מאמר שיטה

זרימת עבודה סטנדרטית לאיסוף דגימות צואה אנושיות ומיצוי אוטומטי של חומצה דאוקסיריבנוקלאית באמצעות מעבד חלקיקים מגנטיים

120 צפיות

⸱

11 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gut Microbiome Division, SKAN Research Trust, 2Stem Cells Division, SKAN Research Trust

במאמר זה

סיכום

מטרתו של פרוטוקול זה היא להפוך לסטנדרט את איסוף דגימות צואה אנושיות ואת מיצוי ה-deoxyribonucleic acid האוטומטי באמצעות מעבד חלקיקים מגנטיים.

תקציר

ריצוף מיקרוביום של המעי הפך לגישה חשובה לחקירת הדינמיקה של קהילות מיקרוביאליות במצבים בריאים ובמצבי מחלה. שינויים בהרכב המיקרוביאלי נקשרו למספר הפרעות הקשורות לאורח חיים ולגיל, כולל סוכרת, לוקמיה ומחלות ניווניות של מערכת העצבים. מכיוון שמיקרואורגניזמים שונים מציגים מאפיינים פיזיולוגיים ודרישות סביבתיות שונות, איסוף, הובלה ועיבוד סטנדרטיים של דגימות צואה הם חיוניים כדי לשמור על שלמות הדגימה ולמזער שונות טכנית. שינויים המוכנסים במהלך הטיפול הפרה-אנליטי ומיצוי חומצת דאוקסיריבנוקלאית (DNA) עלולים להשפיע על ניתוחי מיקרוביום המשכיים ולהשפיע על פרשנות הנתונים. מטרתו של פרוטוקול זה היא לספק זרימת עבודה סטנדרטית לאיסוף דגימות צואה אנושיות ומיצוי DNA אוטומטי באמצעות ערכת MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (ערכה לבידוד חומצות גרעיניות) ומערכת KingFisher Flex System (מעבד אוטומטי של חלקיקים מגנטיים). זרימת העבודה משלבת טיפול מבוקר בדגימות עם מיצוי אוטומטי של חומצות גרעיניות כדי להפחית שונות ידנית ולשפר את העקביות הפרוצדורלית. הפרוטוקול כולל איסוף סטנדרטי של דגימות צואה, אחסון, הכנה, מיצוי אוטומטי והשבה של חומצות גרעיניות ממטריצות צואה מורכבות. תוצאות מייצגות מדגימות השבה מוצלחת של DNA המתאים ליישומים משכיים, כולל ריצוף גן 16S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) וריצוף מטגנומי מסוג shotgun. זרימת העבודה הסטנדרטית תומכת בעיבוד דגימות הדיר במחקר, מקלה על התרחבות (scalability) של מחקרי מיקרוביום ומקדמת עקביות רבה יותר בין ניסויים. ההדגמה הוויזואלית מספקת הדרכה מעשית ליישום עיבוד סטנדרטי של דגימות צואה ומיצוי אוטומטי של חומצות גרעיניות למחקר מיקרוביום של המעי.

מבוא

מיקרוביום המעי הוא מערכת אקולוגית מיקרובית מורכבת המשפיעה על חילוף החומרים, החסינות והתפקוד הנוירולוגי של המארח, והוא קשור יותר ויותר למגוון מחלות, כולל הפרעות מטבוליות, מחלת הפרקינסון, סרטן וניוון עצבי1,2. הוא ממלא תפקיד חשוב בשמירה על הפיזיולוגיה של המארח על ידי השפעה על המטבוליזם, התפקוד החיסוני, ספיגת רכיבי תזונה ועמידות למיקרואורגניזמים פתוגניים3,4. מדידות מיקרוביום חסונות וניתנות לשחזור הן חיוניות להמרת קשרים אלו לתובנות מכניסטיות ולישומים קליניים. התקדמויות בטכנולוגיות ריצוף דור הבא (NGS) חוללו מהפכה בהבנתנו לגבי הקהילות המיקרוביאליות המורכבות השוכנות במערכת העיכול. עם זאת, משתנים פרה-אנליטיים, כגון נהלי איסוף דגימות צואה, תנאי אחסון, טיפול, הובלה ושיטות מיצוי של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA), עלולים לשנות באופן סלקטיבי את מבנה הקהילה המיקרוביאלית, את תנובת ה-DNA ואת תוצאות הריצוף5,6. חוסר עקביות מתודולוגי זה מקשה לעיתים קרובות על השוואות בין מחקרים.

מבין השלבים הפרה-אנליטיים הקריטיים, מיצוי DNA מהווה אחד הגורמים המשפיעים ביותר על איכות נתוני המיקרוביום7,8. פרוטוקול מיצוי אידיאלי צריך להניב בעקביות DNA באיכות גבוהה ובמשקל מולקולרי גבוה, עם מינימום זיהומים במספר רב של דגימות. פלטפורמות אוטומטיות למיצוי חומצות גרעין יכולות לשפר את השחזוריות, להפחית שגיאות הנובעות מטיפול ידני, להוריד את הסיכון לזיהומים ולהגביר את התפוקה. ביצועיהן של פלטפורמות מיצוי אוטומטיות אלו תלויים במידה ניכרת בפרמטרי הפרוטוקול, כולל הומוגניזציה של הדגימה, תנאי טחינה בחרוש (bead-beating), כימיית הליזה, תנאי אינקובציה וטיפול בחרו지를 מגנטיים9,10. לכן, ביסוס של זרימת עבודה סטנדרטית, המשלבת איסוף אחיד של דגימות צואה עם מיצוי DNA אוטומטי, הוא חיוני ליצירת מאגרי נתוני מיקרוביום מהימנים ושחזירים.

כאן אנו מציגים זרימת עבודה סטנדרטית לאיסוף דגימות צואה אנושיות, טיפול בהן והפקה אוטומטית של DNA באמצעות ערכה להפקת חומצות גרעיניות ומעבד חלקיקים מגנטיים אוטומטי כפי שמתואר לעיל. הפרוטוקול שם דגש על טיפול מבוקר בדגימות, ליזה מכנית וכימית יעילה, הסרת מעכבים ואמצעי בקרת איכות המתאימים ליישומים המשכיים, כולל ריצוף אמפליקונים של הגן של 16S ribosomal ribonucleic acid (rRNA), ריצוף גנום מלא, תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) וריצוף מטגנומי מסוג shotgun. ההדגמה הוויזואלית מספקת הנחיה מעשית לעיבוד סטנדרטי של דגימות צואה ולהפקה אוטומטית של חומצות גרעיניות כדי לתמוך במחקר של מיקרוביום המעי שיה ניתן לשחזור ובמדד של סקלאביליות.

