הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תהליך עבודה מהיר למידול ליקויים בזיכרון ההכרה המושרים על ידי חסר שינה בעכברים, באמצעות זיהוי חפץ חדש ומסמנים ביולוגיים של ההיפוקמפוס

132 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73557

⸱

8 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 2Department of Neurology, Hefei Eighth People's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine, Bengbu First People's Hospital, 4Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College and State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג תהליך עבודה מהיר וניתן לשחזור למידול פגמים בזיכרון זיהוי המושרים על ידי חסר שינה בעכברים, על ידי שילוב של חסר שינה המבוסס על טיפול עדין, בדיקת זיהוי אובייקטים חדשים ואנליזה של סמנים ביולוגיים בהיפוקמפוס באותם בעלי חיים לאורך נתיב עבודה של 10 ימים, עם תיעוד מובנה של ההתערבויות וקריטריונים מוגדרים מראש לבקרת איכות.

תקציר

שינה לא מספקת תורמת להידרדרות קוגניטיבית ועשויה להאיץ תהליכים נוירודגנרטיביים. מאמר זה מציג זרימת עבודה מהירה וניתנת לשחזור למידול ליקויים בזיכרון זיהוי המושרים על ידי חסך בשינה בעכברים, תוך קישור תוצאות התנהגותיות לשינויים מולקולריים בהיפוקמפוס. הפרוטוקול משתמש בפרדיגמה של חסך בשינה באמצעות טיפול עדין למשך 5 h, המיושמת מיד לאחר סשן היכרות סטנדרטי של 10 min עם אובייקט חדש (NOR). זיכרון הזיהוי מוערך באמצעות מבחן NOR למשך 5 min לאחר מרווח שימור מוגדר במדויק של 5 h, ולאחריו איסוף מיידי של ההיפוקמפוס מאותן חיות לצורך כימות של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) ו-tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), ומסמני עקה חמצונית, כולל superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) ו-malondialdehyde (MDA). ההתקדמות המתודולוגית העיקרית אינה הטכניקות ההתנהגותיות או הביוכימיות הבודדות, שהן מבוססות היטב, אלא הסטנדרטיזציה האופרטיבית שלהן כזרימת עבודה אחת מקושרת. הפרוטוקול דורש יומן מובנה ומדיד של התערבויות טיפול עדין, מעגן את האימון ואת החסך בשינה לנקודת זמן צירקדית קבועה, משמר קישורים ברמת החיה בין הקלטות NOR לדגימות רקמה, וקובע מראש קריטריונים לבקרת איכות וניתוח. הפרוגדורה נועדה למזער הגבלה פיזית ופעילות גופנית כפויה, ניתן להשלימה בתוך חלון ניסויי קצר, ומוצעת כזרימת עבודה ייחוסית מועמדת שמעבדות בודדות יכולות להשתמש בה כדי להשוות את היישום שלהן של חסך בשינה באמצעות טיפול עדין, בכפוף לשחזור עצמאי.

מבוא

שינה היא תהליך פיזיולוגי בסיסי החיוני לתפקוד המוח, ללמידה ולגיבוש זיכרון1. חסך בשינה קשור לתפקוד קוגניטיבי לקוי, להפרעות במצב הרוח ולהתקדמות של מחלות נוירודגנרטיביות2. שימוש במודלים של מניעת שינה (SD) ניסיונית במכרסמים נפוץ מאוד לחקר ההשלכות הנוירוביולוגיות של אובדן שינה חריף. ההיפוקמפוס, אזור במוח המרכזי לזיכרון דקלרטיבי ומרחבי, רגיש במיוחד למניעת שינה3.

קיימים מספר הליכים להשראת חסך בשינה במכרסמים. שיטה שונה של פלטפורמות מרובות יכולה להפחית ביעילות שינה מסוג REM (תנועות עיניים מהירות), אך עלולה לגרום ללחץ משמעותי ולתשישות פיזית4. לעומת זאת, טיפול עדין (GH - gentle handling) שומר על ערנות באמצעות גירוי חושי קל, כגון הקשה על הכלוב, הפרעה למצע או הצגת חומר קינון חדש כאשר מופיעים סימני שינה. תקופת GH קצרה המיושמת מיד לאחר למידה עשויה להפריע לגיבוש זיכרון התלוי בהיפוקמפוס, תוך הימנעות מרבים מהמשתנים המבלבלים הקשורים לפרדיגמות של חסך ממושך5. כיוון שההתערבויות בפרוטוקול זה מופעלות על ידי תנוחה וסימני ערנות התנהגותיים ולא על ידי זיהוי REM המאושר ב-EEG, ה-GH כפי שהוא מיושם כאן מהווה שיטה מבוססת לחסך בשינה מלאה ולא טכניקה הספציפית ל-REM, והוא נמצא בשימוש בצורה זו במשך מספר עשורים6.

