פרוטוקול זה מתאר שיטה הניתנת לשחזור לבידוד והתרבית של תאי שריר חלק ראשוניים מהאורטה של עכבר מאזורים חזיים ובטניים. השיטה מניבה תאים חיוניים המתאימים למחקרים in vitro של שכתוב כלי דם וביולוגיה הקשורה למפרצת.
מאמר שיטה
בידוד וגידול של תאי שריר חלק ראשוניים מהאאורטה של עכברים למחקרים In vitro הרלוונטיים לשכתוב כלי דם ולביולוגיה של מפרצת באאורטה
במאמר זה
סיכום
תקציר
בידוד וגידול של תאי שריר חלק ראשוניים של אבי העורקים (SMCs) מספקים גישה בעלת ערך לחקירת המנגנונים התאיים העומדים בבסיס מחלות וסקולריות, כולל מפרקוטיות של אבי העורקים. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ואופטימלי לבידוד וגידול של תאי SMC של אבי העורקים מעכברים, מחלקים של אבי העורקים בחזה ובבטן. ההליך הנוכחי כולל דיסקציה קפדנית של אבי העורקים, הסרה של רקמה מקיפה, ועיכול אנזימטי דו-שלבי באמצעות קולגנאז, אלסטאז ומעכב טריפסין מסויה, ולאחריו דיסוציאציה מכנית והרחבת תאים תחת תנאי תרבית מוגדרים. דגש מיוחד ניתן לשלבים המשפרים את תנובת התאים, את טוהרם ואת ההדירות של התוצאות, כולל הסרת ה-adventitia ותזמון מבוקר של העיכול. באמצעות גישה זו, ניתן לבודד ולהרחיב בהצלחה תאי SMC ראשוניים, המציגים מורפולוגיה ודפוסי צמיחה אופייניים. פרוטוקול זה מספק גישה הדירה וניתנת להתאמה להפקת תאי SMC ראשוניים של אבי העורקים, ומשמש כפלטפורמה למחקרי in vitro הרלוונטיים לשחזור וסקולרי ולביולוגיה של מפרקוטיות אבי העורקים.
מבוא
תאי שריר חלק של אבי העורקים (SMCs) הם מרכיבים חיוניים של דופן כלי הדם, התורמים הן לשלמות המבנית והן לוויסות התפקודי של אבי העורקים. בכלי דם בריאים, ה-SMCs שומרים על פנוטיפ כיווצי המאופיין בביטוי של חלבוני כיווץ כגון α-smooth muscle actin (α-SMA) ו-smooth muscle myosin heavy chain (MYH11)1,2,3. פנוטיפ זה תומך בטון הווסקולרי ומשמר את ארגון המטריצה החוץ-תאית. עם זאת, במצבים פתולוגיים כגון מפרצת באב העורקים הבטני (AAA), ה-SMCs עוברים מודולציה פנוטיפית לעבר מצב סינתטי ופרו-דלקתי1,2,3. מעבר זה קשור להגברה של השגחה, הפרשת ציטוקינים וייצור של אנזימים מפרקי מטריצה, התורמים בסופו של דבר להחלשת דופן אבי העורקים4,5.
מודלים של בעלי חיים, כולל השראה של היווצרות מפרצת באבי העורקים באמצעות angiotensin II (Ang II), קידמו משמעותית את ההבנה של הפתוגנזה של AAA1,6,7,8,9,10,11. עם זאת, מודלים אלו אינם מאפשרים מניפולציה מדויקת של מסלולים תאיים או תצפית ישירה על מנגנונים ספציפיים ל-SMC. מערכות In vitro המשתמשות בתאי SMC ראשוניים מספקות גישה משלימה, המאפשרת חקירה מפורטת של מסלולי סיגנלינג, בקרה גנטית ותגובות תאיות תחת תנאים מבוקרים12.
למרות תועלתם, בידוד של SMCs ראשוניים מאורטות של עכברים הוא מאתגר מבחינה טכנית. הגודל הקטן של האורטה בעכברים, נוכחותם של רקמת שומן ורקמת חיבור מסביב, והפוטנציאל לזיהום על ידי פיברובלסטים מהאדוונטיציה (adventitia) עלולים לפגוע בטוהר התאים. בנוסף, יש לשלוט בקפידה בעיכול האנזימטי כדי לאזן בין דיסוציאציית הרקמה לבין שימור חיוניות התאים. שונות בשלבים אלו מובילה לעיתים קרובות לתוצאות לא עקביות בין ניסויים ומעבדות שונות.
פורסמו מספר פרוטוקולים המתארים בידוד וגידול של תאי שריר חלק ראשוניים מהאביס של עכברים; רובם מסתמכים על הסרה מכנית מלאה של השכבה החיצונית (adventitia) לפני עיכול אנזימטי, ומתמקדים בעיקר באביס שלם או במקטעי אביס חזי.13,14הפרוטוקול הנוכחי מתבסס על שיטות אלה על ידי שילוב של מספר שיפורים טכניים, הכוללים שלב קצר של עיכול אנזימטי מקדימה כדי להקל על הפרדת השכבות האדוונטיציאליות (adventitial) והמדיאליות (medial) לפני דיסוציאציה מלאה של הרקמה, תנאי עיכול סטנדרטיים עם דיסוציאציה מכנית עדינה לסירוגין, וזרימת עבודה לבידוד וגידול נפרדים של תאי שריר חלק של אבי העורקים מהחזה (THX) ומהבטן (ABD). יחד, שיפורים אלה נועדו לשפר את העקביות והשחזוריות של עיבוד הרקמה, תוך שהם מקלים על מחקרים ספציפיים לאזור של שכתוב כלי דם וביולוגיה של מפרכיות. תרביות ה-SMC המתקבלות מתאימות למגוון רחב של יישומים המשכיים, כולל השתקה גנטית, מחקרים פרימקולוגיים ובדיקות מכניסטיות הרלוונטיות לשכתוב כלי דם וביולוגיה של מפרכיות. בעוד שתאי SMC ראשוניים שבודדו מאבי עורקים שאינם חולים אינם משקפים מטבעם פנוטיפים של מפרכיות, הם מספקים באופן מבוקר in vitro מערכת לחקירת מסלולים תאיים המעורבים בהתפתחות מפרצת בעקבות מניפולציה ניסיונית ממוקדת.
פרוטוקול
עכברים נקבות בוגרות מסוג C57BL/6J, בני 8 עד 10 שבועות ושוקלות 18–20 גרם, שימשו לפרוצדורה המתוארת להלן. שני עכברים שימשו לכל בידוד. כל הפעולות בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם (IACUC) באוניברסיטת קנטקי ואושרו תחת פרוטוקול מס' 2022-4153. פרטי כל הריאגנטים והציוד ששימשו רשומים ב- טבלת חומריםסקירה סכמטית של תהליך העבודה המלא לבידוד ותרבית מוצגת ב- איור 1.