פרוטוקול

המחקר נערך בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה המוסדית של SKAN Research Trust ואושר על ידי הוועדה (מספר אישור SKAN/IEC/2025/04). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים לפני איסוף הדגימות.

הערה: כל הריאגנטים, החומרים המתכלים והציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. הרכבת ערכה לאיסוף דגימות צואה

  1. הרכיבו ערכה לאיסוף דגימות צואה הכוללת לוכד צואה סטרילי, מבחנה לאיסוף עם מכסה הברגה סטרילי (נפח 30–50 mL) עם שפכטל מצורף, מבחנה לאיסוף מלאה מראש בבופר ייצוב (stabilization buffer), כפפות חד-פעמיות, חומר סופג, שקית הובלה נסגרת עם סימון סיכון ביולוגי ודף הוראות (איור 1).
  2. סמנו כל מבחנת איסוף במזהה דגימה ייחודי, בתאריך ובשעת האיסוף באמצעות טוש קבוע או תווית מודפסת מראש.
  3. צרפו דף הוראות המתאר את הליך איסוף הדגימה, אמצעי זהירות בטיפול, תנאי אחסון ודרישות הובלה.
    ​הערה: בופר הייצוב מסופק כשהוא מלא מראש במבחנת איסוף הצואה כחלק מערכת איסוף הצואה. היצרן אינו חושף את הרכב בופר הייצוב או את נפחו. אספו כ-2–5 g של חומר צואה ישירות לתוך מבחנת האיסוף המלאה מראש, בהתאם להוראות היצרן.

ערכה לאיסוף דגימות צואה הכוללת כפפות, מבחנה, שקית לפסולת ביולוגית, כלי לאיסוף עלון להסבר לניתוח.
איור 1מרכיבי הערכה לאיסוף דגימות צואה. 
ערכת איסוף דגימות צואה כוללת כפפות חד-פעמיות, כולת צואה סטרילית, מבחנה סטרילית לאיסוף צואה עם פקק הברגה ושפכטל מחובר, שקית הובלה נסגרת עם סימון סיכון ביולוגי (biohazard), ועלוני הוראות הניתנים למשתתפים לצורך איסוף דגימות צואה, טיפול בהן, אחסונן והובלתן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

2. הכנת המשתתף לאיסוף דגימות

  1. הנחה את המשתתף לשטוף את ידיו לפני איסוף הדגימה.
  2. הנחה את המשתתף לרוקן את שלפוחית השתן לפני יציאהיתן כדי למנוע זיהום של דגימת הצואה בשתן.

3. איסוף דגימת צואה באמצעות תופס צואה

  1. הנח אספן צואה סטרילי על מושב השירותים כדי למנוע מגע בין דגימת הצואה למי השירותים.
  2. עבור אספני צואה דביקים, פתח את המכשיר בזהירות לאורך הקצוות המסומנים ללא קריעה. פעל לפי הוראות היצרן המצורפות לאספן הצואה, והצמד את המכשיר בבטחה לחלק האחורי של מושב השירותים כדי ליצור משטח איסוף יציב.
  3. עבור אספני צואה שאינם דביקים, מקם את המכשיר לרוחב קערת השירותים בהתאם להוראות היצרן כדי לספק תמיכה יציבה.
  4. וודא שאספן הצואה אינו בא במגע עם מי השירותים במהלך איסוף הדגימה.
  5. הנחה את המשתתף לבצע את פעולת היציאה ישירות אל תוך אספן הצואה.
  6. לבש את כפפות החד-פעמיות המצורפות לערכת האיסוף לפני הטיפול בדגימה.
  7. פתח את מבחנת האיסוף הסטרילית והשתמש בשפכטל המצורף כדי לאסוף חומר צואה מלפחות ארבעה עד חמישה אזורים נפרדים של הצואה, כולל השטח החיצוני והליבה הפנימית. גישה זו מניבה בדרך כלל כ-2–5 g של חומר צואה, כמות המספיקה להפקת DNA.
  8. הימנע מאיסוף חומר צואה שהיה במגע עם קצוות אספן הצואה או עם משטחים חיצוניים כלשהם.
  9. סגור את מבחנת האיסוף בבטחה מיד לאחר איסוף הדגימה.
  10. ערבב את דגימת הצואה היטב עם בופר הייצוב על ידי ניעור ידני נמרץ של מבחנת האיסוף הסגורה, עד שהדגימה תהיה תלויה באופן אחיד ולא יישארו גושים גדולים.
  11. הכנס את מבחנת האיסוף האטומה לתוך שקית הובלה חסינה לנזילות המסומנת כסיכון ביולוגי המכילה חומר סופג.
  12. שחרר בזהירות את אספן הצואה אל תוך השירותים יחד עם הצואה, תוך הבטחה שהתכולה לא תישפך. הפעל את ההדחה כדי להשליך את אספן הצואה והצואה יחד.

4. אחסון והובלה של דגימות צואה

  1. יש לאחסן את הדגימות בהתאם למפרטים של באפר הייצוב שבו נעשה שימוש.
  2. יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר אם באפר הייצוב תומך בשימור בתנאי סביבה. לחלופין, יש לאחסן את הדגימות ב-4°C לאחסון קצר טווח (≤24–48 h) או ב-−20°C עד −80°C לאחסון ארוך טווח.
  3. יש לאחסן את הדגימות בהתאם להמלצות היצרן. דגימות שנאספו באמצעות באפר הייצוב ששימש במחקר זה יציבות למשך עד שנתיים בטמפרטורת החדר.
  4. יש להוביל את הדגימות בשקיות סיכון ביולוגי אטומות המכילות חומר סופג למניעת דליפה וזיהום.
  5. יש לשמור על הדגימות בתנאי הטמפרטורה המומלצים במהלך ההובלה. יש להשתמש במכלים מבודדים ובאלמנטים קירור במידת הצורך.
  6. יש לוודא עמידה בהנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות ובתקנות מקומיות רלוונטיות להובלת דגימות ביולוגיות.

