הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטוקול מיוטב ליצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע אנושיים רב-עצורים מושריים

231 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73561

⸱

3 בספטמבר 2026

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים כלי דם באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושראים של בני אדם.

תקציר

אורגנואידים וסקולריים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) התגלו כמודלים תלת-ממדיים עוצמתיים לחקר התפתחות כלי דם, מנגנוני מחלות ותגובות לתרופות. פרוטוקולים נוכחיים לאורגנואידים וסקולריים מאפשרים יצירה של רשתות אנדותל-פריציט המארגנות את עצמן; עם זאת, שונות בין סדרות (batch-to-batch variability), יצירה לא עקבית של אורגנואידים וכיסוי פריציטים לא מספק עלולים לפגוע בחזרתיות ובסקביליות. מחקר זה מציג פרוטוקול אופטימלי ליצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושריים (hiPSCs) עם שיפור בחזרתיות ובעקביות המבנית. שינויים מרכזיים כוללים תנאים מזוקקים ליצירת גופי Embryoid, ריכוזים ותזמון אופטימליים של גורמי גדילה במהלך השראת המזודרם והספציפיקציה הוסקולרית, ותנאי תרבית תלת-ממדיים משופרים המעודדים גיוס פריציטים חסון ואינטראקציות בין אנדותל לפריציטים. האורגנואידים האופטימליים מראים רשתות אנדותל חיוביות ל-CD31 בעלות הסתעפות גבוהה, העטופות בעקביות על ידי פריציטים חיוביים ל-PDGFR-β, עם שונות מופחתת משמעותית בין סדרות בהשוואה לפרוטוקול המקורי. סרטוני הדרכה מפורטים, שלב אחר שלב, מסופקים ליצירת האורגנואידים, אפיון באמצעות אימונופלורסנציה של דגימות שלמות (whole-mount) והערכת בקרת איכות. שיטה אופטימלית זו מאפשרת ייצור סקבילי של אורגנואידים וסקולריים באיכות גבוהה המתאימים לחקר אינטראקציות בין תאים וסקולריים, מידול מחלות וסריקת תרכובות, ובכך היא מפחיתה את החסם הטכני עבור מעבדות השואפות לאמץ מערכת מודל זו.

מבוא

אורגנואידים תלת-ממדיים (3D) הפכו לכלים רב עוצמה למידול התפתחות איברים ומחלות אנושיות in vitro, והם מציעים ביומימיקרי מבני ורלוונטיות פתופיזיולוגית עדיפה בהשוואה למודלים קונבנציונליים של תרביות תאים דו-ממדיות1,2. בשנים האחרונות, אורגנואידים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הוקמו בהצלחה עבור סוגי רקמות מרובים, כולל המעי3, המוח4,5, הכליה6, הכבד7,8, והרשתית9. עם זאת, אתגר מרכזי במחקרים מבוססי אורגנואידים הוא וסקולריזציה (היווצרות כלי דם) לא מספקת במהלך תרבית ארוכת טווח, מה שעלול להוביל להיפוקסיה ולנמק, ובכך לעכב את התרחבותם והבידול של האורגנואידים10,11. כדי להתגבר על מגבלה זו, הוצגו אסטרטגיות שונות של תרבית משולבת (co-culture), כולל שילוב של תאי אנדותל או תאי גזע מזנכימליים כדי לעודד יצירת רשת כלי דם12,13. עם זאת, תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות ומודלים של בעלי חיים אינם משחזרים באופן מלא את הביולוגיה הווסקולרית האנושית, בעוד שגישות של תרבית משולבת מוסיפות מורכבות ניסויית נוספת14. לפיכך, אורגנואידים וסקולריים המסוגלים לבצע וסקולריזציה אוטונומית מציעים חלופה מבטיחה ורלוונטית לבני אדם15.