זהירות: Ketamine ו-xylazine הם חומרים מבוקרים ויש לטפל בהם, לאחסנם ולהשליכם בהתאם למדיניות המוסדית ולתקנות הרלוונטיות. Collagenase type II ו-elastase הם אנזימים פרוטאוליטיים שעלולים לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובמערכת הנשימה. Trypan blue הוא צבע מסוכן ויש לטפל בו תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים ומניעת מגע עם העור והעיניים. יש לטפל בכל הריאגנטים המסוכנים ולהשליכם בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות ולהוראות היצרן.
1. הכנת ריאגנטים ומצעי גידול
- הכינו 10 mL של תמיסת עיכול אנזימטית טריאה ביום הבידוד, בתוך מבחנה קונית סטרילית של 15 mL:
- הוסיפו 10 mg קולגנאז מסוג II (ריכוז סופי של 1 mg/mL) (ראו את טבלת החומרים).
- הוסיפו 10 mg מעכב טריפסין מפולי סויה (ריכוז סופי של 1 mg/mL) (ראו את טבלת החומרים).
- הוסיפו 71 µL של תמיסת אלסטאז (ריכוז סופי של 0.744 U/mL) (ראו את טבלת החומרים).
- הכינו את התמיסה ב-HBSS המכיל סידן ומגנזיום ללא פנול אדום (ראו את טבלת החומרים).
- הוסיפו 100 µL של פניצילין/סטריפטומייצין (1% מהנפח הסופי) (ראו את טבלת החומרים).
- ערבבו את התמיסה היטב ועקרו אותה באמצעות סינון במסנן מזרק ניילון של 0.2 µm (ראו את טבלת החומרים).
- הכינו מצע גידול מלא לתאי SMC (נפח של 500 mL)
- הוסיפו 385 mL של Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) ללא פנול אדום (ראו את טבלת החומרים) כמצע בסיס.
- הוסיפו 100 mL של סרום בקר עוברי (FBS) שעבר טיפול בפחם/דקסטראן (20% מהנפח הסופי) (ראו את טבלת החומרים).
- הוסיפו 10 mL של פניצילין/סטריפטומייצין (2% מהנפח הסופי) (ראו את טבלת החומרים).
- הוסיפו 5 mL אמפוטריצין B (1% מהנפח הסופי) (ראו את טבלת החומרים).
- עקרו את המצעים באמצעות סינון ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 °C.
- חממו מראש את כל הריאגנטים ל-37 °C לפני השימוש.
2. הכנה לעיבוד רקמה
- חלק מראש את תמיסת עיכול האנזים באופן שווה ל-4 בארות (2.5 מ"ל לכל אחת) של פלטת תרבית בעלת 6 בארות, וחמם מראש באינקובטור ב- 37 °C עם 5% CO₂ לפני עיבוד הרקמה. יש להקצות 2 בארות כ'THX' ו-2 בארות כ-'ABD' עבור מקטעי אבי העורקים. ניתן לעבד מספר מקטעים מאותו אזור אנטומי בתוך באר אחת.
- הכינו שתי צלחיות תרבית נפרדות (ראו טבלת חומרים) המכילות מצע גידול מלא לתאי SMC, וסמנו אותן THX ו-ABD.
- חממו מראש צלחות תרבית המכילות מצע גידול באינקובטור עם לחות.
- הכינו מראש 20 מ"ל של HBSS סטרילי עבור פרפוזיה כלי דם וטיפול ברקמות.
- הכינו 2 צלחאי תרבית נוספים, המכילים כל אחד 3 מ"ל של HBSS, לצורך ניקוי רצופי של האורטות המבודדות.
- הכינו מבחנות קוניות של 15 מ"ל עם תוויות (ראו טבלת חומרים) המכילים 5 מ"ל של HBSS כל אחד, לאחסון זמני והפרדה של מקטעי אבטיה (aorta) של THX ו-ABD.
- יש לעקר את המכשירים הכירורגיים בין בעלי חיים באמצעות שטיפה בדטרגנט, שטיפה במים מזוקקים, חיטוי באתנול 70% ועיקור באמצעות מכשיר עיקור בחרוזי זכוכית (ראו טבלת חומרים).
3. הכנת בעלי חיים ודיסקציה של אבי העורקים
- הרדם את העכברים באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית (IP) של ketamine (300 mg/kg) ו-xylazine (30 mg/kg) (ראו טבלת חומרים), כפי שאושר תחת פרוטוקול 2022-4153 של ה-IACUC באוניברסיטת קנטקי להליכים סופיים.
- וודא את עומק ההרדמה המספק על ידי היעדר תגובת רפלקס לצביטה בבוהן.
- סטריליז והש את שטח הניתוח באמצעות 70% ethanol.
- בזמן הרדמה כירורגית עמוקה, בצע קטילת חסד לעכברים על ידי דימום דרך דקירה של הלב, ולאחריה פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם HBSS, בהתאם להנחיות המוסדיות וה-AVMA.
- פתח את חלל בית החזה ובצע דקירה של הלב לאיסוף דם.
- בצע פרפוזיה למערכת כלי הדם דרך החדש השמאלי באמצעות מזרק של 10 mL מצויד במחט 25-gauge להזרקה איטית של 10 mL HBSS סטרילי. מומלץ קצב פרפוזיה של כ-0.5 mL/s כדי להבטיח הסרה יעילה של שאריות דם.
- הסר בזהירות את האיברים הסובבים (כבד, ריאות, טחול, מערכת העיכול, כליות). השאר חלק מהסרעפת מחובר לאבי העורקים (aorta).
- בודד את ה-aorta משורש האבי העורקים ועד לפיצול האיליאקי (iliac bifurcation) יחד עם הסרעפת השלמה. הסרעפת משמשת כגבול האנטומי בין אזורי ה-THX וה-ABD (איור 2B).
- העבר את ה-aorta מיד ל-HBSS סטרילי (איור 2A).
4. ניקוי וסגמנטציה של אבי העורקים
- הנח את צלחית התרבית הסטרילית המכילה את האורטה תחת מיקרוסקופ דיסקציה (ראה טבלת חומרים).
- הסר בזהירות רקמה שומנית ורקמה חיבורית באמצעות פינצטה עדינה (ראה טבלת חומרים).
- הפרד את האורטה למקטעים THX ו-ABD.
הערה: מקטע ה-THX משתרע מאזור האורטה מעט מעל הסרעפת ועד לשורש האורטה, בעוד שמקטע ה-ABD משתרע מאזור האורטה מעט מתחת לסרעפת ועד לפיצול האיליאקי (איור 2B). - העבר את המקטעים שנוקו אל מבחנות קוניות נפרדות של 15 mL המכילות HBSS רענן להמשך העיבוד.
5. עיכול אנזימטי ובידוד תאים
- הדגרו את מקטעי האאורטה בתמיסת האנזים בטמפרטורה של 37 °C למשך 8–10 דקות.
- הוציאו את מקטעי האאורטה מתמיסת האנזים.