5. קבלה ורישום של דגימות

  1. בדוק כל דגימה עם קבלתה במעבדה כדי לוודא סימון תקין, שלמות המבחנה והיעדר סימני דליפה.
  2. הקצה מזהה ספציפי למעבדה, במידת הצורך, ורשום את תאריך ושעת האיסוף, תנאי האחסון ומשך ההובלה.
  3. הסר דגימות המראות סימני דליפה, סימון לא תקין או פגיעה בשלמותן.

6. הכנת המצעים

הערה: הכינו את כל הפלטות לפני תחילת תהליך המיצוי. בצעו את כל השלבים הכוללים ריאגנטים ודגימות ביולוגיות בסביבה נקייה תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, הכולל חלוק מעבדה, כפפות והגנה על העיניים. איור 2 מציג את מעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי (איור 2A), את מיקומי טעינת הפלטות (איור 2B), מתאם לפלטת בארות עמוקות (איור 2C), צנטריפוגה התואמת לפלטות (איור 2D), מכשיר לטחינה באמצעות חרוזי זכוכית (איור 2E), תמיכת ריפוד (איור 2F), מחזיק פלטה (איור 2G), פלטת חרוזים בעלת 96 בארות (איור 2H), פלטת בארות עמוקות (איור 2I) ופלטת אלוציה (איור 2J).

הגדרת ציוד מעבדה להכנת דגימות וניתוחן, כולל צנטריפוגה ומכשיר לליזיס של רקמות.
איור 2ציוד וחומרים מתכלים המשמשים להפקה אוטומטית של דזוקסיריבונוקלאית (DNA) מצואה. 
(A) מעבד חלקיקים מגנטיים אוטומטי. (B) מיקום טעינת הפלטה בתוך המעבד המגנטי האוטומטי. (C) מתאם לפלטת בארות עמוקות עבור סנטריפוגציה. (D) סנטריפוגה תואמת פלטות. (E) הומוגנייזר בטחינת חרוצים. (F) תמיכת ריפוד המשמשת במהלך טחינת החרוצים. (G) מחזיק (מתאם) לפלטת בארות עמוקות עבור טחינת חרוצים. (H) פלטת חרוצים בעלת 96 בארות המסופקת עם ערכת מיצוי החומצות הגרעיניות. (I) פלטת בארות עמוקות בעלת 96 בארות. (J) פלטת אלוציה בעלת 96 בארות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

  1. הוצא את פלטת מסרק הטיפים (tip comb plate) מאריזתה והשאר אותה מוכנה להטענה במכשיר.
  2. הכן את פלטת האלוציה (איור 2J>) על ידי הוספת 20 µL של באפר אלוציה (elution buffer) המסופק עם ערכת מיצוי החומצות הגרעיניות לכל באר בפלטה בעלת 96 בארות. אטום את הפלטה באמצעות סרט דביק שקוף כדי למנוע זיהום. השאר את הפלטה אטומה עד להטענתה במעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי. סמן את הפלטה כ-"פלטת אלוציה".
  3. הכן את פלטת השטיפה 4 על ידי הוספת 1 mL של 80% ethanol לכל באר בפלטת בארות עמוקות (deep-well plate). אטום את הפלטה בסרט דביק כדי למנוע התאיידות וזיהום.
  4. הכן את פלטת השטיפה 3 על ידי הוספת 1 mL של 80% ethanol שהוכן טרי לכל באר בפלטת בארות עמוקות נפרדת. אטום את הפלטה בסרט דביק.
  5. הכן את פלטת השטיפה 2 על ידי הוספת 1 mL של באפר שטיפה (wash buffer) לכל באר בפלטת בארות עמוקות. אטום את הפלטה בסרט דביק.
  6. הכן את פלטת השטיפה 1 על ידי הוספת 1 mL של באפר שטיפה (wash buffer) לכל באר בפלטת בארות עמוקות. אטום את הפלטה בסרט דביק.

7. הגדרת מעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי

  1. הפעיל את מעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי. ודא שראש המגנט המתאים ל-96 בארות עמוקות ובלוק החימום ל-96 בארות עמוקות מותקנים.
  2. הפעל את פרוטוקול בדיקת המכשיר המתאים (לדוגמה, פרוטוקול Check_96dw_tip) באמצעות מסרק טיפים נקי ופלטת בארות תואמת וריקה לפני עיבוד הדגימות.
  3. אשר כי תוכנית המיצוי הנדרשת זמינה במעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי.
    הערה: שימוש בראש מגנט או בבלוק חימום שאינם נכונים עלול להפחית את תנובת החומצות הגרעיניות ולגרום נזק למכשיר.

8. ביצוע ליזיס לדגימה

  1. הכינו מפת פלטה לרישום המיקום של כל דגימה בפלטה בעלת 96 בארות.
  2. צנטריפוגו את פלטת החרוצים בעלת 96 הבארות (איור 2H) במהירות של 2,750 × g למשך 10 s באמצעות צנטריפוגה תואמת פלטות (איור 2D) ומתאם (איור 2C) כדי לרכז את החרוצים בתחתית כל בארה.
    הערה: שלב זה מונע איבוד חרוצים בעת הסרת איטום הפלטה.
  3. הסירו בזהירות את איטום הפלטה מבלי להפריע לחרוצים.
  4. הוסיפו 80 µL של בופר ליזיס לכל בארה בפלטת החרוצים.
  5. הימנעו משאיבת החרוצים במהלך הפעולה עם הפפיטה.
  6. הפשיתו דגימות צואה קפואות בטמפרטורת החדר עד להפשרה מלאה. ערבבו את הדגימות בעדינות כדי להומוגניזציה שלהן, ועברו מיד להפקת DNA. הימנעו ממחזורי הפשרה-הקפאה חוזרים כיוון שהם עלולים להפחית את איכות ה-DNA ואת התנובה.
    הערה: עבור דגימות טריות, בצעו וורטקס לכל מבחנת דגימת צואה המכילה את תמיסת הייצוב למשך 5–10 s כדי להבטיח הומוגניזציה של הדגימה.
  7. העבירו 20 µL מכל דגימה הומוגנית לבארה המתאימה בפלטת החרוצים.
  8. השתמשו בפפיטה בעלת ערוץ בודד המצוידת בקצות פפיטה סטריליים, מסוננים ובעלי פיה רחבה (גזוזה) להעברת הדגימות. הימנעו מפפיטת חוזרת כדי למזער איבוד חרוצים והפחתה עוקבת בתנובת ה-DNA.
  9. אטמו את הפלטה היטב בעזרת סרט דביק, תוך וידוא שכל הבארות וקצוות הפלטה אטומים לחלוטין.