היווצרות רשתות כלי דם כוללת הן וסקולוגנזה (vasculogenesis) והן אנגיוגנזה (angiogenesis), המנוהלות באמצעות אינטראקציות בין תאים אנדותליאליים לתאי דופן (mural cells), כגון פריציטים ותאי שריר חלק כליים, והן מווסתות באופן הדוק על ידי מספר מולקולות סיגנלינג, כולל VEGF (vascular endothelial growth factor), TGF-β (transforming growth factor-β), PDGF (platelet-derived growth factor) ואנגיופואיטינים16. בשנת 2019, Wimmer ועמיתיו ביססו שיטה להפקה של אורגנואידים של כלי דם תלת-ממדיים בעלי הרכבה עצמית ישירות מ-hPSCs17,18. מערכת זו מייצרת בו-זמנית תאים אנדותליאליים ופריציטים, מה שמוביל לרשתות מיקרו-וסקולריות עם היווצרות לומן (lumen) וכיסוי של קרום בסיס. בהתבסס על פלטפורמה זו, נעשה שימוש באורגנואידים וסקולריים כדי למדל וסקולופתיה סוכרתית תחת גירוי של גלוקוז גבוה וציטוקינים פרו-דלקתיים (TNF-α ו-IL-6); אורגנואידים אלו משחזרים את העיבוי של קרום הבסיס, סימן היכר של פתולוגיה מיקרו-וסקולרית סוכרתית17. בנוסף, מודל זה שימש למחקר של מחלות וסקולריות תורשתיות וכפלטפורמה לסריקת רעילות וסקולרית19. לאחרונה, מספר מחקרים מונחי-שיטה ביקשו לאופטימיזציה של הפקת אורגנואידים וסקולריים. לדוגמה, התקדמות בריצוף RNA של תא בודד (single-cell RNA sequencing) זיהתה גורמים רגולטוריים מרכזיים, כגון MECOM ו-LEF1, ובכך סיפקה מסגרת מולקולרית לאפיון ואופטימיזציה של היווצרות אורגנואידים וסקולריים אנושיים. בנוסף, Xu וחב' הציגו בארות מיקרוסקופיות (microwells) כדי להקל על היווצרות הומוגנית של גופי עובר (embryoid bodies) ושילבו את תערובת ה-CEPT לשיפור חיוניות התאים, ובכך הפחיתו ביעילות את השונות בין סדרות ייצור20.

על מנת לשפר את ההומוגניות, השחזוריות והתפוקה של יצירת אורגנואידים כלי דם, הפרוטוקול המקורי שתואר על ידי Wimmer et al.17,18 עבר אופטימיזציה שיטתית כדי לטפל בכמה מגבלות מרכזיות. ראשית, הפרוטוקול המקורי משתמש באגרגציה טבעית בצלחות בעלות הידבקות נמוכה ליצירת גופי Embryoid, מה שעלול להוביל לשונות ניכרת בין סדרות בגודל האגרגטים, וכתוצאה מכך, ליעילות דיפרנציאציה הטרוגנית. בפרוטוקול שעבר אופטימיזציה, Polyvinyl alcohol (PVA) משולב עם ניעור אורביטלי במהלך יצירת האגרגטים כדי לקדם אגרגציה תאית אחידה ולשפר את העקביות בגודל גופי ה-Embryoid. שנית, הפרוטוקול המקורי משתמש בהחלפה מלאה של המדדיום במהלך שלב יצירת רשת כלי הדם, דבר שעלול לגרום לתנודות משמעותיות בריכוזי גורמי גדילה ולפגוע בניבּוּת כלי דם (vascular sprouting) מתמשכת ובגיוס פריציטים. בניגוד לכך, הפרוטוקול שעבר אופטימיזציה שומר על שליש מהמדדיום המותנה (conditioned medium) בכל החלפת מדדיום, כדי לשמר גורמים פרו-אנגיוגניים אנדוגניים ולהייצב את סביבת התרבית. שלישית, הפרוטוקול המקורי דורש העברות מרובות של צלחות במהלך בידוד והבשלת האורגנואידים, מה שמגביר את דרישות הטיפול ואת הסיכון לאובדן אורגנואידים. הפרוטוקול שעבר אופטימיזציה עוקף שלבים אלו על ידי העברה של אורגנואידים מבודדים באופן פרטני לבארים של צלחות 96-בארים בעלות הידבקות נמוכה, ובכך מפשט את ההליך ומגדיל את התפוקה. במקרה זה, פרוטוקול אופטימלי זה מספק נהלים מפורטים שלב אחר שלב ונקודות בקרה קריטיות לאיכות, כדי להנמיך את החסום הטכני לאימוץ מערכת מודל זו ולהקל על יישום רחב יותר של אורגנואידים כלי דם במחקרי התפתחות כלי דם, מנגנוני מחלות וסריקת תרופות בתפוקה גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בתאי hPSCs במחקר זה אושר על ידי הוועדה לאתיקה ביו-רפואית של אוניברסיטת אנהוי (BECAHU_2026-010).

1. תחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם

הערה: יש לתחזק תאי גזע פלוריפוטנטיים מושגעיים מהם הופקו מבני אדם (hiPSCs) בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder-free). יש לבצע את כל הפרוצדורות במCבטיחות ביולוגית Class II תוך שימוש בטכניקה אספטית.