- העבירו את המקטעים לכלי תרבית נפרדים המכילים מצע גידול SMC מלא המיועד לדגימות THX ו-ABD.
- הסירו את שכבת האדוונטיציה (adventitial layer) מהאאורטה באמצעות פינצטות גסות ועדינות. הסרה מלאה של האדוונטיציה מאומתת כאשר פני השטח החיצוניים של האאורטה נראים חלקים ושקופים, ללא רקמת חיבור או רקמת שומן שאריות נראית לעין (איור 2C).
- העבירו את מקטעי האאורטה לתמיסת אנזים טרייה וקצצו את השכבה המדיאלית (medial layer) לפרגמנטים קטנים ישירות בתוך התמיסה (איור 3A).
- הדגרו את פרגמנטים הרקמה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO₂ למשך שעה אחת.
- בצעו דיסוציאציה מכנית עדינה על ידי פיפטינג (שאיבה והזרקה) למעלה ולמטה כ-10–15 פעמים כדי להקל על שחרור התאים (איור 3B).
- חזרו על שלב הדיסוציאציה המכנית במרווחים של 30–60 דקות במהלך ההדגרה המשיכה, למשך זמן עיכול כולל של 2–3 שעות או עד לקבלת סספנסיית תאים הומוגנית.
6. איסוף תאים, שטיפה, זריעה ותרבית ראשונית
- העבירו את תמיסת העיכול האנזימטי המכילה תאים מופרדים לשפופרות קוניות נפרדות בנפח 15 mL (ראו טבלת חומרים) המיועדות לדגימות THX ו-ABD.
- שטפו כל באר עיכול עם 5 mL של מצע גידול ושלבו את הנוזל בשפופרות המתאימות.
- סבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה במהירות של 400 × g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזרו על הסבב בצנטריפוגה אם היווצרות המשקוע אינה מספקת.
- הסירו את העילוי מבלי להפריע למשקע התאים (איור 3C).
- השביחו מחדש את התאים עם 5 mL של מצע גידול טרי ובצעו שלב שטיפה נוסף ולאחריו סבב בצנטריפוגה באותם תנאים.
- הסירו את העילוי והשביחו מחדש את משקע התאים הסופי בנפח מתאים (בדרך כלל 6 mL) של מצע גידול מלא ל-SMC.
- העבירו את כל תרחיף התאים שהתקבל מקטע אבי העורקים החזי או הבטני לשתי בארות של פלטת תרבית בעלת 6 בארות (3 mL מצע תרחיף לבער) והדגרירו ב-37 °C עם 5.0% CO₂. התאים נזרעים מיד לאחר הבידוד ללא ספירה מוקדמת של התאים; לפיכך, בשלב זה לא נעשה שימוש בצפיפות זריעה יעדית.
- שמרו את התרביות ללא הפרעה למשך 5–7 ימים כדי לאפשר היצמדות של התאים והתרחבות ראשונית.
נקודת עצירה: לאחר הזריעה, ניתן לשמור את התרביות באינקובטור למשך 5–7 ימים לפני המעבר לשלבי תחזוקת התאים וההרחבה המפורטים בסעיף 7.
7. תחזוקה והרחבת תאים
- החלף את מצע הגידול כל 3–4 ימים.
- עקב באופן קבוע אחרי מורפולוגיית התאים וההצפיפות (confluence).
- בצע מעבר תאים (passage) כאשר הם מגיעים להצפיפות של כ-80%–90%.
- שאב את מצע הגידול ושטוף את התאים ב-phosphate-buffered saline (PBS) מחומם מראש (ראה טבלת חומרים).
- הוסף 0.05% trypsin-EDTA והדגר ב-37 °C למשך 5–10 דקות.
- המשך בתהליך כאשר 80%–90% מהתאים ניתקו.
- הקש בעדינות על פלטת הגידול כדי להקל על הניתוק.
- הוסף נפח שווה של מצע גידול מלא כדי לנטרל את ה-trypsin.
- בצע פיפוט עדין כדי לנתק את התאים שנותרו.
- העבר את תרחיף התאים למבחנות קוניות וסבב בצנטריפוגה ב-400 × g למשך 5 דקות.
- הסר את העלייה (supernatant) ותלה את משקע התאים במצע גידול טרי.
- זריע את התאים ביחס של 1:2 (או בצפיפות הניסויית הרצויה) והדגר ב-37 °C עם 5% CO₂. אפשר לתאים להיצמד ללא הפרעה למשך 24–48 שעות.
הערה: עבור ניסויים המשכיים, השתמש בתאים בין מעברים 3 ל-7 (P3–P7) כדי למזער סחף פנוטיפי המושרה על ידי התרבית. תאים מעבר למעבר 7 נוטים יותר לסחף פנוטיפי ועשויים להפגין מורפולוגיה ותפקוד משתנים.
8. תיקוף באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה ל-α-SMA
- גדלו תאים על חומר המתאים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- שתלו תאים בלוח 96 בארות בעל תחתית אופטית בריכוז של 15,000 תאים לבערה. אפשרו לתאים לגדול עד להשגת רמת ההתמזגות (confluency) הרצויה.
- הכן את התאים לקיבוע
- שאבו את מצע התרבית מתאי הדבקים. שטפו 3 פעמים עם 200 µL לכל באר של תמיסת סלין במאזן Tris עם 0.1% Tween 20 (TBS-T) למשך 5 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן שאיבה באמצעות שואב של מ 빠르게 מטא ביולוגית.
- קיבוע תאים
- הוסף 200 µL לכל באר של 4% פראפורמאלדהיד (PFA) ב-1x PBS. הדגירה תתבצע למשך 10–20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן יש לשאוב את הנוזל.
- חדירות (Permeabilization)
- הוסף 200 µL לכל באר 0.1% Triton X-100 ב-1x PBS. יש להדגיר למשך 10–15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשאוב.
- חסימת קישור לא ספציפי
- שטוף את התאים 3 פעמים עם 200 µL לכל באר של TBS-T למשך 5 דקות לכל שטיפה. הוסף 200 µL לכל באר של 5% אלבומין משרת בקר (BSA) ב-TBS-T.
- הנח את הפלטה על מנער מסובב (orbital shaker) במהירות של כ-200 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- צביעה בנוגדן ראשוני
- הכינו את הראשוני α-נוגדן SMA בדילול של 1:1,000 ב-5% BSA ב-TBS-T.
- הוצא את הפלטה מהשייקר האורביטלי ושאב את תמיסת החסימה מהבארים המיועדות ל- α-צביעת SMA. עבור ביקרת נוגדן משני בלבד, השמיטו את הנוגדן הראשוני והשאירו את באר הביקורת ב-5% BSA ב-TBS-T.
- הוסף 200 µL לכל באער של הנוגדן הראשוני המדולל αנוגדן SMA לבארות הניסוי. דגרו את בארות הניסוי ובארות ביקורת הנוגדן המשני בלבד למשך לילה ב- 4 °C במנער מסלול (Orbital Shaker) בעדינות.