9. ביצוע ליזיס מכני (bead beating)

  1. הדק את הפלטה האטומה במכשיר ה-bead-beating (איור 2E>) באמצעות מחזיק הפלטה המתאים (איור 2G>) ותמיכת ריפוד (איור 2F>).
  2. אזן את המכשיר על ידי הצבת פלטה בעלת משקל שווה מול פלטת הדגימה.
  3. כוון את המכשיר ל-30 Hz למשך 2 min והפעל את התהליך.
  4. אפשר לתהליך להסתיים ללא הפרעות.
  5. הוצא את הפלטה בזהירות לאחר סיום התהליך מבלי לפגוע באטימה.
    הערה: השתמש בתמיכת הריפוד כדי למנוע נזק לפלטה במהלך ה-bead beating.

10. ביצוע עיבוד לאחר ליזיס

  1. סב את הפלטה בצנטריפוגה במהירות של 2,750 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בתצורה מאוזנת.
  2. העבר בזהירות 40 µL מהנוזל העליון (supernatant) מכל באר לפלטת בארות עמוקות חדשה המוגדרת כפלטת דגימה (Sample Plate).
  3. הימנע מהעברת חרו지를 כלשהם בשלב זה.
    הערה: פלטת הדגימה אינה מכילה חרוזים ואינה דורשת סב מקדים בצנטריפוגה.
  4. אטום את פלטת הדגימה אם אינך ממשיך מיד.
    הערה: במידת הצורך, אחסן את פלטת הליזאט האטומה ב-4°C למשך לילה. לחלופין, ניתן לאחסן את פלטת הדגימה האטומה ב-−20°C למשך עד 3 חודשים. הפסק את הקפאת הדגימות עד להגעה לטמפרטורת החדר לפני המשך העיבוד.

1. הכנת תערובת חרוזי הקישור

  1. הכינו את תערובת חרוזי הקישור מיד לפני השימוש על ידי ערבוב של 500 µL של בופר לקישור חומצות גרעין עם 20 µL של חרוזים מגנטיים לכל דגימה. ערבבו היטב לקבלת תרחיף הומוגני.
  2. חשבו את הנפח הכולל של תערובת חרוזי הקישור הנדרש בהתאם למספר הדגימות.
  3. עבור פלטה מלאה של 96 בארות, הכינו את תערובת חרוזי הקישור על ידי הוספת 48.0 mL של בופר לקישור חומצות גרעין ו-1.92 mL של חרוזים מגנטיים למבחנה קונית סטרילית. ערבבו היטב לקבלת נפח סופי של 49.92 mL (520 µL לכל בארה).
    הערה: הכינו נפח מספיק עבור בארה אחת או שתיים נוספות כדי לפצות על שונות בפיפוט.
  4. ערבבו בעדינות את תרחיף חרוזי הקישור על ידי הפיכה עד להגעה להומוגניות.
  5. העבירו את תערובת חרוזי הקישור למאגר ריאגנטים נקי.
  6. מיד לפני החלוקה, השביו את החרוזים המגנטיים לתליה על ידי פיפוט של התרחיף למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים כדי למנוע שקיעה של החרוזים.
  7. חלקו 520 µL של תערובת חרוזי הקישור לכל בארה בפלטת הדגימות המוכנה באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
  8. פפטו לאט בשל צמיגות התמיסה, והימנעו מהיווצרות בועות. השביו בעדינות את תערובת חרוזי הקישור במאגר הריאגנטים לפני כל שלב של חלוקה כדי לשמור על פיזור אחיד של החרוזים בכל הבארות.

12. שינוי תוכנית המכשיר MagMAX_Microbiome_Stool_Flex (תוכנית מיצוי שונה)

  1. הורידו והתקינו את תוכנת BindIt (תוכנה לעריכת פרוטוקולים) בהתאם להוראות היצרן.
  2. הורד את תוכנת המכשיר מאתר היצרן.
  3. הפעל את התוכנה לעריכת הפרוטוקול והמתן לסיום תהליך האתחול שלה.
  4. לחצו על Open ובחרו בתוכנית המכשיר שהורדה.
  5. שנה את פרמטרי הפרוטוקול כפי שמתואר ב- טבלה 1.
  6. שמרו את הפרוטוקול שעבר שינוי וסגרו את התוכנה.
  7. חברו את המחשב למעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי באמצעות כבל USB או כבל טורים מסוג RS-232C.
    הערה: יש לוודא כי מעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי כבוי לפני חיבור המחשב.
  8. הפעל את מעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי והמתן עד לסיום תהליך האתחול.
  9. הפעילו את התוכנה לעריכת הפרוטוקול ואשרו שהיא מזהה את המעבד האוטומטי של חלקיקים מגנטיים.
  10. העבירו את תוכנית המיצוי המעודכנת למעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי.
  11. אשרו את העברתה המוצלחת של תוכנית המיצוי המעודכנת, ולאחר מכן כבו את מעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי.
שלבפעולהפרמטרים
1קישורערבב; 5 מחזורי איסוף; 37°C
2איסוף חרוצים5 מחזורי איסוף מגנטיים
3שטיפה 1ערבב למשך 20 שניות × 3 מחזורים; 37°C
4שטיפה 2ערבבו במשך 20 שניות × 3 מחזורים; 37°C
5שטיפה 3ערבב למשך 20 שניות × 2 מחזורים; 37°C
6שטיפה 4ערבוב; מחזור אחד; 37°C
7ייבושייבוש באוויר למשך 2 דקות
8אלוציה75°C; 6 מחזורי ערבוב; חימום מקדים מופעל
9איסוף חרוצים3 מחזורי איסוף מגנטיים
10העבר את התסננת (eluate)העבר את החומצה הגרעינית המטוהרת ללוח האלוציה (Elution Plate)

טבלה 1: תוכנית מיצוי אוטומטית עבור מעבד החלקיקים המגנטיים.
סיכום של תוכנית המיצוי האוטומטית המבוצעת על ידי מעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי במהלך מיצוי חומצה דאוקסיריבנוקלאית (DNA). התוכנית כוללת קישור של חומצות גרעיניות, איסוף חרוזי מגנט, שלבי שטיפה רצופים, ייבוש באוויר, אלוציה והעברת DNA מנוקה ללוח האלוציה. פרמטרי ההפעלה עבור כל שלב אוטומטי מפורטים בטבלה.

13. ביצוע מיצוי אוטומטי של חומצות גרעין

  1. הפעל את מעבד החלקיקים המגנטיים האוטומטי (איור 2A) על ידי הדלקת אספקת הכוח הראשית ולאחר מכן לחיצה על כפתור ההפעלה של המכשיר. המתן לסיום תהליך האתחול של המערכת.
  2. באמצעות לוח הבקרה של המכשיר, בחר את תוכנית המיצוי המעודכנת והפעל את הריצה.
  3. כאשר תתבקש, טען את פלטת מסרק הקצוות (tip comb plate) לעמדה 7 ולחץ על Start כדי להמשיך. עיין בטבלה 2 עבור עמדות טעינת הפלטות (איור 2B).
  4. הסר את סרט האיטום מפלטת האלוציה (Elution Plate) וטען אותה לעמדה 6, תוך וידוא שהכיוון נכון (באר A1 מיושרת עם העמדה המיועדת). לחץ על Start כדי להמשיך.
  5. הסר את סרט האיטום מפלטת שטיפה 4 (Wash Plate 4) המכילה 80% ethanol, טען את הפלטה לעמדה 5 בכיוון הנכון, ולחץ על Start.
  6. הסר את סרט האיטום מפלטת שטיפה 3 (Wash Plate 3) המכילה 80% ethanol, טען את הפלטה לעמדה 4, ולחץ על Start.
  7. הסר את סרט האיטום מפלטת שטיפה 2 (Wash Plate 2), טען את הפלטה לעמדה 3, ולחץ על Start.
  8. הסר את סרט האיטום מפלטת שטיפה 1 (Wash Plate 1), טען את הפלטה לעמדה 2, ולחץ על Start.
  9. כאשר תתבקש, טען את פלטת הדגימות (Sample Plate) לעמדה 1, תוך וידוא שהכיוון נכון.
  10. סגור את מכסה המכשיר ולחץ על Start כדי להתחיל את ריצת המיצוי האוטומטית.
  11. המתן לסיום התוכנית ללא הפרעות (במשך כ-35–40 min).
    הערה: טבלה 1 מסכמת את תוכנית המיצוי האוטומטית המבוצעת על ידי המכשיר.
פלטהמיקוםסוג פלטהריאגנטנפח לבאר
פלטת דגימות1פלטת 96 בארות עמוקותתערובת של ליזאט דגימה + חרוזי קישור920 µL
שטיפת פלטה 12פלטת 96 בארות עמוקותבופר שטיפה1,000 µL
שטיפת פלטה 23פלטת 96 בארות עמוקותבופר שטיפה1,000 µL
שטיפת פלטה 34פלטת 96 בארות עמוקות80% אתנול1,000 µL
שטיפת פלטה 45פלטת 96 בארות עמוקותאתנול 80%1,000 µL
פלטת אלוציה6פלטה בעלת 96 בארותבופר אלוציה200 µL
פלטת מסרק לקלטים7פלטת בארות עמוקות סטנדרטיתמסרק טיפים ללוחית 96 בארות עמוקותלא רלוונטי

טבלה 2: תצורת טעינת פלטות להפקה אוטומטית של חומצות גרעין.
מיקומי טעינת פלטות, סוגי פלטות, ריאגנטים ונפחי ריאגנטים המשמשים להפקה אוטומטית של DNA באמצעות מעבד חלקיקים מגנטיים. פלטת הדגימות (Sample Plate) מכילה את הליזאט של הדגימה ותערובת חרוזי קישור. N/A מציין כי לא הוסף ריאגנט נוזלי לפלטת מסרקי הקצוות (Tip Comb Plate).

​14. אלוקוציה ואחסון של חומצות גרעיניות

  1. פתח את המכשיר לאחר סיום ההרצה והוצא בזהירות את לוח האלוציה (Elution Plate) כדי למנוע שפיכת את התסננים (eluates).
    הערה: אם נראה שאריות של חרוזי מגנט בלוח האלוציה, העבר את התסננים ללוח 96-בארים סטנדרטי והנח את הלוח על מעמד מגנטי למשך 5–10 min. העבר את העלייה (supernatant) המזוקקת ללוח 96-בארים נקי או למבחנות המסומנות באופן מתאים באמצעות פיפט רב-ערוצי.
  2. העבר את ה-DNA שאלואם למבחנות או ללוחות אחסון המסומנים באופן מתאים.
  3. אחסן את ה-DNA שאלואם בטמפרטורה של 4°C לשימוש לטווח קצר, ב-−20°C לאחסון של עד 6 חודשים, או ב-−80°C לאחסון לטווח ארוך.

15. ביצוע ניקוי לאחר ההרצה

  1. הסר את כל הפלטות המשומשות ומסרקי הקצות מהמעבד האוטומטי של החלקיקים המגנטיים.
  2. השמד את כל consumables בהתאם להנחיות המוסדיות לבטיחות ביולוגית וסילוק פסולת כימית.
  3. נקה שפיכות באמצעות חומר חיטוי מעבדתי מתאים.
  4. כבה את המעבד האוטומטי של החלקיקים המגנטיים, ולאחר מכן את ספק הכוח הראשי.

תוצאות

דגימות צואה משבעה משתפים נאספו בהצלחה באמצעות זרימת העבודה המתוארת לאיסוף, מה שהניב דגימות בעלות מסה מספקת ועקביות מתאימה לעיבוד המשכי. הדגימות אוחסנו בטמפרטורת החדר לאחר האיסוף. מרבית הדגימות הפגינו מרקם וצבע אחידים, התואמים לתנאי איסוף ואחסון נאותים, בעוד שקבוצה קטנה הראתה שונות קלה בעקביות, שעשויה לשקף שונות ביולוגית בין המשתתפים. לא נצפתה זיהום או דליפה נראים לעין במהלך ההובלה, וכל הדגימות עובדו בתוך חלון היציבות המאומת של ערכת האיסוף (עד שנתיים בטמפרטורת החדר), מה שתומך בחוסנו ובאמינותו של תהליך האיסוף (איור 1).