מבחן זיהוי אובייקט חדש (NOR) הוא בדיקה נפוצה לבחינת זיכרון זיהוי. המבחן נשען על הנטייה הטבעית של מכרסמים לחקור אובייקט חדש יותר מאשר אובייקט מוכר, ללא צורך בתגמול, ענישה או אימון נרחב7,8. הוכח כי חסר שינה (SD) חריף פוגע ביכולת ההבחנה בין אובייקטים חדשים, ובכך מספק מדד התנהגותי יעיל לשיבוש בגיבוש הזיכרון (memory consolidation)9. ברמה המולקולרית, אובדן שינה עלול לעורר נוירו-דלקת בהיפוקמפוס ועקה חמצונית (oxidative stress), הכוללת רמות מוגברות של ציטוקינים פרו-דלקתיים ותוצרי פראוקסידציה של ליפידים, לצד ירידה ביכולת הנוגדת חמצון10,11.

האתגר ביישום מודל זה אינו זמינות מרכיביו הבודדים, אלא היעדר עקביות תפעולית בין מחקרים שונים. טיפול עדין מדווח לעיתים קרובות ללא תיעוד מובנה של עוצמת ההתערבות; נקודות קצה התנהגותיות ומולקולריות נאספות לעיתים קרובות מקבוצות נבדקים נפרדות; וקריטריונים לבקרת איכות של התנהגות חקירה ותכנון גודל מדגם אינם תמיד מפורשים. המטרה הכללית של מאמר זה היא לספק זרימת עבודה סטנדרטית למידול ליקויים בזיכרון זיהוי המושרים על ידי חסך בשינה, תוך קישור תוצאות התנהגותיות למדדים מולקולריים בהיפוקמפוס באותם בעלי החיים. השיטה פותרת פערים אלו בחזרתיות על ידי שילוב של חלון GH למשך 5 שעות לאחר האימון, יומן עוצמת התערבות, איסוף דגימות רקמה ובדיקות התנהגותיות מאותה קבוצה, וקריטריונים אנליטיים שנקבעו מראש בתוך תהליך עבודה יחיד בן 10 ימים (איור 1). היעדר הסטנדרטיזציה ביישום GH צוין בעבר בספרות המתודולוגית של חקר השינה6.

figure-introduction-1
איור 1ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הניסויית. הפרוטוקול נמשך 10 ימים, הכוללים טיפול והרגלה, ולאחריהם יום בדיקה קריטי הכולל שלב היכרות של 10 דקות עם מבחן זיהוי חפצים חדשים (NOR), 5 שעות של הפרעת שינה באמצעות גלגל רץ (GH), מבחן NOR של 5 דקות, ואיסוף מיידי של רקמת היפוקמפ מאותם בעלי חיים לצורך אנליזה של סמני ביולוגיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הליי הפעולות בבעלי חיים נסקרו ואושרו על ידי ועדת הרווחה והאתיקה לבעלי חיים במעבדה של AILIMO (Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.) תחת בקשה מבית החולים Nanjing Drum Tower (חוקר ראשי: Yuan Liu), מספר אישור AP CODE: ALM202605070, שאושר ב-7 במאי 2026 (בתוקף ל-4 שנים), בהתאם לתקנות המוסדיות והלאומיות הרלוונטיות. השתמשו בעכברי C57BL/6J זכרים בוגרים (בני 8–12 שבועות) עבור הפרוטוקול המתואר להלן.

1. הכנה והרגלת בעלי חיים

  1. שכרו עכברי בית בתנאי מעבדה סטנדרטיים בטמפרטורה של 22°C ± 1°C ולחות של 50%–60%, עם מחזור של 12 שעות אור/12 שעות חושך (הדלקת אורים ב-07:00, המוגדר כ-ZT0). ספקו גישה חופשית למזון סטנדרטי למכרסמים ולמים.
  2. טפלו בכל עכבר במשך 3–5 דקות מדי יום למשך 7 ימים רצופים לפחות לפני הבדיקה.
    הערה: הליך זה ממזער את הלחץ הנגרם מהטיפול, העשוי להטעות את התוצאות של התנהגות חקירתית.
  3. הכינו זירת NOR ריבועית ואטומה במידות של 40 cm × 40 cm × 40 cm עם דפנות שאינן מחזירות אור. השתמשו בצבע זירה המנוגד לצבע הפרווה של בעלי החיים.
  4. בחרו חפצי NOR הכבדים מספיק כדי למנוע הזזה ועשויים מחומר שאינו נקבובי. השתמשו בחפצים הניתנים להבחנה בצורתם ובמרקמם, אך דומים בגודלם הכללי.
    הערה: איור 2 מציג את תצורת האימון והבדיקה.
  5. בימים 8 ו-9, העבירו את העכברים לחדר הבדיקות שעה אחת לפני ההרגלה. הניחו כל עכבר בזירה הריקה למשך 10 דקות, ולאחר מכן החזירו אותו לכלוב ביתו.
  6. נגבו את הזירה ואת החפצים בעזרת 70% אתנול בין בעלי חיים. המתינו לייבוש של האתנול באוויר למשך כ-3–5 דקות תחת אוורור מעבדה רגיל לפני הכנסת בעל החיים הבא.
    זהירות: אתנול הוא חומר דליק מאוד. הבטיחו אוורור נאות והרחיקו אותו ממקורות הצתה.