- צביעה בנוגדן משני
- הכינו את הנוגדן המשני הפלואורסצנטי בדילול של 1:2,500 ב-TBS-T המכיל 0.1% Tween 20.
- הוצא את הפלטה מהמנער האורביטלי ושאב את כל הבארות.
- שטפו את כל הבארים 3 פעמים עם 200 µL לכל באר של TBS-T למשך 5 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן לשאוב.
- הוסף 200 µL לכל באר מהנוגדן המשני הפלואורסצנטי המדולל לכל הבארות, כולל בקרת הנוגדן המשני בלבד.
- הגנו את הפלטה מאור והדגרו אותה במכשיר ניעור מסובב (orbital shaker) במהירות של כ-200 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- צביעה גרעינית وديמוי פלואורסצנטי
- הכן/הכיני 2 µg/mL תמיסה של Hoechst 33342.
- שטוף את התאים 3 פעמים באמצעות 200 µL לכל באר של TBS-T למשך 5 דקות לכל שטיפה. הוסיפו כמות מספקת של תמיסת צביעה Hoechst 33342 כך שתכסה את התאים, והדגרימו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור.
- הגניבו תמונות פלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך בהגדלה של 20x עבור αתרביתי THX ו-ABD שנצבעו ב-SMA, ובגדלה של 10x עבור בישורי הנוגדן המשני בלבד, תוך שימוש בעירור של 385 ננומטר עבור Hoechst 33342 ועירור של 475 ננומטר עבור הנוגדן המשני המצומד לפלואורופור. בישורי הנוגדן המשני בלבד דוגמו ב-10x כדי לכלול מספר מספיק של גרעינים בשדה הראייה.
- כימות של αתאים חיוביים ל-SMA.
- הערכה α- חיוביות ל-SMA על ידי ספירת גרעינים חיוביים ל-Hoechst הקשורים לתאים המראים ביטוי ברור של α-צביעה ציטופלזמית בצורת כישורה חיובית ל-SMA. יש לדרג תאים עם אות פלואורסצנטי מעורפל או לא מוגדר באופן שמרני כ- α-SMA שלילי.
- חשב αחיוביות ל-SMA כמספר ה- αמספר התאים החיוביים ל-SMA חלקי המספר הכולל של גרעינים חיוביים ל-Hoechst שנספרו בכל השדות המיקרוסקופיים שנבדקו, כשהתוצאה מוכפלת ב-100.
תוצאות
בתוך 24–48 שעות לאחר הבידוד, תת-אוכלוסייה של תאים מתחילה להיצמד למשטח התרבית ולהתפשט, כאשר בתחילה הם מראים מורפולוגיה עגולה. היצמדות התאים עשויה להיות משתנה בנקודות זמן מוקדמות, והתרביות עשויות להיראות דלילות בשל המספר המוגבל של תאים חיוניים שהופקו במהלך הבידוד הראשוני. בימים 3–5, תאים נצמדים מאמצים בהדרגה מורפולוגיה מאורכת ובצורת כישור (spindle-shaped) האופיינית לתאי שריר חלק כלי דם (SMCs), ומתחילים להתרבות תוך יצירת צבירים קטנים. סקירה סכמטית של תהליך העבודה הניסויי, הכוללת בידוד של אביון (aorta), פילוח, עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכנית וזריעת תאים, מוצגת ב-איור 1.
תמונות מייצגות של בידוד העורק האאורטי, חלוקה אנטומית לאזורי ה-THX וה-ABD, והסרה של שכבת האדוונטיציה מוצגות ב-איור 2. אזורי האאורטה THX ו-ABD הובחנו על סמך המיקום האנטומי ביחס לסרעפת, כפי שמוצג ב-איור 2B. תמונות מייצגות של עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכנית והיווצרות של משקע תאים גלוי לאחר סרכזוגציה מוצגות ב-איור 3.
מספר התאים והחיוניות הוערכו במעבר 3 באמצעות שיטת הדחת Trypan blue (1:1) ו סופר תאים אוטומטי מסוג Countess. הנתונים הופקו מ-3 בידודים עצמאיים תוך שימוש ב-6 עכברים בסך הכל (2 עכברים לבידוד). לתרביות THX היה מספר תאים ממוצע של 5.10 × 105 ± 7.81 × 104 תאים (טווח: 4.20 × 105–5.60 × 105) וחיוניות של 66.33 ± 18.18% (טווח: 46–81%). לתרביות ABD היה מספר תאים ממוצע של 4.63 × 105 ± 2.31 × 104 תאים (טווח: 4.50 × 105–4.90 × 105) וחיוניות של 61.66% ± 12.01% (טווח: 50%–74%) (טבלה 1).
בימים 5–7, התרביות מגיעות בדרך כלל לכ-70%–90% התלכדות (confluence), ויצרו שכבה אחת (monolayer) דחופה ואחידה יחסית. התאים נוטים להסתדר במקביל, מה שמשקף את מוצאם המכווץ. ניתן להבחין בהבדלים בקצב השכפול ובצפיפות התאים בין תאי SMC מאזור ה-THX לבין תאי SMC מאזור ה-ABD, דבר התואם את ההטרוגניות האזורית הידועה של האאורטה. תמונות מייצגות במיקרוסקופ ניגודי פאזה של מורפולוגיית SMCs ראשוניים מסגמנטים אאורטליים של THX ו-ABD בהגדלה נמוכה (10x) ובסביבה גבוהה יותר (20x) מוצגות ב-איור 4.
תאי שריר חלק (SMCs) הפגינו את המורפולוגיה האופיינית המוארכת ובעלת צורת כישוף, סידור מקבילי מאורגן בהגעה להסנכרון (confluence) ותבנית גדילה אחידה, בעוד שתאים דמויי פיברובלסטים מציגים בדרך כלל מורפולוגיה שטוחה ובלתי סדירה יותר, עם אוריינטציה פחות מאורגנת והתפשטות הטרוגנית. מאפיינים מורפולוגיים ותבניות גדילה אלו מספקים גישה מעשית וניתנת לשחזור לזיהוי אוכלוסיות של SMC בתרבית ראשונית בהיעדר תיקוף מולקולרי. בידוד מוצלח מאופיין בהיצמדות תאית מוקדמת בתוך 24–48 h, רכישה הדרגתית של מורפולוגיה בצורת כישוף, ויצירת שכבה אחת רציפה (monolayer) עד לימים 5–7. התאים נוטים להסתדר במערכים מקביליים ברמת הסנכרון גבוהה, דבר העולה בקנה אחד עם פנוטיפ של שריר חלק. תוצאות שאינן אופטימליות עשויות לכלול היצמדות תאית לקויה, תפוקת תאים נמוכה, או נוכחות של תאים שטוחים בעלי צורה בלתי סדירה, אשר עשויים להעיד על עיכול חלקי, חשיפה אנזימטית מוגברת או זיהום של אוכלוסיות תאים שאינן של שריר חלק.