תהליך מיצוי ה-DNA האוטומטי בוצע באמצעות מעבד חלקיקים מגנטי אוטומטי (איור 2A), תצורת טעינת פלטה (איור 2B), מתאם לפלטת בארות עמוקות (איור 2C), צנטריפוגה תואמת פלטות (איור 2D), מכשיר לטחינה באמצעות חרוצים (איור 2E), תמיכת ריפוד (איור 2F), מחזיק פלטה (איור 2G), פלטת חרוצים (איור 2H), פלטת בארות עמוקות (איור 2I), ופלטת אלוציה (איור 2J), בהתאם לתוכנית המיצוי האוטומטית המסוכמת בטבלה 1 ולתצורת טעינת הפלטה המוצגת בטבלה 2. ריכוז ה-DNA ודרגת הניקיון שלו נבחנו עבור דגימות צואה מייצגות, והתוצאות מסוכמות בטבלה 3. ריכוז ה-DNA נמדד באמצעות בדיקת Qubit double-stranded DNA High Sensitivity (בדיקה פלואורומטרית לכימות DNA) במכשיר Qubit fluorometer (מכשיר פלואורומטרי לכימות DNA) לפי הוראות היצרן. הדגימות עורבבו עם תמיסת העבודה, דגרו במשך 2 min בטמפרטורת החדר, ונמדדו יחד עם שני תקני הבדיקה. יחסי הבליעה A260/A280 ו-A260/A230 נקבעו באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (ספקטרופוטומטר למיקרו-נפחים). ריכוזי ה-DNA נעו בין 36 ל-87 ng/µL, כאשר כל הדגימות נאלו לנפח עקבי של 20 µL, מה שאיפשר השוואה ישירה של סך השבת ה-DNA בין ההכנות (טבלה 3).

דגימהריכוז DNA
(נג/µL)		A260/A280A260/A230נפח אלוציה
(µL)		תשואת ה-DNA הכוללת
(נג)
דגימה A621.831.7120012,400
דגימה B361.891.512007,200
דגימה C871.921.8520017,400
דגימה D502.031.8720010,000
דגימה E551.971.8120011,000
דגימה F851.991.8820017,000
דגימה G442.011.512008,800
בקרת רקע למיצוי0——2000

טבלה 3: דגימות מייצגות של התאוששות וטוהר של DNA לאחר מיצוי אוטומטי מדגימות צואה אנושיות.
ריכוז DNA מייצג, טוהר (יחסי בליעה של A260/A280 ו-A260/A230), נפח אלוציה ותוצר DNA כולל שנמדדו לאחר מיצוי DNA אוטומטי מדגימות צואה אנושיות. ריכוז ה-DNA נקבע באמצעות בדיקה פלואורומטרית. בקרת הבלנק של המיצוי שימשה כביקורת שלילית ולא הניבה DNA שניתן לזיהוי.

תוצאות מייצגות הדגימו שונות בהשבת ה-DNA בין הדגימות. ריכוזי DNA גבוהים יותר התקבלו עבור Sample A (62 ng/µL), Sample F (85 ng/µL) ו-Sample C (87 ng/µL), בעוד שריכוזים בינוניים נצפו עבור Sample D (50 ng/µL) ו-Sample E (5 ng/µL). Sample B ו-Sample G הניבו את ריכוזי ה-DNA הנמוכים ביותר (36 ng/µL ו-4 ng/µL, בהתאמה). יחסי הבליעה של A260/A280 נעו בין 1.83 ל-2.03, בעוד שיחסי הבליעה של A260/A230 נעו בין 1.51 ל-1.8 (טבלה 3). שונות זו צפויה עבור דגימות צואה ועשויה לשקף הבדלים בהרכב הדגימות ושונות ביולוגית, בנוסף לשונות טכנית הקשורה לעיבוד הדגימות. בביקורת החילוץ (extraction blank) לא התקבל DNA שניתן לזיהוי, מה שמעיד על היעדר זיהום שניתן לזיהוי במהלך הליך החילוץ. הגברה מייצגת של הגן 16S rRNA החיידקי באורכו המלא כמעט הניבה את אמפליקון ה-PCR הצפוי באורך של כ-1.5 kb בדגימות DNA מצואה, בעוד שביקורת ללא תבנית (no-template control) לא הראתה הגברה (איור 3).

אלקטרופורזה של ג'ל; תוצאות PCR של 16S rRNA; סולם DNA; ניתוח תהליך הפרדת נתיבים.
איור 3אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של אמפליקונים מ-PCR של הגן של RNA ריבוזומלי 16S של חיידקים. 
ג'ל אגרוזה מייצג המראה הגברה של הגן הבקטריאלי 16S rRNA באורכו הכמעט מלא (~1.5 kb) באמצעות הפריימרים אוניברסליים 27F ו-1525R לאחר מיצוי DNA מדגימות צואה אנושיות. נתיב M: סולם DNA של 100 זוגות בסיסים (bp); נתיב 1: ביקורת ללא תבנית (blank); נתיבים 2–8: דגימות DNA מייצגות מצואה המראות את תוצר ה-PCR הצפוי בגודל של ~1.5 kb. אנא לחצו כאן להצגת גרסה מורחבת של איור זה.