figure-protocol-1
איור 2. סכימה של מתקן זיהוי אובייקטים חדשים ומערך הניסוי. במהלך שלב ההכרות, מקם שני אובייקטים זהים (A ו-A′) בפינות נגדיות של הזירה. במהלך שלב הבדיקה, לאחר מרווח שימור של 5 h, החלף אובייקט מוכר אחד באובייקט חדש (B). בצע איזון (Counterbalance) של מיקום האובייקט החדש בין הצד השמאלי והימני בין החיות, כך שכשמחצית מהחיות בכל קבוצה יקבלו את האובייקט החדש בכל מיקום, כדי למזער הטיה מרחבית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. אימון NOR (הכרות)

  1. ביום 10, התחילו את אימון ה-NOR ב-ZT1 (08:00 לפי לוח הזמנים של התאורה שצוין). שמרו על זמן התחלה זה בכל הקבוצות כדי למזער שינויים צירקדיים.
  2. העבירו את העכברים לחדר הבדיקה שעה אחת לפני תחילת מפגש האימון. הניחו שני חפצים זהים (A ו-A′) בפינות נגדיות של הזירה, במרחק של כ-10 cm מהקירות.
  3. במידת הצורך, קבעו את החפצים לרצפה.
  4. הניחו את העכבר במרכז הזירה כאשר הוא פונה הרחק מהחפצים. אפשרו לעכבר לחקור בחופשיות במשך 10 min.
  5. הקליטו את ההתנהגות באמצעות מערכת מעקב וידאו עילית. הגדירו חקירה פעילה כהפניית האף לעבר חפץ במרחק של ≤2 cm, הרחה של החפץ, או נגיעה בו בעזרת האף.
    הערה: ישיבה על חפץ או טיפוס עליו ללא הרחקה פעילה לא ייספרו כחקירת חפץ.
  6. הקליטו ודרגו את התנהגות ה-NOR באמצעות EthoVision XT גרסה 17.5 עם מצלמה עילית Basler acA1300-60gm. הגדירו את תוכנת המעקב עם אזור זיהוי נקודת-אף של ≤2 cm מכל חפץ כדי לדרג חקירה פעילה, בהתאם לקריטריונים שהוגדרו בשלב 2.5.
  7. בסיום מפגש ההכרות של 10 min, הוציאו את העכבר מהזירה באופן מיידי.
  8. נקו את הזירה ואת החפצים ביסודיות עם 70% ethanol לפני הכנסת החיה הבאה.

3. הפרעה לשינה באמצעות טיפול עדין

  1. לפני מפגש האימון של יום 10, הקצו לכל בעל חיים קוד זיהוי ייחודי. שמרו על קוד הזיהוי לאורך כל שלבי תיעוד ההתנהגות ואיסוף הרקמות.
  2. הקצו את בעלי החיים לקבוצות ה-SD וה-NSD ביחס של 1:1 באמצעות מספרים אקראיים שנוצרו במחשב בעזרת פונקציית RAND ב-Excel.
  3. מיד לאחר אימון ה-NOR, החזירו את עכברי ה-NSD לכלובים הביתיים שלהם והשאירו אותם ללא הפרעה למשך 5 h. שמרו על בעלי חיים מקבוצות ה-SD וה-NSD תחת תנאים סביבתיים תואמים ובתוך אותו חלון זמן צירקדי.
  4. מיד לאחר אימון ה-NOR, התחילו את הדיספריגציה של השינה בשיטת GH עבור עכברי ה-SD. שמרו על ערנות במשך 5 שעות רצופות בכלוב הביתי.
  5. נטרו את בעלי החיים באופן רציף. התערבו כאשר עכבר נוקט בתנוחות הקשורות לשינה, כולל התכווצות, עצירת עיניים או חוסר תנועה ממושך.
  6. הפעילו גירוי באופן הדרגתי, החל מנקישות עדינות על הכלוב. במידת הצורך, הגבירו קלות את הפרעת המצע, הכניסו חפץ חדש ונקי כגון גליל נייר, או געו בעדינות בבעל החיים באמצעות מברשת רכה.
  7. הימנעו מריסון פיזי, כפייה של תנועה, או גירוים דוחים או כואבים.
  8. מלאו את יומן ההתערבויות ב-טבלה 1 עבור כל כלוב לאורך תקופת ה-GH של 5 h. רשמו את מספר ההתערבויות המשוער לשעה, את סוג ההתערבות הדומיננטי, וכל סטייה מהפרוטוקול או חשש בנוגע לרווחת בעלי החיים.
  9. השתמשו באותה תבנית של יומן התערבויות בכל הקבוצות.
    אזהרה: אין להשתמש בריסון פיזי, תרגול כפוי או גירויים כואבים, כיוון שגורמים אלו עלולים להשפיע באופן עצמאי על הזיכרון, על הלחץ ועל תוצאות דלקתיות.
מזהה כלוב/קוהורטכותרת 1H2H3H4H5סוגי התערבות דומיננטייםסטייה או תצפית רווחה
מזהה רשומהרשום את ספירת ה-H1רשום את ספירת ה-H2יש לרשום את ספירת ה-H3רשום את ספירת ה-H4יש להקליט את ספירת ה-H5הקשה / מצע / חפץ חדש / מברשת רכהיש לתעד אם קיים