חיוניות תאים עקבית וזיהום מינימלי של תאים דמויי פיברובלאסטים מחזקים עוד יותר את הצלחת הבידוד. כדי לתקף באופן נוסף את זהות ה-SMC, תרביות ראשוניות מייצגות עברו צביעה אימונוהיסטוכימית ל-α-SMA (איור 5) באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 8. הן תרביות THX והן תרביות ABD הראו את דפוס צביעת ה-α-SMA הסיבי האופייני המצופה מתאי SMC וסקולריים. כימות של ארבעה שדות מיקרוסקופיים זיהה 69 תאים חיוביים ל-α-SMA מתוך 72 תאים חיוביים ל-Hoechst שנבדקו, מה שמתרגם לחיוביות כוללת של α-SMA בשיעור של 95.8% (CI 95%, 88.5%–98.9%). באופן ספציפי, 20/20 תאי THX ו-49/52 תאי ABD היו חיוביים ל-α-SMA. איור 5 מציג שדות מייצגים מבין אלו שנבדקו.
במהלך המעברים הראשונים, התאים שומרים על מורפולוגיה יציבה ועל יכולת שגשוג. עם זאת, בתרביות ממושכות, התאים עשויים להראות בהדרגה מאפיינים של מודולציה פנוטיפית, הכוללים התפשטות מוגברת, יישור מופחת ודפוסי גדילה משתנים.
תחת תנאים אלו, תרביות ראשוניות של SMC מתאימות ליישומים המשכיים, כולל השתקה גנטית (gene knockdown), טיפולים פרמקולוגיים ומחקרים מכניסטיים של מסלולים המעורבים בעיצוב מחדש של כלי דם (vascular remodeling) ובפיתוח מפרצת באבי העורקים.
איור 1סקיצה כללית של זרימת העבודה. ייצוג סכימטי של זרימת העבודה העיקרית לבידוד תאי שריר חלק של אבי העורקים בעכברים. פאנל 1 מציג הרדמה ובידוד של האורטה. פאנל 2 מציג הפרדה של מקטעי אבי העורקים THX ו-ABD לתוך תמיסת עיכול אנזימטית. פאנל 3 מראה את הסרת האדוונטיציה (adventitia) ובידוד השכבה המדיאלית. פאנל 4 מציג את החזרת מקטעי הרקמה לתמיסת אנזים טרייה וקיצוץ. פאנל 5 מציג דיסוציאציה מכנית באמצעות פיפטינג בכל 30 דקות למשך 2–3 שעות. לוח 6 מציג את התאושש התאים והזריעתם, כולל 6a צנטריפוגציה, 6b הסרת הנוזל העליון, ו-6c ריסוספנזיה של המשקע והזריעה. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2בידוד והכנה של מקטעי אבי העורקים של עכבר. (A) אאורטה שלמה בודדה והוצבה בצלחת תרבית. (B) אורטה נקייה עם סימנים אנטומיים המצביעים על אזורי ה-THX וה-ABD, כולל הסרעוף והפיצול האילי. (C) תמונות מייצגות של הסרת האדוונטיציה (adventitia) ממקטעי THX (למעלה) ו-ABD (למטה) באמצעות פינצטות עדינות וגסות, החושפות את שכבת המדיה (medial layer) שמתחתיה, שהיא קריטית לבידוד תאי שריר חלק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3עיכול אנזימטי ופירוק מכני של רקמת אבי העורקים. (Aלאחר הסרת השכבה האדוונטיציאלית (adventitial layer), מעבירים את השכבה המדיאלית (medial layer) לתמיסת אנזים טרייה וקצות אותה בעזרת מספריים קטנים.Bדוגמה לפירוק מכני של מקטעי אבירים באמצעות פיפטינג עדין.Cלאחר עיכול אנזימטי וסבוב בצנטריפוגה, ניתן להבחין במשקע תאים נראה לעין. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4מורפולוגיה מייצגת של תאי שריר חלקים ראשוניים של אבי העורקים של עכבר (SMCs). תאי שריר חלק (SMCs) ראשוניים שבודדו ממקטעים של אאורטה חזיתית ובטנית תורבדו בתנאים סטנדרטיים וצולמו במעבר 4. תמונות פאזה-ניגודיות (phase-contrast) מייצגות מוצגות בהגדלה נמוכה (10x) וגבוהה יותר (20x). התאים מראים מורפולוגיה מוארכת ואופיינית בצורת כישור, וסידור העולה בקנה אחד עם פנוטיפ של תאי שריר חלק מכווצים. ניתן להבחין בהבדלים בצפיפות התאים ובארגונם בין תאי SMC ממקור חזיתי (THX) למקור בטני (ABD), מה שמשקף הטרוגניות אזורית. פסי קנה מידה = 100 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 5: תיקוף אימונופלואורסצנציה של תאי SMC עורקיים ראשוניים מעכברים. (A) תמונות אימונופלואורסצנציה מייצגות של תאי SMC ראשוניים שבודדו מהאאורטה באזור ה-THX (שמאלה) וה-ABD (ימינה) ונצבעו עבור α-SMA (ירוק). הגרעינים נצבעו בצביעת נגד עם Hoechst 33342 (כחול). התמונות צולמו בהגדלה של 20x. (B) תמונות בקרה מייצגות עם נוגדן משני בלבד של תאי SMC ראשוניים מאזור ה-THX (שמאלה) וה-ABD (ימינה), שעובדו ללא הנוגדן הראשוני ל-α-SMA ונצבעו בצביעת נגד עם Hoechst 33342 (כחול). התמונות צולמו בהגדלה של 10x. כימות על פני ארבעה שדות מיקרוסקופיים זיהה 69/72 תאים כחיוביים ל-α-SMA (95.8%). סרגי קנה מידה = 100 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.