יישום מוצלח של פרוטוקול זה מודגם על ידי השחזור של DNA מדיד המתאים ליישומים מולקולריים המשכיים, כולל בדיקות מבוסות PCR, ריצוף של גן 16S rRNA, ריצוף מטגנומי מסוג shotgun והכנת ספריות. יחד, תוצאות מייצגות אלו מדגימות כי הפרוטוקול משחזר DNA באופן עקבי מדגימות צואה אנושיות, תוך הצגת טווח השונות שעלול להופיע בין דגימות ביולוגיות.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מספק זרימת עבודה סטנדרטית לאיסוף דגימות צואה אנושיות ולהפקה אוטומטית של DNA למחקרי מיקרוביום. שלבים קריטיים כוללים דגימה מייצגת של צואה מאזורים מרובים של הצואה, הומוגנציה יסודית עם בופר ייצוב, אחסון והובלה נאותים תחת התנאים המומלצים, ליזיס מכנית יעילה וטיפול זהיר במהלך ההפקה האוטומטית. הקפדה עקבית על שלבים אלו ממזערת שונות טכנית ותומכת בהשגה שחזירה של DNA. מחקרים קודמים זיהו באופן דומה את איסוף הדגימות, תנאי האחסון, ההומוגנציה והפקת ה-DNA כמקורות עיקריים לשונות בניתוחי מיקרוביום, והדגישו את חשיבותן של זרימות עבודה סטנדרטיות לקבלת תוצאות שחזירות5,6,7,8. התוצאות המייצגות מדגימות איסוף דגימות מוצלח ללא זיהום או דליפה נראים, והשגה מדידה של DNA בכל הדגימות שנבדקו.

מספר גורמים פרוצדורליים יכולים להשפיע על השחזור של ה-DNA ויש להתחשב בהם במהלך היישום. ליזה מכנית או כימית לא מספקת, הומוגניזציה חלקית, קישור לא יעיל של חומצות גרעיניות, או אובדן דגימה במהלך שלבי ההעברה והשטיפה עלולים להפחית את תנובת ה-DNA. שונות בהרכב הצואה, בביומסה המיקרוביאלית ובעקביות הדגימה עשויות אף הן לתרום להבדלים בשחזור ה-DNA בין דגימות. לכן, ביצוע קפדני של הפרוטוקול, במיוחד במהלך הומוגניזציית הדגימה, טחינת חרוצים (bead beating) ומיצוי אוטומטי, הוא חשוב להשגת תוצאות עקביות. פתרון בעיות (Troubleshooting) צריך להתמקד באימות הכנת הרכיבים, הגדרת המכשיר, טעינת הפלטה וביצוע תוכנית המיצוי האוטומטית לפני עיבוד הדגימות. המלצות דומות דווחו במחקרים שהעריכו תהליכי עבודה אנליטיים של מיקרוביום ומתודולוגיות למיצוי DNA5,6,7,8,1.

המגבלה העיקרית של שיטה זו היא השונות שנצפתה בתשואת ה-DNA בין דגימות ביולוגיות. כפי שמוצג בתוצאות המייצגות, הבדלים בריכוז ה-DNA עשויים לשקף שונות ביולוגית מולדת בין דגימות צואה, כמו גם שונות טכנית שהוכנסה במהלך עיבוד הדגימות. כתוצאה מכך, אין להסתמך על ריכוז ה-DNA לבדו כאינדיקטור יחיד לביצועי המיצוי. ייתכן שיידרשו מדדים נוספים לאיכות ה-DNA ולהתאמתו, בהתאם ליישום המולקולרי המתוכנן בהמשך. כדי להעריך באופן מעמיק יותר את איכות ה-DNA והתאמתו לניתוחים מולקולריים עוקבים, בוצע הגברה של הגן הבקטריאלי 16S rRNA באמצעות PCR עם הפרימרים האוניברסליים 27F ו-1525R. הגברה מוצלחת של מקטע גן 16S rRNA באורך צפוי של כ-1.5 kb אושרה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 3>), מה שמעיד על כך שה-DNA שמוצ). ה-DNA הממוצץ היה באיכות מספקת ליישומים עוקבים, כולל ריצוף ובדיקות מולקולריות אחרות. מחקרי השוואה קודמים הראו באופן דומה שתשואת ה-DNA אינה בהכרח במתאם עם ביצועי הריצוף העוקבים או עם דיוק פרופיל המיקרוביום8,1.

בהשוואה לזרימות עבודה של מיצוי ידני, מעבדים אוטומטיים המבוססים על חלקיקים מגנטיים מפחיתים את העבודה הידנית, מתקיפים את תנאי המיצוי ותומכים בעיבוד דגימות בתפוקה גבוהה, תוך מזעור השונות התלויה במבצע9,10. עם זאת, הבדלים בעקביות הצואה ובביומסה המיקרוביאלית עשויים להשפיע על יעילות הליזיס ועל תנובת ה-DNA. בנוסף, מיקרואורגניזמים בעלי דפנות תא חזקות עלולים שלא לעבור ליזיס מלא, מה שעשוי להשפיע על הייצוג של טקסונים מסוימים. למרות מגבלות אלו, מיצוי אוטומטי מספק גישה חסונה ויעילה למחקרי מיקרוביום של המעי בקנה מידה גדול5,6,7,8,9,10. הפרוטוקול הנוכחי משלב איסוף סטנדרטי של דגימות צואה עם זרימת עבודה אוטומטית למיצוי DNA, ומספק גישה מעשית וניתנת לשחזור למחקרי מיקרוביום הדורשים עיבוד עקבי של מספר רב של דגימות. מתודולוגיות סטנדרטיות כגון זו מקלות על השחזור בין מחקרים שונים ומתאימות היטב ליישומים מולקולריים המשכיים, כולל פרופיל מיקרוביום, ריצוף מטאגנומי ואנליזות אחרות המבוסות על ריצוף5,6,7,8,9,10.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פינסיים או לא-פינסיים.