  1. הכנת פלטות תרבית מצופות במטריצת קרום בסיס
    1. הוצא מבחנה של מטריצת קרום בסיס מ-−20 °C והפשר אותה ב-4 °C למשך לילה, בערך 12–16 שעות. הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.
    2. ערבב היטב את מטריצת קרום הבסיס המופשרת תחת תנאים סטריליים וחלק אותה לאליקוואוטים לשימוש חד-פעמי (למשל, 1 mL לכל מבחנה). אחסן את האליקוואוטים ב-−20 °C למשך עד שנתיים.
      הערה: שמור על מטריצת קרום הבסיס, הפפיטות, הטיפים והמבחנות קרים במהלך הטיפול כדי למנוע התמצקות מוקדמת. הימנע מהחדרת בועות אוויר.
    3. הפשר את אליקוואוט מטריצת קרום הבסיס הדרוש על קרח. דלל את מטריצת קרום הבסיס ביחס של 1:200 ב-DMEM שקוילל מראש (5 µL של מטריצת קרום בסיס לכל 1 mL של DMEM; ריכוז סופי, בערך 5 µg/mL).
    4. ערבב את התמיסה בעדינות באמצעות פפיטה עד שלא יישארו חלקיקים גלויים.
    5. הוסף 0.5 mL של מטריצת קרום בסיס מדוללת לכל באער של פלטה בעלת 12 באערים. הטה וסובב בעדינות את הפלטה כדי לצפות את כל פני השטח התחתונים.
    6. דגור את הפלטה המצופה ב-37 °C באינקובטור עם 5% CO₂ למשך לפחות שעתיים או ב-4 °C למשך לילה.
      הערה: אחסן פלטות מצופות ואטומות ב-4 °C למשך 1–2 שבועות. הבא את הפלטה לטמפרטורת החדר ושאב את תמיסת הציפוי מיד לפני השימוש.
  2. הפשרת hiPSCs
    1. הוצא מבחנה קריובית של hiPSCs קפואים מחנקן נוזלי והנח אותה מיד באמבט מים ב-37 °C. נער בעדינות את המבחנה והוצא אותה תוך דקה אחת, כאשר נותרו רק מספר גבישי קרח קטנים.
      הערה: הימנע מחשיפה ממושכת לדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ב-37 °C ומהפשרה חלקית, שכן שניהם עלולים להפחית את חיוניות התאים.
    2. חטא את החלק החיצוני של המבחנה הקריובית עם אתנול 70% ופתח אותה בתוך מCבט ביולוגי.
    3. העבר לאט את תרחיף התאים בטיפות למבחנה קונית של 15 mL המכילה 3 mL של מצע תחזוקה מוגדר כימית ל-hPSC שחומם מראש, או מצע תחזוקה מוגדר כימית שווה ערך. ערבב בעדינות במהלך ההעברה כדי לדלל את ה-DMSO בהדרגה ולמזער עקה אוסמוטית.
    4. צנטריפוג את התאים ב-300 × g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (22–24 °C) באמצעות רוטור עם דליים נעים (swinging-bucket).
    5. שאב בזהירות את הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע התאים. השהה בעדינות את המשקע ב-1 mL של מצע תחזוקה מוגדר כימית ל-hPSC שחומם מראש.
      הערה: השתמש בפפיטת P1000 ופפיט בעדינות 2–3 פעמים כדי למזער גזירה מכנית והיווצרות בועות.
  3. זריעה ותרבית של hiPSCs
    1. הוצא את פלטת 12 הבאערים המצופה מראש מהאינקובטור ושאב את תמיסת הציפוי. אל תשטוף את הבאערים.
    2. זרוע בערך 1 × 105–2 × 105 תאים חיוניים לכל באער לצורך התאוששות שגרתית לאחר הפשרה. התאם את הצפיפות בהתאם לקו ה-hiPSC ולדרישות הניסוי.
    3. הזרק את תרחיף התאים לאט לאורך הדופן של כל באער מבלי לגעת במשטח המצופה עם טיפ הפפיטה.
    4. הוסף Y-27632 לריכוז סופי של 5 µM כדי לקדם את הישרדות התאים והיצמדותם לאחר ההפשרה.
      הערה: השתמש ב-Y-27632 רק במצע הזריעה הראשוני. החלף אותו במצע תחזוקה מוגדר כימית ל-hPSC ללא Y-27632 למחרת.
    5. דגור את התאים ב-37 °C עם 5% CO₂ ולחות רוויה.
    6. בחן את היצמדות התאים והמורפולוגיה שלהם לאחר כ-16–24 שעות. שאב את המצע והחלף אותו במצע תחזוקה מוגדר כימית ל-hPSC טרי שחומם מראש וללא Y-27632.
    7. החלף את המצע מדי יום או מדי יומיים עד שהתאים יגיעו לכ-70%–80% התמלאות (confluency) לצורך מעבר (passaging) או דיפרנציאציה.
      הערה: בחן את התרביות מדי יום. השתמש במושבות בעלות גבולות הדוקים ומוגדרים היטב, יחס גרעין-ציטופלזמה גבוה ודיפרנציאציה ספונטנית מינימלית.

2. יצירה ודיפרנציאציה של אגרגטים של hiPSC

הערה: תחזקו hiPSCs בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder-free) במצע תחזוקה מוגדר כימית ל-hPSC על צלחות מצופות במטריקס של קרום הבסיס (basement membrane matrix). בצעו מעבר (Passage) לתאים כל 4–5 ימים באמצעות 0.02% EDTA. השתמשו בתרביות בעלות צפיפות זריעה וגודל מושבה מתאימים ועם מינימום התמיינות ספונטנית כדי למקסם את יעילות ההתמיינות הווסקולרית.

  1. הכנת תרחיף תאים בודדים
    1. שאבו את מצע התחזוקה המוגדר כימית עבור hPSC ושטפו את תאי ה-hiPSC ב-0.5 מ"ל של DMEM לכל באר בלוח בעל 6 בארות.
    2. שאבו את ה-DMEM והוסיפו 0.5 מ"ל של EDTA בריכוז 0.02% לכל באר. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך 2–4 דקות ועקבו אחר התאים עד אשר יתחילו להפוך לעגולים.
    3. נתקו את התאים באמצעות פיפט P1000. בצעו פיפוט עדין 2–3 פעמים כדי לפרק את הצבירים לתלים של תאים בודדים.
    4. שחלו את התאים ב-5 מ"ל של מצע תחזוקה מוגדר כימית ל-hPSC והעבירו את התוךליית לפיפטה קונית של 15 מ"ל.
    5. ערבב 10 µL של תרחיף התאים עם 10 µL של תמיסת Trypan blue בריכוז 0.1%. טענו 10 µL של התערובת אל תוך תא ספירה וקבעו את מספר התאים החיים.
    6. חשבו את נפח תרחיף התאים הדרוש כדי לקבל 5 × 105 תאים חיים לכל באר.
    7. סובב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 300 × ג במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (22–23 °Cשאבו את הנוזל העליון (supernatant).
    8. ששוב את התאים במצע תחזוקה טרי ומוגדר כימית ל-hPSC המכיל 50 µM Y-27632 בנפח של 3 מ"ל לכל באר.
  2. היווצרות אגרגטים
    1. הוסיפו 3 מ"ל מת сусפנסיית התאים לכל באר בלוח 6 באערים בעל היצמדות נמוכה (low-attachment 6-well plate). הוסיפו PVA עד לריכוז סופי של 0.25%.
    2. הניחו את הפלטה על ניעור מסלולית (orbital shaker) במהירות של 50 סבובים לדקה (rpm) והדגרימו ב- 37 °C למשך יום אחד.
    3. אשרו את היווצרותם של אגרגטים בעל גבולות חלקים ובקוטר של כ-50–100 µm או יותר לפני שממשיכים.
    4. הערה: יש לבצע אופטימיזציה של תקופת האגרגציה עבור קווי hiPSC בודדים. יש להאריך את הדגירה ל-2–3 ימים במידת הצורך כדי להשיג אגרגטים בגודל הרצוי.
  3. השראת ברחמון (Mesoderm induction)
    1. ביום 0, העבירו את האגרגטים למבחנה קונית בנפח 15 מ"ל באמצעות פיפטה חד-פעמית סטרילית בנפח 10 מ"ל. שמרו את פלטת ההצמדה הנמוכה (low-attachment plate) המקורית לצורך זריעה מחדש.
    2. אפשרו לצברים לשקוע בכוח הכבידה למשך כ-15–20 דקות.
    3. הערה: יש לטפל בצבירים בעדינות ולהשתמש בשיקוע בכוח הכבידה במקום בצנטריפוגה כדי לצמצם נזק מכני.
    4. שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) לאחר שהצבירים שקעו.
    5. השביה מחדש את הצברים ב-3 מ"ל למבב של מצע N2B27 בתוספת של 12 µM CHIR99021 ו-30 ננוגרם/מ"ל BMP-4.
    6. העבירו את הצבירים חזרה לפלטה בעלת היצמדות נמוכה (low-attachment plate) והדגרירו ב- 37 °C.
    7. העבירו את הצברים בעדינות באמצעות פיפטה P1000 פעם ביום, כדי לצמצם התמזגות מופרזת של הצברים. המשיכו באינדוקציית המזודרמה למשך 3 ימים.
  4. השראת שושלת כלי דם
    1. ביום ה-3, העבירו את הצבירים למבחנה קונוית של 15 מ"ל והניחו להם לשקוע בכוח הכבידה. שמרו את פלטת 6 הבארות המקורית.
    2. שאבו בזהירות את העילאי לאחר שהצברים שקעו.
    3. שחזרו את התלחיות (aggregates) ב-3 מ"ל למבחנה של מצע N2B27 המועשר ב-100 נג/מ"ל VEGF-A ו- 2 µM פורסקולין (forskolin).
    4. העבירו את האגרגטים בחזרה לפלטה בעלת 6 בארות עם הידבקות נמוכה (low-attachment 6-well plate) דגרו למשך יומיים נוספים.

3. יצירה של רשתות כלי דם ואורגנואידים

  1. הכנה של מטריצת קולגן I–קרום הבסיס (basement membrane matrix)
    1. אספו את האגרגטים שנוצרו בפלטה אחת בעלת 6 בארות לצורך השקה בפלטה אחת בעלת 12 בארות. השתמשו בכ-40–60 אגרגטים לכל בארה.
    2. הכינו תערובת מספקת של מטריצת קולגן I–קרום הבסיס כדי להוסיף שתי שכבות של 0.5 mL לכל בארה בפלטה בעלת 12 הבארות.
    3. הכינו 12 mL של מטריצה עבור פלטה אחת בעלת 12 בארות. שמרו את כל הרכיבים על קרח, הכינו את התערובת מיד לפני השימוש, והימנעו מהחדרת בועות אוויר.
    4. הוסיפו 0.5 mL של מטריצה לכל בארה בפלטה בעלת 12 הבארות. סובבו בעדינות את הפלטה כדי לפזר את המטריצה באופן אחיד.
    5. דגרו את הפלטה ב-37 °C למשך 2 שעות כדי לאפשר לשכבת המטריצה הראשונה להתמצק.
  2. השקה של האגרגטים
    1. העבירו את האגרגטים למבחנה קונית של 15 mL באמצעות פפיטה חד-פעמית סטרילית של 10 mL והמתינו עד ש ישקעו בכוח הכבידה.
    2. שאבו את העליון (supernatant) ושטפו את האגרגטים פעמיים עם 1 mL של מצע N2B27. הסירו כמה שיותר מצע שאריות לאחר השטיפה האחרונה.
    3. הכינו תערובת רעננה של מטריצת קולגן I–קרום הבסיס ושמרו אותה על קרח.
    4. סספנדו מחדש את האגרגטים השטופים בעדינות בתוך המטריצה שהוכנה טרי.
    5. הוציאו מהמדגרה את הפלטה בעלת 12 הבארות המכילה את השכבה הראשונה הממוצקת.
    6. הוסיפו 0.5 mL מהמטריצה המכילה את האגרגטים לכל בארה.
    7. נערו בעדינות את הפלטה למשך לא יותר מ-1 דקה כדי לפזר את האגרגטים באופן אחיד.
    8. דגרו מיד את הפלטה ב-37 °C למשך 2 שעות כדי לאפשר לשכבה השנייה להתמצק.
  3. השראה של ניבוב כלי דם (vascular sprouting)
    1. חממו מראש מצע N2B27 המועשר ב-15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A ו-100 ng/mL FGF-2 לטמפרטורה של 37 °C.
    2. הוסיפו את המצע המועשר שחומם מראש לכל בארה כדי להשריע דיפרנציאציה וסקולרית.
    3. עקבו אחר התרביות לאיתור ניבוב כלי דם במהלך 1–3 הימים הבאים.
    4. הערה: חממו את המצע ל-37 °C לפני הוספתו לתרביות כדי לצמצם את דה-סטביליזציה של מטריצת הג'ל.
  4. החלפת מצע ותחזוקת התרבית
    1. בצעו את החלפת המצע הראשונה 3 ימים לאחר ההשקה.
    2. החליפו את המצע מדי יומיים לאחר מכן, תוך שימוש במצע N2B27 רענן המכיל 15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A ו-100 ng/mL FGF-2.
    3. שמרו שליש מהמצע המותנה (conditioned medium) בכל החלפת מצע, והחליפו את שני השלישים הנותרים במצע מועשר רענן.
  5. המשיכו לבידוד אורגנואידים וסקולריים ביום 10.

4. הקמת אורגנואידים וסקולריים והכנה לצביעה

  1. בידוד של רשתות כלי דם בודדות
    1. החדירו את הקצה המעוגל של שפתולה (spatula) סטרילית לאורך דופן הבאר ונתקו בעדינות את מטריצת הג'ל מהתחתית.
    2. המשיכו להניע את השפתולה מדופן הבאר לעבר המרכז עד שכל מטריצת הג'ל תצוף בחופשיות.
    3. השתמשו בשתי מחטים סטריליות כדי להוציא רשתות כלי דם בודדות מהג'ל. הסירו כמה שיותר ממטריצת העודפים מבלי לפגוע ברשת כלי הדם.
  2. תרבית של אורגנואידים מבודדים
    1. העבירו כל אורגנואיד מבודד ישירות לבאר בודדת בלוח 96-בארים בעל היצמדות נמוכה (low-attachment) באמצעות פיפטה סטרילית חד-פעמית.
    2. הוסיפו 100 µL של מצע N2B27 המועשר ב-15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A, ו-100 ng/mL FGF-2 לכל באר.
    3. הדגרימו את האורגנואידים למשך 5 ימים נוספים והחליפו את המצע המועשר מדי יום.
    4. וודאו כי האורגנואידים מראים מורפולוגיה עגולה ומעטפת מלאה עד היום ה-5 של ההבשלה.
  3. קיבוע של אורגנואידים של כלי דם
    1. העבירו אורגנואידים בשלים מורפולוגית לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 mL. עבדו לא יותר מכ-60 אורגנואידים למבחנה.
    2. שאבו בזהירות את המצע והוסיפו 4% paraformaldehyde (PFA) ב-PBS.
    3. קבעו את האורגנואידים בטמפרטורת החדר למשך 1 h.
      זהירות: PFA רעיל וחשוד כחומר מסרטן. טיפול ב-PFA יתבצע במכסה מסיס כימיים תוך써 wearing ציוד מגן אישי מתאים.
    4. שאבו את ה-PFA והחליפו אותו ב-PBS.
      נקודת עצירה: ניתן לשמור אורגנואידי כלי דם מקובעים ב-PBS בטמפרטורה של 4 °C למשך עד חודש אחד.