| ספירת תאים וחיוניות של תרביות ראשוניות של תאי שריר חלק של אבי העורקים בעכברים | |||
| מקטע אבי העורקים | בידודים עצמאיים, n | ספירת תאים (ממוצע ± (סטיית תקן)* | חיוניות תאים (ממוצע ± סטיות תקן (SD)† |
| תודה | 3 | 5.10 x 105 ± 7.81 x 104 תאים | 66.33 ± 18.18 % |
| ABD | 3 | 4.63 x 105 ± 2.31 x 104 תאים | 61.66 ± 12.01 % |
| *ספירות תאים התקבלו במעבר 3 משלוש בידודים עצמאיים. | |||
| †מספר התאים והחיוניות נקבעו באמצעות בדיקת הדירה של Trypan blue ביחס של 1:1, באמצעות סופר תאים אוטומטי מסוג Countess. | |||
טבלה 1: ספירת תאים וחיוניות של תרביות ראשוניות של תאי שריר חלק מעורק אבי העורקים של עכברים
| שלב | בעיה | סיבה אפשרית | פתרון מומלץ |
| דיסקציה של אבי העורקים | תנובה נמוכה של תאים | הוצאה חלקית של אבי העורקים או נזק לרקמה במהלך הדיסקציה | הבטח בידוד מלא משורש אבי העורקים ועד למפגש התנורי של העורקים האיליאקיים; טפל ברקמה בעדינות כדי למנוע נזק |
| ניקוי אבי העורקים | זיהום פיברובלסטים | הסרה חלקית של רקמת האדוונטיציה (Adventitia) | קלף בזהירות את האדוונטיציה לאחר העיכול הראשוני; שלב זה קריטי לטוהר תאי ה-SMC |
| עיכול ראשוני | קושי בהסרת האדוונטיציה | שחרור אנזימטי לא מספיק | הבטח דגירה תקינה (8-10 min) לפני ניסיונות קילוף מכניים |
| עיכול אנזימטי | תנובה נמוכה של תאים | עיכול חסר של הרקמה | הארך מעט את זמן העיכול או הגבר את תדירות הדיסוציאציה המכנית |
| עיכול אנזימטי | חיוניות תאית נמוכה | עיכול יתר או חשיפה ממושכת לאנזים | צמצם את זמן העיכול והימנע מדגירה ממושכת |
| דיסוציאציה מכנית | שחרור תאים לקוי | פיפטינג לא מספיק | בצע פיפטינג עדין אך חוזר בכל 30-60 min |
| היצמדות תאים | היצמדות לקויה לפלטה | נזק לתאים או מדיום קר | השתמש במדיום שחומם מראש וצמצם את הלחץ הנובע מטיפול בתאים |
| תרבית ראשונית | אין צמיחה של תאים | חיוניות נמוכה או זיהום | אשר את תנאי העיכול ואת הסטריליות; חזור על הבידוד במידת הצורך |
| מורפולוגיה של תאים | צורה שאינה כישורית/ספנדל (תאים עגולים/שטוחים נותרים) | זיהום או סחף פנוטיפי | אשר את הסרת האדוונטיציה; הימנע מצמיחה יתר ומקיטור ממושך |
| צמיחת תאים | פרוליפרציה איטית | ריכוז סרום לא אופטימלי | השתמש ב-20% FBS במהלך שלב ההתרחבה המוקדם |
| הצפיפות (Confluence) | תאים בצפיפות יתר שקשה להעביר (Passage) | פיצול מאוחר | העבר את התאים כאשר הם מגיעים ל-80-90% צפיפות |
| העברה (Passaging) | ניתוק לקוי | התאים בצפיפות יתר או טריפסינציה לא מספיקה | הגבר מעט את זמן החשיפה לטריפסין וסייע לניתוק באופן מכני |
| תרבית ארוכת טווח | אובדן הפנוטיפ של SMC | מספר מעברים גבוה או תרבית ממושכת | השתמש בתאים בין מעברים 3-7 |
| שחזוריות | שונות בין בידודים | הבדלים בטכניקה או שונות ביולוגית | סטנדרט את הכנת האנזים, התזמון והטיפול לאורך כל הניסויים |
טבלה 2: מדריך לפתרון בעיות בבידוד ובתרבית של תאי שריר חלק ראשוניים מעורק אבי העורקים של עכברים. סיכום של בעיות טכניות נפוצות המתרחשות במהלך הבידוד, העיכול והתרבית של תאי שריר חלק ראשוניים מעורק אבי העורקים של עכברים, כולל סיבות אפשריות ופתרונות מומלצים לשיפור השחזוריות.
דיון
פרוטוקול זה מספק שיטה חסונה וניתנת לשחזור לבידוד וגידול של תאי שריר חלק ראשוניים מעורק האבורה של עכבר (SMCs) למחקרי in vitro . בנוסף לתועלתו הטכנית, גישה זו רלוונטית מאוד לחקירת המנגנונים העומדים בבסיס עיצוב מחדש של כלי דם (vascular remodeling) והתפתחות מפרצת באבי העורקים. בהינתן התפקיד המבוסס של מערכת הרנין-אנגיוטנסין (RAS) ושל Ang II בדלקת כלי דם ובהיווצרות מפרצת15,16, בידוד של תאי SMC ראשוניים מאבי העורקים מספק גישה בעלת ערך לבחינת מסלולים אלו ברמה התאית.
גורם מפתח להצלחה הוא הסרה יסודית של רקמת האדוונטיציה (adventitial tissue). האדוונטיציה מכילה פיברובלסטים ואוכלוסיות תאים שאינם SMCs, שעלולים לגדול מהר יותר מה-SMCs בתרבית אם לא יוסרו כראוי. שלב העיכול האנזימטי הראשוני והקצר מקל על ההפרדה המכנית של האדוונטיציה מהשכבה המדיאלית (medial layer), ובכך מאפשר דיסקציה מדויקת יותר. כישלון בביצוע יעיל של שלב זה הוא אחת הסיבות הנפוצות ביותר לזיהום ולשונות בפרוטוקולים של בידוד SMCs.
יש לאפטימיзировать בקפידה גם את תנאי העיכול האנזימטי. השילוב של collagenase type II, elastase ומעכב טריפסין מסויה (soybean trypsin inhibitor) מאפשר פירוק יעיל של רכיבי המטריצה החוץ-תאית תוך שמירה על חיוניות התאים. עם זאת, יש לנטר את העיכול מקרוב. עיכול לא מספיק מוביל לדיסוציאציה חלקית של הרקמה ולירידה בתנובת התאים, בעוד שעיכול מופרז עלול לפגוע בתאים, לשבש את ההיצמדות ולהפחית את החיוניות. לכן, דיסוציאציה מכנית באמצעות פיפטינג עדין וחוזר היא שלב משלים חיוני, המקדם את שחרור התאים תוך מזעור החשיפה הממושכת לאנזימים. יחד, שלבים אלו מדגישים את חשיבות האיזון בין העיבוד האנזימטי למכני כדי לאופטימיзировать הן את תנובת התאים והן את חיוניותם. שמירה על זמני עיכול עקביים, טיפול אחיד ברקמה ודיסוציאציה מכנית עקבית לאורך הפרוצדורה חשובים באותה מידה לשיפור השחזוריות בין בידודים שונים.
תנאי התרבית ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על הפנוטיפ והתפקוד של תאי SMC. מצע המכיל ריכוז גבוה של סרום (20% fetal bovine serum) תומך בהיצמדות ראשונית ובהתרבות של תאים ראשוניים לאחר הבידוד. סרום שעבר טיפול ב-Charcoal/dextran שימש להפחתת השונות הנובעת מהורמונים ומרכיבי ליפידים הנמצאים בתכשירי סרום סטנדרטיים. עם זאת, חשיפה ממושכת לסרום בריכוז גבוה או משך תרבית ממושך עלולים לעודד סטיה פנוטיפית לעבר מצב סינתטי או דמוי פיברובלסט. כדי למזער השפעות אלו, מומלץ להשתמש בתאים بمعברים מוקדמים עד בינוניים (P3–P7) ולהימנע מתנאי צפיפות יתר (over-confluent), שעלולים לשנות את המורפולוגיה ולהפחית את יכולת השכפול.