תודות

אנו מודים בערכה ל-SKAN Research Trust (India) על אספקת המשאבים והסביבה השיתופית שאפשרו את ביצוע עבודה זו. אנו מודים גם לד"ר Anushree Kogje על סיועה בבדיקת העובדות ובסיוע העריכתי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול 80% (הוכן מאתנול מוחלט)MerckET01610יש להכין טרי מאתנול מוחלט כפי שמתואר בפרוטוקול.
חומר סופגKimtech34256כלול בתיק ההובלה.
סרט איטום דביק לפלטותApplied Biosystems4306311סרט דביק שקוף MicroAmp.
מעבד חלקיקים מגנטיים אוטומטי (מערכת KingFisher Flex Purification עם ראש של 96 בארות עמוקות)Thermo Fisher Scientific5400630מערכת אוטומטית למיצוי חומצות גרעין.
שקית הובלה ניתנת לאטימה עם סימון סיכון ביולוגי (Biohazard)Zymo ResearchR180שקית הובלה עמידה לדליפות להובלת דגימות.
תוכנת BindItThermo Fisher Scientific5189009תוכנה המשמשת לשינוי ולהעברה של פרוטוקול המיצוי האוטומטי.
מבחנה לאיסוף עם שפכטל מחובר (30–50 מ"ל)Zymo ResearchR180מבחנת איסוף סטרילית עם פק הברגה.
תמיכה ממתן*QIAGEN69984סט מתאמים ל-TissueLyser (משים כתמיכה בולמת זעזועים במהלך טחינה באמצעות חרוצים).
פלטת בארות עמוקות (96 בארות)Thermo Fisher Scientific95040460פלטת KingFisher Deepwell 96.
כפפות חד-פעמיותZymo ResearchR180מומלץ ללא אבקה.
בופר אלוציהApplied BiosystemsA42357סופק כחלק מהערכה לבידוד חומצות גרעין MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
לוכד צואהZymo ResearchR180מכשיר איסוף סטרילי.
בלוק חימום (96 בארות עמוקות)Thermo Fisher Scientificסופק עם המכשיררכיב של מערכת הניקוי KingFisher Flex.
חלוק מעבדהספק מקומילא רלוונטיציוד מיגון אישי.
בופר ליזיסApplied BiosystemsA42357סופק כחלק מהערכה לבידוד חומצות גרעין MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
חרוזי מגנטApplied BiosystemsA42357מסופק עם ערכת MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
ראש מגנטי (96 בארות עמוקות)Thermo Fisher Scientificכלול ב-540630ראש מגנטי עם 96 בארות עמוקות המסופק עם מערכת KingFisher Flex.
מעמד מגנטי (96 בארות)Thermo Fisher Scientific1232Dנדרש רק במידה ונצפה שארית של חרו지를 מגנטיים (magnetic bead carryover).
פיפטה רב-ערוציתEppendorf3125000052תואם לפלטות של 96 בארות.
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-Wמש לקביעת היחסים A260/280 ו-A260/230.
בופר לקישור חומצות גרעיניותApplied BiosystemsA42357מסופק עם ערכת MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
טוש קבועSharpie3002לחלופין, ניתן להשתמש בתוויות מודפסות מראש.
טיפים לפיפט, מסוננים סטריליים (10 µL)Tarsons528100טיפי סינון סטריליים עם מדש).
טיפים לפיפט, מסוננים וסטריליים (200 µL)Tarsons528104טיפים עם פילטר סטריליים במדורגות נפח.
טיפי פפיטה, מסוננים סטריליים (1,000 µL)Tarsons529106טיפים עם מסנן סטריליים; יש לחתוך כדי להכין טיפים בעלי פתח רחב (wide-bore) במקומות שצוין בפרוטוקול.
מתאם פלטות לצנטריפוגהEppendorf5820710004מתאם לפלטת בארות עמוקות עבור רוטור A-2-DWP-AT.
צנטריפוגה תואמת פלטותEppendorf5810תואם למתאם Rotor A-2-DWP-AT.
מחזיק פלטות לטחינת חרוצים (bead beating)QIAGEN69984ערכת מתאמים ל-TissueLyser 2 × 96.
תוויות מודפסות מראש (אופציונלי)בריידיBBP12חלופה לטוש קבוע.
בדיקת Qubit dsDNA HS AssayThermo Fisher ScientificQ3231בדיקה פלואורומטרית המשמשת לכימות DNA.
פלואורומטר QubitThermo Fisher ScientificQ327מכשיר המשמש לכמתות DNA בשיטה פלואורומטרית.
מאגר ריאגנטיםThermo Fisher Scientific8093מאגר ריאגנטים למטריצה.
בופר לייצוב דגימותZymo ResearchR180ערכה לאיסוף צואה מסוג DNA/RNA Shield.
מבחנה קונית סטריליתHiMediaTCP106Hמש להכנת תערובת חרוזי הקישור.
הומוגניזטור במערכת טחינת חרוצים TissueLyser IIIQIAGEN9003240מכשיר לליסיס מכנית.
פלטת מסרק לפיפטותThermo Fisher Scientific97002534מסרק טיפים KingFisher 96 עבור מגנטים לבארות עמוקות.
בופר שטיפהApplied BiosystemsA42357מסופק עם ערכת MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.

מקורות

  1. Joshi D, et al. Roles of human gut microbiota in metabolic, neurodegenerative, cardiovascular and gastrointestinal diseases. Discov Biotechnol. 2026;3(1):8. doi:10.1007/s44340-026-00053-2.
  2. Jin X, et al. Gut microbiota and Parkinson’s disease: exploring pathogenesis and potential therapeutic strategies from a gut-brain axis perspective. iScience. 2026;29(2):114185. doi:10.1016/j.isci.2025.114185.
  3. Hou K, et al. Microbiota in health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):135. doi:10.1038/s41392-022-00974-4.
  4. Valencia S, et al. Human gut microbiome: a connecting organ between nutrition, metabolism, and health. Int J Mol Sci. 2025;26(9):4112. doi:10.3390/ijms26094112.
  5. Panek M, et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota: effects of collection, storage, DNA extraction and next-generation sequencing technologies. Sci Rep. 2018;8(1):5143. doi:10.1038/s41598-018-23296-4.
  6. Ece G, et al. Basic microbiome analysis: analytical steps from sampling to sequencing. Microorganisms. 2026;14(2):387. doi:10.3390/microorganisms14020387.
  7. Bharti R, Grimm DG. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Brief Bioinform. 2021;22(1):178-193. doi:10.1093/bib/bbz155.
  8. Zoruk P, et al. Impact of DNA extraction techniques and sequencing approaches on microbial community profiling accuracy. Front Microbiomes. 2025;4:1688681. doi:10.3389/frmbi.2025.1688681.
  9. Wallinger C, et al. Evaluation of an automated protocol for efficient and reliable DNA extraction of dietary samples. Ecol Evol. 2017;7(16):6382-6389. doi:10.1002/ece3.3197.
  10. Kwa WT, Sim CK, Low A, Lee JWJ. A comparison of three automated nucleic acid extraction systems for human stool samples. Microorganisms. 2024;12(12):2417. doi:10.3390/microorganisms12122417.
  11. Demkina A, et al. Benchmarking DNA isolation methods for marine metagenomics. Sci Rep. 2023;13(1):22138. doi:10.1038/s41598-023-48804-z.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNA16S rRNAShotgun

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.