טבלה 1: תבנית ליומן התערבויות טיפול עדין. רשמו את מזהה הכלוב או הקוהורט, מספר התערבויות הטיפול העדין במהלך כל שעה של תקופת הפרעת השינה שנמשכה 5 שעות (H1–H5), סוגי ההתערבות הדומיננטיים, וכל חריגה מהפרוטוקול או תצפיות רווחה.

4. שלב בדיקת ה-NOR

  1. בדיוק 5 h לאחר השלמת אימון ה-NOR, התחילו את שלב בדיקת ה-NOR כדי לשמור על פרק זמן קבוע של 5 h של שימור זיכרון.
  2. הניחו חפץ מוכר אחד (A) וחפץ חדש אחד (B) בזירה.
  3. בצעו איזון (Counterbalance) של מיקום החפץ החדש בין בעלי החיים על ידי החלפה של המיקום בין צד שמאל לצד ימין, כך שבערך מחצית מהבעלי החיים בכל קבוצה יקבלו את החפץ החדש משמאל ומחצית יקבלו אותו מימין.
  4. הניחו את העכבר במרכז הזירה. אפשרו לעכבר לחקור באופן חופשי למשך 5 min.
  5. הקליטו את הסשן באמצעות אותה מערכת מעקב וידאו עילית ששימשה לשלב ההכרות. יישמו את הגדרת החקירה שפורטה בשלב 2.5.
  6. נקו את הזירה ואת החפצים עם 70% ethanol בין בעלי חיים שונים.

5. איסוף רקמות מאותה קבוצה ודיסקציה של ההיפוקמפוס

  1. מיד לאחר מבחן ה-NOR, זהו את אותה החיה שנבדקה התנהגותית לצורך איסוף רקמות.
  2. בצעו קטילת ראש (decapitation) לבעל החיים ללא הרדמה, בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר, כדי למנוע השפעות מבלבלות פוטנציאליות של חומרי הרדמה על סמנים ביולוגיים דלקתיים ותלוי-פוספורילציה. אספו את רקמת המוח מיד לאחר ההמתה.
  3. שמרו את מזהה רישום ההתנהגות הייחודי של בעל החיים על כל מבחנות הדגימות והרישומים, כדי להבטיח שכל דגימה מולקולרית תישאר מקושרת ישירות לתוצאות ה-NOR של אותה חיה.
  4. חלצו במהירות את המוח והניחו אותו על משטח ניתוח סטרילי ומקורר על קרח.
  5. הפרידו את ההמיספרות באמצעות חיתוך סגיטלי מרכזי (mid-sagittal cut). בצעו דיסקציה של ההיפוקמפוס מכל המיספרה באמצעות מיקרו-שפכדלים מקוררים.
  6. בצעו הקפאה מהירה (Snap-freeze) להיפוקמפוסים שחולצו בחנקן נוזלי. שמרו את הדגימות בטמפרטורה של −80°C עד לניתוח.
    זהירות: חנקן נוזלי עלול לגרום לפגיעות קור חמורות. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים לעבודה עם חומרים קריוגניים.