המורפולוגיה של תאים מבודדים מספקת אינדיקטור ראשוני חשוב לאיכות התרבית. תאי SMC בריאים מראים מורפולוגיה מאורכת ואופיינית בצורת כישור (spindle-shaped), ומסתדרים במערכים מקבילים בהסתמכות (confluence) גבוהה יותר. סטיות ממורפולוגיה זו, כולל תאים שטוחים או בעלי צורה לא סדירה, עשויות להעיד על זיהום, תנאי תרבית לא אופטימליים או סחף פנוטיפי. מאפיינים מורפולוגיים המרמזים על מעבר פנוטיפי ממצב מכווץ (contractile) למצב סינתטי כוללים התפשטות מוגברת של התאים, הפחתה במורפולוגיה בצורת כישור, אובדן היישור המקבילי ודפוסי צמיחה הטרוגניים יותר.
בעוד שהערכה מורפולוגית היא אינפורמטיבית, היא אינה מספיקה כדי לקבוע באופן מוחלט את הפנוטיפ של ה-SMC ויש להשלים אותה בתיקוף מולקולרי באמצעות מרקרים כגון α-SMA ו-MYH11, בהתאם ליישום. במחקר הנוכחי, אימונופלואורסצנציה של α-SMA אישרה את זהות התאים המבודדים והדגימה פרופורציה גבוהה של תאים חיוביים ל-α-SMA הן בתרביתי THX והן בתרביתי ABD (איור 5). יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא היכולת לבודד SMCs מאזורים שונים של האורטה, כולל מקטעי THX ו-ABD. אזורים אלו מראים הבדלים ביולוגיים מובנים, כולל שונות בהרכב המטריצה החוץ-תאית, במקור העוברי ובפגיעות למחלות. בידוד של SMCs ספציפיים לאזור מאפשר חקירה של הטרוגניות מרחבית בביולוגיה וסקולרית ועשוי לספק תובנות לגבי פגיעות ספציפית לאזור להיווצרות מפרצת16,17,18. שיטות קיימות לבידוד VSMC מאורטה של עכברים משתמשות בעיכול קולגנאז למשך הלילה13 או ב-4–6 שעות של עיכול אנזימטי, כאשר דווח כי 5–6 שעות מספקות התאוששות טובה יותר14, בהשוואה לעיכול של 2–3 שעות בעקבות עיכול מקדים של 8–10 דקות המשמש בפרוטוקול הנוכחי, עם זמן עיבוד כולל של כ-4 שעות מההמתה ועד לזריעת התאים. Adhikari et al. דיווחו על 25–35 × 103 תאים חיוניים/mL לאחר 5 ימי תרבית ו-97%–99% חיוביות ל-sm22α ו-Acta2, בעוד שהפרוטוקול הנוכחי הניב ספירות תאים במעבר 3 (passage-3) של 5.10 × 105 ± 7.81 × 104 תאים עבור THX ו-4.63 × 105 ± 2.31 × 104 תאים עבור ABD, עם חיוביות כללית ל-α-SMA של 95.8%. Hubert et al. השתמשו בעיכול למשך הלילה אך לא דיווחו על תנובת תאים כמותית או על אחוז טוהר13,14. בניגוד לכך, השיטה מבוססת-השתלה (explant-based) של McMurray et al. דרשה תקופת השהיה ממוצעת של כ-7.6 ימים לפני צמיחת SMCs מהשתלות אורטה נורמליות, כאשר >90% מההשתלות הראו צמיחה עד יום 10 ו->95% עד יום 12, בעוד שהשיטה האנזימטית הנוכחית מאפשרת זריעה ישירה של תאים מבודדים ביום הבידוד18. הפרוטוקול הנוכחי משלב שלב עיכול מקדים קצר המקל על הסרת ה-adventitia יחד עם תנאי עיכול ודיסוציאציה מכנית סטנדרטיים כדי לקדם עיבוד רקמה והתאוששות תאים עקביים. יחד עם בידוד ספציפי לאזור של SMCs מ-THX ו-ABD, זמן העיבוד הקצר והאפיון הכמותי של התאוששות התאים והחיוביות ל-α-SMA מספקים יתרונות מעשיים למחקרים שחזריים in vitro.
שיטה זו מתאימה היטב למחקרים מכניסטיים הכוללים מניפולציות גנטיות ופרמקולוגיות. ניתן להשתמש בתרביות ראשוניות של SMC בגישות להשתקת גנים, כולל knockdown בתיווך siRNA, וכן במחקרי ביטוי יתר ובטיפולים תרופתיים. גישות אלו מאפשרות בחינה ישירה של מסלולי איתות המעורבים בשינוי פנוטיפי של SMC, בדלקת ובשינוי של המטריקס החוץ-תאי, תהליכים המהווים מרכז בפיתוחו ובהתקדמותו של מפרצת באבי העורקים1,5.
חשוב לשקול את המגבלות של פרוטוקול זה בהקשר של מידול מחלות. תאי שריר חלק בפרוטוקול זה מבודלים מאורטות של עכברים שאינן חולות, ולכן הם אינם מראים מטבעם פנוטיפים הקשורים למפרצת. ככזה, נדרשות גישות ניסיוניות נוספות, כולל גרייה פרמקולוגית, מניפולציה גנטית או שילוב עם מודלים in vivo, כדי לשחזר תהליכים רלוונטיים למחלה כגון הפעלה דלקתית, עיצוב מחדש של המטריצה החוץ-תאית והחלפה פנוטיפית. בנוסף לשיקולים המתוארים לעיל, לפרוטוקול זה מספר מגבלות. שונות ביבול התאים ובקינטיקת הצמיחה עלולה להתרחש בין בידודים שונים בשל הבדלים ביולוגיים בין בעלי החיים או שינויים קלים בטכניקה. בנוסף, בידוד המבוסס על עיכול אנזימטי עשוי להשפיע על ביטוי רצפטורים על פני השטח של התא או על מסלולי איתות, דבר שיש להביאו בחשבון בעת פרשנות של מחקרים תפקודיים המשכיים. תאי SMC ראשוניים מאבדים גם הם בהדרגה את הפנוטיפ המכווץ עם הגברת מספר המעברים, דבר שעשוי להשפיע על תוצאות הניסוי. סטנדרטיזציה קפדנית של ההליכים ושימוש בתאים ממעברים מוקדמים יכולים לסייע בהפחתת מגבלות אלו. אתגרים טכניים נפוצים ופתרונות מומלצים עבור פרוטוקול זה מסוכמים בטבלה 2.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק מסגרת אמינה וגמישה לבידוד ולתרבית של תאי SMC אאורטתיים ראשוניים של עכברים. כאשר גישה זו משולבת עם מודלים in vivo, היא מאפשרת חקירה מקיפה של המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס השחזור הכלי (vascular remodeling) והפתוגנזה של מפרצת באביס (aortic aneurysm).