5. צביעה ודימוי קונפוקאלי של אורגנואידים כלי דם

  1. חסימה (Blocking) וחדירות (Permeabilization)
    1. הוסיפו 2 mL של תמיסת חסימה לכל מבחנה המכילה אורגנואידים וסקולריים מקובעים.
    2. הציבו את המבחנות בצורה אנכית על שייקר אורביטלי והדגרימו עם ערבוב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות כדי לחסום ולהגביר את החדירות של האורגנואידים.
  2. דגירה עם נוגדן ראשוני
    1. שאבו את תמיסת החסימה והוסיפו 50–100 µL של נוגדן ראשוני המדולל 1:100 בתמיסת חסימה.
    2. הציבו את המבחנות במצב זקוף על שייקר והדגרימו עם ערבוב ב-4 °C למשך לילה.
  3. שטיפה ודגירה עם נוגדן שני
    1. שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBST למשך 10–15 דקות לכל שטיפה. ערבבו את המבחנות המונחות אנכית במהלך כל שטיפה.
    2. הוסיפו נוגדן שני פלורסצנטי המדולל 1:300 בתמיסת חסימה.
    3. הדגרימו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
  4. צביעה נגדית של הגרעין ושטיפה סופית
    1. שטפו את הדגימות פעמיים עם PBST למשך 10–15 דקות לכל שטיפה.
    2. הוסיפו תמיסת Hoechst המדוללת 1:5,000 ב-PBS והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 10–15 דקות.
    3. שטפו את הדגימות עם PBS למשך 10–15 דקות.
  5. דימות קונפוקאלי
    1. העבירו את האורגנואידים הצבועים לצלוחיות לדימות קונפוקאלי.
    2. רכשו תמונות קונפוקאליות תוך שימוש בפרמטרי דימות עקביים בכל הקבוצות הניסיוניות.
  6. ניתוח תמונה כמותי של אורגנואידים וסקולריים
    הערה: בצעו ניתוח תמונה כמותי באמצעות Fiji/ImageJ ו-AngioTool. שמרו על הגדרות רכישת מיקרוסקופ זהות בכל הקבוצות הניסיוניות.
    1. מדידת קוטר אגרגאטים
      1. רכשו תמונות בשדה בהיר (bright-field) של אגרגאטים של hiPSC ביום 0 באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם סרגל כיול. צלמו אגרגאטים מופרדים היטב וכללו סרגל קנה מידה.
      2. ייבאו כל תמונה ל-Fiji/ImageJ. שרטטו קו לאורך סרגל קנה המידה באמצעות כלי ה-Straight Line ובחרו Analyze > Set Scale.
      3. הזינו את המרחק והיחידה הידועים (למשל, 100 µm) ובחרו Global כדי להחיל את הכיול על כל התמונות בסשן.
      4. שרטטו קו לאורך הקוטר הרחב ביותר של כל אגרגאט באמצעות כלי ה-Straight Line. בחרו Analyze > Measure או לחצו Ctrl+M ורשמו את הקוטר ב-µm.
      5. מדדו לפחות 30 אגרגאטים לכל סדרה.
      6. עבור אגרגאטים שאינם כדוריים, תחמו כל אגרגאט באמצעות כלי הבחירה Oval או Polygon. בחרו Analyze > Set Measurements > Feret's diameter ורשמו את המדידה.
      7. ייצאו את המדידות מטבלת התוצאות (Results) ורכזו את הנתונים בגיליון אלקטרוני.
      8. חשבו את הממוצע, סטיית התקן (SD) ומקדם השונות (CV) לפי הנוסחה CV = SD/mean × 100% עבור כל סדרה.
    2. מדידת קוטר אורגנואידים
      1. רכשו תמונות בשדה בהיר של אורגנואידים וסקולריים בוגרים ביום 15 באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם סרגל כיול. כללו סרגל קנה מידה בכל תמונה.
      2. ייבאו כל תמונה ל-Fiji/ImageJ וכיילו את קנה המידה כפי שמתואר בשלב זה.
      3. שרטטו קו לאורך הקוטר הרחב ביותר של כל אורגנואיד באמצעות כלי ה-Straight Line. בחרו Analyze > Measure או לחצו Ctrl+M ורשמו את הקוטר ב-µm.
      4. מדדו לפחות 30 אורגנואידים לכל סדרה.
      5. עבור אורגנואידים בעלי צורה לא סדירה, מדדו את הקוטרים הארוך והקצר ביותר וחשבו את הממוצע שלהם, או קבעו את קוטר Feret כפי שמתואר בשלב 5.6.1.6.
      6. ייצאו את המדידות וחשבו את הממוצע, ה-SD וה-CV עבור כל סדרה.
    3. כימות של שטח וסקולרי חיובי ל-CD31
      1. רכשו תמונות z-stack קונפוקאליות של אורגנואידים שלמים (whole-mount) מהיום ה-15 הצבועים ל-CD31. השתמשו בעוצמת לייזר, הגבר (gain), offset והגדרות pinhole זהות עבור כל הדגימות.
      2. ייצרו השצאות בעוצמה מקסימלית (MIPs) מה-z-stacks באמצעות תוכנת המיקרוסקופ או Fiji/ImageJ.
      3. החילו סף עוצמה (intensity threshold) כדי להפריד את הרשת הוסקולרית החיובית ל-CD31 תוך ה exclusion של אות הרקע.
      4. בחרו Process > Noise > Remove Outliers והשתמשו ברדיוס של 2–5 פיקסלים כדי להסיר ארטיפקטים קטנים. בחרו Process > Binary > Fill Holes כדי למלא חללים קטנים בתוך הרשת הוסקולרית.
      5. בחרו Analyze > Set Measurements והפעילו את Area ו- Area fraction. בחרו Analyze > Measure כדי לקבוע את השטח הוסקולרי.
      6. חשבו את השטח הוסקולרי החיובי ל-CD31 כאחוז מהשטח הכולל של האורגנואיד.
      7. נתחו לפחות שלושה אורגנואידים לכל סדרה משלוש סדרות עצמאיות. ייצאו את המדידות לניתוח סטטיסטי.
    4. כימות של כיסוי פריסייטים (pericytes) חיוביים ל-PDGFR-β
      1. רכשו תמונות z-stack קונפוקאליות של אורגנואידים שלמים מהיום ה-15 הצבועים ל-CD31 ו-PDGFR-β. ייצרו MIPs מה-z-stacks.
      2. ייבאו את ה-MIPs של CD31 ו-PDGFR-β ל-Fiji/ImageJ ואששו את יישור התמונות.
      3. החילו סף (threshold) על ערוץ CD31 כדי לייצר מסיכה בינארית המגדירה את הרשת הוסקולרית.
      4. החילו סף על ערוץ PDGFR-β באמצעות אותה גישת סגמנטציה כדי לייצר מסיכה בינארית של אות הפריסייטים.
      5. בחרו Process > Image Calculator והחילו את פעולת ה- AND על המסיכות של CD31 ו-PDGFR-β כדי לזהות פיקסלים חופפים.
      6. מדדו את השטח של האות החופף.
      7. חשבו את כיסוי הפריסייטים כ- (שטח חיובי ל-PDGFR-β בתוך כלי דם חיוביים ל-CD31 / סך השטח הוסקולרי החיובי ל-CD31) × 100%.
      8. נתחו לפחות שלושה אורגנואידים לכל סדרה משלוש סדרות עצמאיות. ייצאו את המדידות לניתוח סטטיסטי.
    5. ניתוח מדד הת branching באמצעות AngioTool
      1. רכשו תמונות z-stack קונפוקאליות של אורגנואידים שלמים מהיום ה-15 הצבועים ל-CD31. ייצרו MIPs מה-z-stacks.
      2. הפעילו את AngioTool וטענו את תמונת ה-MIP.
      3. הגדירו את קוטר כלי הדם בהתאם לקוטר כלי הדם הטיפוסי שנצפה בתמונות.
      4. כוון את סף העוצמה כדי להפריד את הרשת הוסקולרית תוך ה exclusion של אות הרקע. הגדירו את גודל כלי הדם המינימלי כדי להסיר ארטיפקטים קטנים.
      5. הריצו את הניתוח ורשמו את שטח כלי הדם, צפיפות כלי הדם, אורך כולל של כלי דם, מספר צומתים ומדד הת branching.
      6. אששו את תמונת הפלט על ידי אישור שמרשת כלי הדם תוחמה בצהוב, השלד הוסקולרי מוצג באדום ונקודות הפיצול מסומנות בנקודות כחולות.
      7. ייצאו את התוצאות הכמותיות מ-AngioTool.
      8. נתחו לפחות שלושה שדות ראייה לכל סדרה משלוש סדרות עצמאיות ורכזו את הנתונים לניתוח סטטיסטי.