6. כימות של סמנים ביולוגיים בהיפוקמפוס

  1. הוסיפו לתמיסת ליזיס RIPA קרה מאוד תערובת מעכבי פרוטאז ופוספטאז משולבת ביחס של 1× ריכוז עבודה (10 µL לכל מ"ל של באפר ליזיס (lysis buffer) מתוך 100× מלאי).
  2. הומוגניזרו רקמה מההיפוקמפוס ביחס של 1:10 בין הרקמה לבופר (משקל/נפח) בבופר ליזיס RIPA קר, מועשר (10 µL בופר ליזיס לכל מ"ג רקמה). עבור מסת רקמה היפוקמפלית טיפוסית של כ-25–30 מ"ג להמיספירה, השתמש בכ-250–300 µL של תמיסת ליזיס להמיספירה, או בערך 500–600 µL עבור כ-50–60 מ"ג של רקמה מההיפוקמפוס הדו-צדדי.
  3. סבבו את ההומוגנאט של RIPA בצנטריפוגה במהירות של 14,000 × ג' במשך 15 דקות ב- 4°C ואספו את הנוזל העליון (supernatant). השתמשו בנוזל העליון לכימות חלבון כולל ולשלושת בדיקות ה-ELISA לסייטוקינים.
    הערה: השתמשו בתמיסורי ההומוגניזציה הספציפיים של הערכה עבור בדיקות ה-SOD, ה-GPx וה-MDA, בהתאם להמלצות היצרן לשימור הפעילות האנזימטית.
  4. הכינו תמיסת הומוגנאט היפוקמפוס נפרדת בריכוז 10% (משקל/נפח) למדידות של SOD, GPx ו-MDA, ביחס של 1:9 בין הרקמה לבאפר, תוך שימוש בבאפר ההומוגנציה הספציפי לערכה המתאימה במקום בבאפר ליזיס RIPA.
  5. קביעת ריכוז החלבון הכולל באמצעות בדיקת חלבון BCA.
  6. כימות IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD, GPx ו-MDA באמצעות ערכות ELISA ספציפיות למטרה או ערכות בדיקה ביוכימיות המופיעות ב- טבלת חומריםיש לפעול לפי הוראות היצרן עבור כל בדיקה.
  7. הכינו את התמיסות הסטנדרטיות בבופר המדידה המתאים. דללו את הדגימות כך שערכי הצפיפות האופטית (optical density) יימצאו בטווח הליניארי של עקומת הסטנדרט.
  8. יש לדלל דגימות מההיפוקמפוס עבור בדיקות ה-ELISA של הציטוקינים ביחס של כ-1:5 עם תמיסת הדילול המתאימה למבחן. יש להתאים את הדילול בטווח של 1:2–1:10 לפי הצורך, כדי להגיע לערכי צפיפות אופטית (OD) הנמצאים בחלק הליניארי של עקומת התקן.
  9. השתמשו ישירות במתוכים של הומוגנאטים מההיפוקמפוס בריכוז 10% (משקל לנפח), כפי שתוארו בשלב 6.4, עבור בדיקות ה-SOD, ה-GPx וה-MDA. אין להחיל את סכימת הדילול של ה-ELISA לסייטוקינים המתוארת בשלב 6.8 על שלוש בדיקות אלו.
  10. עבור IL-1β, IL-6, ו-TNF-α בדיקות ELISA, הוספה 100 µL של דגימת היפוקמפוס סטנדרטית או מדוללת באופן מתאים לכל באר, בשכפול, והדגרה ב- 37°C למשך 90 דקות. הוסף 100 µL של נוגדן זיהוי ביוטינילי (biotinylated) והדגירה ב- 37°C למשך 60 דקות.
  11. הוסף 100 µL של צמיד HRP לכל באר ב-ELISA של ציטוקינים ולהדגיר ב- 37°C במשך 30 דקות. פיתוח באמצעות מצע TMB ב- 37°C בחושך למשך כ-15 דקות.
  12. עבור בדיקת ה-SOD, ערבב 20 µL של עליון הומוגנאט מהיפוקמפוס עם 20 µL של תמיסת העבודה של האנזים ו- 200 µL של תמיסת התסביס. הדגירה תתבצע ב- 37°C במשך 20 דקות ומדוד את הבליעה באורך גל של 450 ננומטר.
  13. עבור בדיקת ה-GPx, ערבבו 200 µL של תפטוף הומוגנאט של ההיפוקמפוס עם תערובת התגובה המכילה GSH, והדגירה ב- 37°C במשך 5 דקות. סיימו את התגובה וסובבו את התערובת בצנטריפוגה במהירות של 3500 × ג במשך 10 דקות ב- 4°Cהעבירו את תסמיכי העילאי (supernatant) לתהליך פיתוח צבע למשך כ-15 דקות ומדדו את הבליעה באורך גל של 412 ננומטר באמצעות 200 µL של על-הנוזל של התגובה.
  14. עבור בדיקת ה-MDA, ערבב 100 µL של עליון הומוגנאט מההיפוקמפוס עם 1.0 מ"ל של תמיסת עבודה MDA, ולהדגיר ב- 95°C במקלחת מים למשך 40 דקות. יש לצנן ולסובב את התערובת בצנטריפוגה. העבר כ- 250 µL מהנוזל העליון לתוך פלטה מיקרוסקופית (microplate) ומדוד את הבליעה באורך גל של 532 ננומטר.
  15. עבור בדיקות ה-ELISA של הציטוקינים, קראו את הבליעה באורך הגל המצוין בערכה, בדרך כלל 450 ננומטר, תוך שימוש בתיקון אורך גל ייחוס במידה וזה זמין.
  16. ייצרו עקומת סטנדרט באמצעות מודל מתאים, כגון רגרסיה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים. נרמלו כל מדידת ביומארקר לתוכן החלבון הכולל.
  17. דווחו את ריכוזי הציטוקינים כ-pg/mg חלבון, את פעילות האנזימים הנוגדי חמצון כ-U/mg חלבון, ואת ה-MDA כ-nmol/mg חלבון, במידה והדבר תואם לערכה שנבחרה.

7. ניתוח נתונים ובקרת איכות

  1. חלץ את זמן החקירה המופנה לעבר האובייקט המוכר (Tfamiliar) ואל העבר האובייקט החדש (Tnovel) במהלך שלב הבדיקה של ה-NOR.
  2. חשב את מדד האפליה (DI) באופן הבא:
    figure-protocol-2.
    הערה: DI מעל 0.5 מעיד על העדפה לאובייקט החדש.
  3. הסר בעל חיים מניתוח ה-NOR כאשר זמן החקירה הכולל של האובייקטים (Tnovel + Tfamiliar) קצר מ-10 s. יש להחיל קריטריון זה לפני ניתוח ברמת הקבוצה ולדווח על כל ההסרות.
  4. הערך נורמליות עבור כל קבוצה באמצעות מבחן Shapiro–Wilk והומוגניות של השונות באמצעות מבחן Levene. עבור כל קבוצה, בחן את ה-DI לעומת רמת הסיכוי של 0.5 באמצעות מבחן t למדגם אחד דו-זנבי; אם הנחת הנורמליות אינה מתקיימת, השתמש במקום זאת במבחן Wilcoxon signed-rank למדגם אחד לעומת 0.5.
  5. קבע את ערך האלפא ל-0.05 לכל המבחנים הסטטיסטיים, אלא אם צוין אחרת.
  6. השווה את ה-DI בין קבוצות NSD ו-SD בלתי תלויות באמצעות מבחן t בלתי מזווג דו-זנבי כאשר הנחות הנורמליות והומוגניות השונות מתקיימות. במידה ולא, השתמש במבחן Mann–Whitney U.
  7. נתח את זמן החקירה של האובייקט המוכר לעומת החדש באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) דו-כיווני למדידות חוזרות, כאשר הקבוצה וסוג האובייקט הם הגורמים. בצע השוואות post hoc זוגיות עם תיקון Sidak ודווח על רווחי סמך של 95% לצד כל אומדני השוואת הקבוצות.
  8. השווה כל סמן ביולוגי (biomarker) של ההיפוקמפוס בין קבוצות NSD ו-SD בלתי תלויות באמצעות מבחן t בלתי מזווג דו-זנבי כאשר הנחות הנורמליות והומוגניות השונות מתקיימות. במידה ולא, השתמש במבחן Mann–Whitney U.
  9. בעת הערכת מספר סמנים ביולוגיים מאותה עשייה, בקר את שיעור התגליות השגויות (FDR) על פני פאנל הסמנים הביולוגיים באמצעות הליך Benjamini–Hochberg. דווח על ערכי p נומינליים ומתוקננים ל-FDR.
  10. בצע ניתוח עוצמה (power analysis) מסוג a priori באמצעות G*Power גרסה 3.1 עבור השוואת מדגמים בלתי תלויים דו-צדדית, כאשר מדד האפליה ב-NOR הוא התוצאה הראשונית. בסס את ההשפעה הצפויה על מחקרים שפורסמו בעבר המראים פגיעה חזקה בהעדפת אובייקטים חדשים בעקבות חסר שינה לאחר למידה.
  11. בצע ניתוח עוצמה a priori תוך שימוש בגודל אפקט סטנדרטי של Cohen’s d = 1.35, אלפא דו-צדדית של 0.05, עוצמה של 80% ויחס הקצאה של 1:1. פרמטרים אלו מניבים גודל מדגם מינימלי מחושב של 10 בעלי חיים לקבוצה.
    הערה: גודל האפקט נאמד מנתוני זיהוי אובייקטים שפורסמו בעבר9. Palchykova ואח' דיווחו על השפעת קבוצה משמעותית על משך חקירת אובייקט חדש במהלך שלב הבדיקה (F(1,16) = 8.26, p < 0.007) עבור עכברים שנמנעו מש giấcה מיד לאחר האימון לעומת ביקורות תואמות זמן (n = 9 לקבוצה), מה שמתאים ל-Cohen’s d ≈ 1.36. לפיכך, אומץ גודל אפקט סטנדרטי של d = 1.35 עבור ניתוח העוצמה של a priori.
  12. הגדל את גודל המדגם המתוכנן ב-20% ל-12 בעלי חיים לקבוצה (24 בעלי חיים בסך הכל) כדי לאפשר הסרות התנהגותיות או טכניות שנקבעו מראש. הגדר מראש כקריטריוני הסרה: חקירה כוללת של אובייקטים <10 s במהלך בדיקת NOR, הסרות הקשורות לרווחת בעלי החיים, הקלטות וידאו שאינן שמישות וכשל טכני של בדיקות רקמה/מדגמים.
  13. אל תסיר בעלי חיים על בסיס הכיוון או העוצמה של אפקט הטיפול שנצפה.
  14. בצע את הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות Python גרסה 3.12, SciPy גרסה 1.17 לבדיקת השערות וחישובי גודל אפקט, ו-statsmodels גרסה 0.14 לתיקון שיעור התגליות השגויות של Benjamini–Hochberg.
  15. בעת שימוש בפרוטוקול זה ליצירת סט נתונים רשמי, דווח על גדלי אפקט (למשל, Cohen's d להשוואות קבוצות) לצד ערכי p עבור כל המבחנים הסטטיסטיים המפורטים בשלבים 7.4–7.9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יישום מוצלח של פרוטוקול זה אמור להניב דפוס תוצאות התנהגותי-מולקולרי קוהרנטי מבלי להזדקק לפירוש של מדד בודד באופן מבודד. רצף הניסוי המלא מומחש ב-איור 1, ומכשיר ה-NOR והעיצוב הניסויי מוצגים ב-איור 2. בקבוצת ה-NSD, העכברים אמורים להפגין העדפה ברורה לאובייקט החדש, המתבטאת ב-DI מעל לרמת הסיכוי של 0.5. עכברים שנחשפו לפרוטוקול GH של 5 שעות לאחר האימון אמורים להראות העדפה מופחתת לאובייקט החדש ו-DI נמוך יותר מאשר בבישורי ה-NSD. סך זמן חקירת האובייקטים אמור להישאר דומה בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מספק מסגרת מהירה וניתנת לשחזור לחקר פגמים בזיכרון זיהוי ושינויים מולקולריים בהיפוקמפוס המושרים על ידי חסר שינה חריף. באמצעות החלה של 5 h של טיפול עדין מיד לאחר שלב למידה סטנדרטי של 10 min, הפרוצדורה פונה לחלון קונסולידציה מוגדר לאחר הלמידה ותוכננה להפחית את העומס הפיזי הקשור למודלים של חסר שינה ממושך או לפרוצדורות המבוססות על תנועה כפויה4,5. עם זאת, הגשה זו אינה כוללת מדידות ישירות של הורמוני סטרס כדי לאשש תגובת סטרס פיזיולוגית נמוכה יותר, כפי שנדון להלן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודים עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן טיפוח הנוער של בית החולים Nanjing Drum Tower, הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס׳ 82502706), ותוכנית המחקר הבסיסי של Jiangsu (מענק מס׳ BK20250258). כלים מבוססי בינה מלאכותית שימשו במהלך הכנת הטיוטה והעריכה של כתב היד, כולל עבור ניסוח ושיפור של הטקסט ויצירה ושיפור של איורים סכמתיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
70% אתנולכל ספקלא רלוונטיניקוי זירת ה-NOR והחפצים
עכברים זכרים בוגרים מסוג C57BL/6J (בגיל 8–12 שבועות)Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.לא רלוונטיבעלי חיים ניסייתיים
ערכה לבדיקת חלבון BCAThermo Fisher Scientific (Pierce)23225קביעת חלבון כולל ונורמליזציה
תוכנה לניתוח התנהגותNoldus Information Technology B.V.EthoVision XT גרסה 17.5ניקוד וניתוח של חקירת NOR
צנטריפוגה המסוגלת להגיע ל-14,000 × ג'רמנליים ב-t (g at) 4 °CEppendorfצנטריפוגה 5424 R; קטלוג 5404000610הבהרה של הומוגנאטים מההיפוקמפוס
ניקוי צינורות ניירכל ספקלא רלוונטיהתערבות של טיפול עדין
ציוד מיגון אישי לקריוגניקהכל ספקלא רלוונטיטיפול בטוח בחנקן נוזלי
ערכה למדידת גלוטתיון פראוקסידאז (Glutathione Peroxidase Assay Kit)Abcamab102530כימות GPx
הומוגניзатор רקמה של ההיפוקמפוסIKA-Werke GmbH & .Co. KGT 10 basic ULTRA-TURRAX; קט'. 0003737000הומוגניזציה של רקמת היפוקמפוס בבופר ליזיס
חנקן נוזליכל ספקלא רלוונטיהקפאה מהירה (Snap-freezing) של היפוקמפוסים מבודדים
ערכה לבדיקת MDASigma-AldrichMAK085כימות MDA
קורא מיקרופלט (Microplate reader)Agilent Technologies / BioTekספקטרופוטומטר למיקרופלטה BioTek Epoch 2מדידת בליעה באורכי הגל המפורטים בערכה
מיקרו-שפכטליםכל ספקלא רלוונטיניתוח היפוקמפוס; נעשה בקירור
IL-1 של עכברβ ערכה ל-ELISAR&D SystemsMLB00CIL-1β כימות
ערכה לבדיקת ELISA של IL-6 בעכברR&מערכות DM6000Bכימות IL-6
TNF- של עכברα ערכה ל-ELISAR&מערכות DMTA00BTNF-α כימות
מערכי אובייקטים A/A′ ו-Bכל ספקלא רלוונטישלבי ההכרות והבדיקה של ה-NOR
זירת NOR אטומה (40 סמ"ק × 40 ס"מ × 40 ס"מ)כל ספקלא רלוונטיבדיקות התנהגותיות
מערכת הקלטת וידאו עליונהBasler AGacA1300-60gmהקלטה בווידאו של מפגשי ההכראה ומפגשי הבדיקה של מבחן זיהוי חפצים חדשים (NOR)
תערובת מעכבי פרוטאז/פוספטאזThermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)78440נוסף לבאפר ליזיס בריכוז של 1× ריכוז עבודה (10 µL/mL מתוך 100× מלאי
בופר ליזיס RIPAThermo Fisher Scientific89900הומוגנציית רקמת היפוקמפוס
מבחנות דגימה המתאימות לאחסון קריוגניThermo Fisher Scientific (Nunc)Nunc CryoTube, 1.8 מ"ל; קטלוג 375418שמירה על מזהי דגימות ספציפיים לבעל חיים ואחסון של רקמת היפוקמפוס מבודדת
מברשת רכהכל ספקלא רלוונטיהתערבות של טיפול עדין
ערכת בדיקה ל-SODSigma-Aldrich19160כימות SOD
תוכנה לניתוח סטטיסטי וניתוח עוצמהG*Power; Python Software FoundationG*Power גרסה 3.1; Python גרסה 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)ניתוח עוצמה אפריורי (A priori) וניתוחים סטטיסטיים המתוארים בסעיף 7 של הפרוטוקול
מזון סטנדרטי למכרסמיםJiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.תזונת תחזוקה לחולדות/עכברים שהוקרנו; XTI01WC-010האכלת בעלי חיים באופן חופשי (Ad libitum)
−80 °C מקפיאHaier BiomedicalDW-86L626אחסון לטווח ארוך של רקמת היפוקמפוס שהוקפאה בהקפאה מהירה