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים. Grammarly שימשה לעריכת השפה ולתיקון דקדוקי; כל התוכן המדעי והפרשנות הוכנו על ידי המחברים.
תודות
תמיכה כספית סופקה, בחלקה, על ידי הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת קנטקי (University of Kentucky College of Medicine). התקציר הגרפי (איור 1) נוצר באמצעות BioRender.com תחת רישיון פרסום אקדמי, עם מספר הסכם פרסום GI2A3W9TY8.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מסנני מזרק ניילון 0.2 μm | VWR | 76439-080 | סינון סטרילי |
| מבחנות קוניות 15 mL | VWR | — | להעברת אביון לאחר ניקוי ועבור איסוף תאים |
| פלטות תרבית 6-well / 12-well (לא מטופלות) | Corning | — | תרבית תאים |
| מבחנות קוניות 50 mL | VWR | — | איסוף תאים |
| מיקרופלטה עם תחתית אופטית 96-well | Thermo Fisher Scientific | 165305 | עבור תיקוף SMC |
| נוגדן α-Smooth Muscle Actin (מונוקלונלי) | Cell Signaling Technology | 19245S | עבור תיקוף SMC; דילול עבודה של 1:1000 |
| נוגדן משני Alexa Fluor 488 IgG (פוליקלונלי) | Invitrogen | A-11008 | עבור תיקוף SMC; דילול עבודה של 1:2500 |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | אנטי-פטרייתי |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | עבור תיקוף SMC |
| אינקובטור CO2 (37 °C) | Various | — | תנאי תרבית תאים |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004174 | עבור עיכול אנזימטי; נעשה שימוש ב-260 U/mg |
| סופר תאים אוטומטי Countess | Invitrogen | C10281 | עבור ספירת תאים |
| מיקרוסקופ דיסקציה | Various | — | ניקוי רקמה |
| מדיום DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | מדיום תרבית בסיסי |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | עבור פירוק המטריקס; נעשה שימוש ב-4.17 U/mg חלבון |
| סרום עוברי בקר (מטופל בפחם/דקסטראן) | Cytiva (Hyclone) | SH30068.03 | בשימוש בריכוז של 20% לתרבית |
| HBSS עם Ca2+ ו-Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | בשימוש כבופר עיכול |
| תמיסת Hoechst 33342 | BD Pharmingen | 561908 | עבור תיקוף SMC |
| סטריליזטור חרוזים חם | Fine Science Tools | 18000-45 | עבור הפקת אביון |
| Ketamine | Dechra | — | עבור הרדמת עכבר |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | אנטיביוטיקה |
| סלויין פוספט (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | בופר שטיפה |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BDH9286 | עבור תיקוף SMC; ריכוז עבודה של 150 mM (8.8 g ל-1 L) |
| מעכב טריפסין מפולי סויה | Worthington Biochemical | LS003570 | מונע עיכול יתר |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152 | עבור תיקוף SMC; ריכוז עבודה של 20 mM (2.4 g ל-1 L) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | עבור תיקוף SMC; ריכוז עבודה של 0.1% |
| צבע Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | עבור ספירת תאים |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | עבור מעבר (passaging) |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | עבור תיקוף SMC; ריכוז עבודה של 0.1% |
| Xylazine | Covetrus | 61035 | עבור הרדמת עכבר |
| חומרים אופציונליים (אם נעשה בהם שימוש) | |||
| באלקונים לתרבית (T25/T75) | Corning | — | הרחבת תאים |
מקורות
- Ensor M, et al. Nicotine promotes Ang II-induced abdominal aortic aortopathies in female and male mice: role of sex hormones. Clin Sci (Lond). 2025;139(8):411-429.
- Ailawadi G, et al. Smooth muscle phenotypic modulation is an early event in aortic aneurysms. J Thorac Cardiovasc Surg. 2009;138(6):1392-1399.
- Frismantiene A, Philippova M, Erne P, Resink TJ. Smooth muscle cell-driven vascular diseases and molecular mechanisms of VSMC plasticity. Cell Signal. 2018;52:48-64.
- Alsiraj Y, et al. Female mice with an XY sex chromosome complement develop severe angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. Circulation. 2017;135(4):379-391.
- Thatcher SE, et al. Exogenous 17-β estradiol administration blunts progression of established angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms in female ovariectomized mice. Biol Sex Differ. 2015;6:12.
- Daugherty A, Manning MW, Cassis LA. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. J Clin Invest. 2000;105(11):1605-1612.
- AlSiraj Y, et al. Monosomy X in female mice influences the regional formation and augments the severity of angiotensin II-induced aortopathies. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(1):269-283.
- Alsiraj Y, et al. Sex chromosome complement defines diffuse versus focal angiotensin II-induced aortic pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018;38(1):143-153.
- Alsiraj Y, et al. Therapeutic assessment of combination therapy with a neprilysin inhibitor and angiotensin type 1 receptor antagonist on angiotensin II-induced atherosclerosis, abdominal aortic aneurysms, and hypertension. J Pharmacol Exp Ther. 2021;377(3):326-335.
- AlSiraj Y, et al. Serotonin 3 receptor antagonism reduces angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms: contribution of periaortic fat-derived serotonin. J Pharmacol Exp Ther. 2025;392(2):100533.
- AlSiraj Y et al. Role of adipocyte angiotensinogen or angiotensin type 1A receptors in the development of diet-induced atherosclerosis or angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. JVS Vasc Sci. 2025;7:100397.
- Alexander MR, Owens GK. Epigenetic control of smooth muscle cell differentiation and phenotypic switching in vascular development and disease. Annu Rev Physiol. 2012;74:13-40.
- Hubert MO, Rodriguez-Vita J, Wiedmann L, Fischer A. Isolation of murine primary aortic smooth muscle cells. Bio Protoc. 2021;11(3):e3907.
- Adhikari N, et al. Guidelines for the isolation and characterization of murine vascular smooth muscle cells. A report from the International Society of Cardiovascular Translational Research. J Cardiovasc Transl Res. 2015;8(3):158-163.
- AlSiraj Y, Woolley C, Thatcher SE, Cassis LA. Sex differences and the role of the renin-angiotensin system in atherosclerosis and abdominal aortic aneurysms. In: Sex Differences in Cardiovascular Physiology and Pathophysiology. Academic Press; 2019:167-184.
- Boese AC, et al. Sex differences in vascular physiology and pathophysiology: estrogen and androgen signaling in health and disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(3):H524-H545.
- Majesky MW. Developmental basis of vascular smooth muscle diversity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007;27(6):1248-1258.
- McMurray HF, Parrott DP, Bowyer DE. A standardised method of culturing aortic explants, suitable for the study of factors affecting the phenotypic modulation, migration and proliferation of aortic smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1991;86(2-3):227-237.
הדפסות חוזרות והרשאות
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב