CAS 345909-32-2; חומר מחזר המשמש להכנת תמיסת האינקובציה
נייר סופג דל-סיביםKimberly-Clark341554.5 אינץ' × 8.5 אינץ'; משמש לספיגת שאריות נוזלים מהשקופיות ללא השארת סיבים
להב מיקרוטום בעל פרופיל נמוךLeica 81963065-LPלהב חלופי בעל פרופיל נמוך המשמש להכנת חתכים רוחביים אחידים של גבעול
מגנזיום סולפט הפטהידראטFisher ChemicalM80-500מספר CAS 10034-99-8; ריאגנט עבור McDougall’בופר s
מגנט לערבובFisher Scientific03-411-78376 מ"מ × 12 מ"מ; משמש לערבוב בופר ותמיסוֹת הדבקה
תוויות לכתובות למשלוח בדוארAvery51671/2 אינץ' × 1 3/4 אינץ'; משמש לזיהוי דגימות ושלשויות
מברשת צבעלואו-קורנל—סדרה 7000, מספר 3 עגולה; מברשת עדינה המשמשת להעברה ולמניפולציה של חתכי רוחב של גבעול
צלוחיות פטרי עם מכסיםכלי מעבדה של Becton Dickinson8173111960 מ"מ × 15 מ"מ; משמש לאחסון זמני של חתכי רוחב של גבעול במים אולטרה-טהורים
פלורוגלוצינול, 1,3,5-טריהידרוקסיבנזןSigma-AldrichP3502-25Gמספר CAS 108-73-6; ריאגנט המשמש להכנת צבע ויסנר (Wiesner stain)
פיפטה (100 μL)GilsonP 1000; 767547Mפיפט עם נפח מתכוונן המשמש לחלוקת תמיסות צביעה
משפך פלסטיק רב-שימושיNalgene10-437-23E150 מ"מ; משמש להעברת ריאגנטים ולסינון
ביקר פוליפרופילן (4 ליטר)Nalgene1201-4000ביקר בנפח 4 ליטר העמיד לכימיקלים, המשמש להכנה ולערבוב של תמיסות הַחְדָּרָה (inoculation)
אשלגן כלורידFisher ChemicalP217-500מספר CAS 7447-40-7; ריאגנט עבור McDougall’בופר s
סכיני גילוחפרסונה66-0089בעובי 0.009 אינץ'; משמש לקיצור ידני של חומרי גבעול
רותניום אדום, רותניום אוקסיכלוריד מאמוניסיגמאR-2751מספר CAS 11103-72-3; צבע היסטולוגי המשמש להדגשת חומרים פקטיים
מספרייםFiskars1063071מספריים רב-תכליתיים המשמשים לחיתוך סרט הדבקה, קצף וחומרים מתכלים אחרים
מבחנות צנטריפוגה קוניות עם פקק הברגה (50 מ"ל)Corning430828פוליפרופילן, לא פירוגני; משמש להחזקת דגימות, אינקובציה, שטיפה ואחסון
מיקרוטום סלדג' (Sledge microtome)Leica2000Rמיקרוטום להחלקה/מזחלה המשמש להכנת 100 μm-חתכים רוחביים עבים של הגבעול
נתרן ביקרבונט, בדרגת ACSFisher ChemicalS233-3מספר CAS 144-55-8; ריאגנט עבור McDougall’בופר s
נתרן כלורידFisher Chemical—מספר CAS 7647-14-5; ריאגנט עבור McDougall’בופר s
נתרן הידרוקסידFisher ChemicalS318-500מספר CAS 1310-73-2; משמש להכנת תמיסת החמצון
נתרן פוספט דו-בסיסי אנידרי (Na2HPO4)Sigma AldrichS-9763CAS 7558-79-4
סודיום סולפיד ללא מים (anhydrate), בדרגת ACS, מינימום 98.0%Oakwood Chemicals245960מספר CAS 1313-84-4; חומר מחזר המשמש להכנת תמיסת האינקובציה
כף מעבדה מסוג SpoonulaFisher Scientific14-375-10שפכטל מעבדה המשמש להעברת ריאגנטים באבקה
פלטת ערבובThermolyneK של Sybron7200פלטת ערבוב מגנטית המשמשת לערבוב של תמיסות בופר ותמיסות הדבקה
מזרק (60 מ"ל) עם מחט רחבהMonoject935401028מזרק של 60 מ"ל עם מחט רחבת קוטר המשמש להזרקת תמיסת ההוצאה (inoculation solution)
מתקני מבחנותThermo Scientific14-809-44מעמדים המשמשים לארגון ותמיכה במבחנות דגירה של 50 מ"ל
מדחוםFisherBrand13201663מדחום מעבדה המשמש לאימות טמפרטורת התמיסה ואמבט המים
מיקרוסקופ אנכיNikonEclipse Niמיקרוסקופ שדה בהיר (Brightfield) זקוף המשמש להדמיה וויזואליזציה של חתכי רוחב צבועים של גבעול
משאבת עזרLittle Giant Pump Co.502203דגם 2E-38N; 115 VAC, 60 Hz, 1.7 A; משמש להזרמת מים ולשמירה על טמפרטורת אמבט אחידה
נייר שקילהVWR Scientific Products12578-165נייר שקילה חד-פעמי המשמש לשקילה ולהעברה של ריאגנטים מוצקים ומצע גבעולי תירס

מקורות

  1. Cosgrove DJ. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005;6(11):850-861.
  2. Moore KJ, Jung H-JG. Lignin and fiber digestion. Journal of Range Management. 2001;54(4):420-430.
  3. Barros J, Serk H, Granlund I, Pesquet E. The cell biology of lignification in higher plants. Annals of Botany. 2015;115(7):1053-1074.
  4. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: cell wall deposition, composition, and degradability. Crop Science. 2002;42(2):524-534.
  5. Jung HG, Lamb JFS. Stem morphological and cell wall traits associated with divergent in vitro neutral detergent fiber digestibility in alfalfa clones. Crop Science. 2006;46(5):2054-2061.
  6. Engels FM, Jung HG. Alfalfa stem tissues: cell-wall development and lignification. Annals of Botany. 1998;82(5):561-568.
  7. Akin DE. Section to slide technique for study of forage anatomy and digestion. Crop Science. 1982;22(2):444-446.
  8. Jung HG, Deetz DA. Cell wall lignification and degradability. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:315-346.
  9. Blaschek L, et al. Cellular and genetic regulation of coniferaldehyde incorporation in lignin of herbaceous and woody plants by quantitative Wiesner staining. Frontiers in Plant Science. 2020;11:109.
  10. Blaschek L, et al. Different combinations of laccase paralogs nonredundantly control the amount and composition of lignin in specific cell types and cell wall layers in Arabidopsis. The Plant Cell. 2023;35(2):889-909.
  11. Nevins DJ. Analysis of forage cell wall polysaccharides. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:105-132.
  12. Xu Z, Heuschele DJ, Lamb JFS, Jung H-JG, Samac DA. Improved forage quality in alfalfa (Medicago sativa L.) via selection for increased stem fiber digestibility. Agronomy. 2023;13(3):770.
  13. Pradhan Mitra P, Loqué D. Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements. Journal of Visualized Experiments. 2014;(87):51381.
  14. De Micco V, Aronne G. Combined histochemistry and autofluorescence for identifying lignin distribution in cell walls. Biotechnic & Histochemistry. 2007;82(4–5):209-216.
  15. Kraus JE, et al. Astra Blue and Basic Fuchsin double staining of plant materials. Biotechnic & Histochemistry. 1998;73(5):235-243.
  16. Ursache R, Andersen TG, Marhavý P, Geldner N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 2018;93(2):399-412.
  17. Baldacci-Cresp F, et al. A rapid and quantitative safranin-based fluorescent microscopy method to evaluate cell wall lignification. The Plant Journal. 2020;102(5):1074-1089.
  18. Casero PJ, Knox JP. The monoclonal antibody JIM5 indicates patterns of pectin deposition in relation to pit fields at the plasma-membrane-face of tomato pericarp cell walls. Protoplasma. 1995;188(1-2):133-137.
  19. Pesquet E, Cesarino I, Kajita S, Pawlowski K. Physiological roles of lignins – tuning cell wall hygroscopy and biomechanics. New Phytologist. 2025;248(6):2674-2706.
  20. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: rate and extent of cell-wall thinning during ruminal degradation. NJAS: Wageningen Journal of Life Sciences. 2001;49(1):3-13.
  21. Yeung EC. A beginner’s guide to the study of plant structure. Tested Studies for Laboratory Teaching. 1998;19:125-142.
  22. Jensen, W.A. Botanical Histochemistry: Principles and Practice. Freeman W.H. & Co. San Francisco, CA. (1962).
  23. Ruzin, SE. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press; New York, NY; 1999.
  24. Gronwald JW, Bucciarelli B. Comparison of stem morphology and anatomy of two alfalfa clonal lines exhibiting divergent cell wall composition. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013;93(11):2858-2863.
  25. Dai R, et al. Overexpression MsJAR1 gene increased lateral branches and plant height in alfalfa (Medicago sativa L.). Scientific Reports. 2025;15(1):16956.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דגירה בנוזל קרוםגבעולי אלפאלפהשקיעת ליגניןשקיעת פקטיןעיכול גבעוליםצבע ויסנר (Wiesner)רותניום אדוםתזונת מספוא

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.