מקורות

  1. Walker MP, Stickgold R. Sleep, memory, and plasticity. Annual Review of Psychology. 2006;57:139-166.
  2. Musiek ES, Holtzman DM. Mechanisms linking circadian clocks, sleep, and neurodegeneration. Science. 2016;354(6315):1004-1008.
  3. Havekes R, Abel T. The tired hippocampus: the molecular impact of sleep deprivation on learning and memory. Current Opinion in Neurobiology. 2017;44:33-39.
  4. Machado RB, Hipólide DC, Benedito-Silva AA, Tufik S. Sleep deprivation induced by the modified multiple platform technique: quantification of sleep loss and recovery. Brain Research. 2004;1004(1-2):45-51.
  5. Hagewoud R, et al. Sleep deprivation impairs spatial working memory and reduces clearance of hippocampal β-amyloid in rats. Neurobiology of Aging. 2013;34(1):22-30.
  6. Fenzl T, et al. Fully automated sleep deprivation in mice as a tool in sleep research. J Neurosci Methods. 2007;166(2):229-35.
  7. Ennaceur A, Delacour J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 1988;31(1):47-59.
  8. Leger M, et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 2013;8(12):2531-2537.
  9. Palchykova S, et al. Sleep deprivation impairs object recognition in mice. Neurobiology of Learning and Memory. 2006;85(3):263-271.
  10. Wadhwa M, et al. Sleep deprivation induces spatial memory impairment by altered hippocampus neuroinflammation and microglia activation in rats. Journal of Neuroimmunology. 2011;238(1-2):14-23.
  11. Silva RH, et al. Role of hippocampal oxidative stress in memory deficits induced by sleep deprivation in mice. Neuropharmacology. 2016;104:1-8.
  12. Wang Y, et al. Ellagic acid ameliorates sleep deprivation-induced cognitive impairment and neuroinflammation in mice. Aging. 2020;12(10):10327-10340.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מודל עכבריםטיפול עדיןציטוקינים פרו-דלקתייםסממנים לעקה חמצוניתאינטרלוקין-1 בטאגורם נמק גידולים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.