6. אנליזה כמותית של PCR בזמן אמת (real-time PCR) של אורגנואידים וסקולריים

הערה: יש לבצע את כל תהליכי בידוד ה-RNA וההליכים הבאים בתנאים נקיים מ-RNase.

  1. הפקת RNA
    1. אסוף 5–10 אורגנואידים כלי דם בוגרים מיום 15 לתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL נטולת RNase. הסר את שאריות המצע לחלוטין.
      הערה: כאשר הדבר נחוץ, אחת את מספר אורגנואידים כדי להשיג כמות RNA מספקת.
    2. הוסף 350 µL של לysis buffer (בופר ליזיס) מועשר ב-1% β-mercaptoethanol.
    3. בצע פיפטינג של הדגימות 10–15 פעמים עד שהאורגנואידים יעברו ליזיס מלא.
    4. העבר את הליזט לעמודת ספין להסרת DNA גנומי הממוקמת במבחנת איסוף. צנטריפוגה במהירות של 11,000 × g למשך 30 s בטמפרטורת החדר.
    5. השלך את העמודה ושמור את הנוזל שעבר (flow-through).
    6. הוסף לנשפש נפח שווה של אתנול 70%, כ-350 µL, וערוב היטב באמצעות פיפטינג.
    7. העבר עד 700 µL מהתערובת לעמודת ספין ל-RNA הממוקמת במבחנת איסוף. צנטריפוגה במהירות של 11,000 × g למשך 30 s והשלך את הנוזל שעבר.
    8. הוסף 350 µL של wash buffer 1 (בופר שטיפה 1) לעמודה. צנטריפוגה במהירות של 11,000 × g למשך 30 s והשלך את הנוזל שעבר.
    9. הכן תערובת DNase I על ידי ערבוב של 10 µL של DNase I עם 70 µL של בופר עיכור DNase לכל דגימה.
    10. הוסף 80 µL מתערובת ה-DNase I ישירות לממברנת העמודה והדגר בטמפרטורת החדר למשך 15 min.
    11. הוסף 350 µL של wash buffer 1 לעמודה. צנטריפוגה במהירות של 11,000 × g למשך 30 s והשלך את הנוזל שעבר.
    12. הוסף 500 µL של wash buffer 2 (בופר שטיפה 2) לעמודה. צנטריפוגה במהירות של 11,000 × g למשך 30 s והשלך את הנוזל שעבר.
    13. חזור על השטיפה עם 500 µL של wash buffer 2.
    14. צנטריפוגה את העמודה הריקה במהירות של 11,000 × g למשך 2 min לייבוש הממברנה.
    15. העבר את העמודה למבחנה למיקרוצנטריפוגה רעננה של 1.5 mL נטולת RNase. הוסף 30–50 µL של מים נטולי RNase ישירות לממברנה והדגר בטמפרטורת החדר למשך 1 min.
    16. צנטריפוגה במהירות של 11,000 × g למשך 1 min כדי לאלות את ה-RNA. שמור את ה-RNA בטמפרטורה של −80 °C עד לשימוש.
      הערה: העריך את ריכוז ה-RNA ואת טוהרו באמצעות ספקטרופוטומטריה. השתמש ביחס A260/A280 של 1.8–2.1 כטווח מקובל.
  2. סינתזת cDNA
    1. הכן את תערובת תגובת השעתוק ההפוך על קרח.
    2. ערבב 600 ng של RNA כולל עם 4 µL של RT master mix המכיל reverse transcriptase, בופר, dNTPs ופריימרים אקראיים. הוסף מים נטולי RNase עד לנפח סופי של 20 µL.
    3. הדגר את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 min, ולאחר מכן ב-85 °C למשך 5 s.
    4. שמור את ה-cDNA שהתקבל בטמפרטורה של −20 °C עד לשימוש.
  3. qPCR כמותי בזמן אמת
    1. הכן 9 µL של qPCR master mix לכל תגובה על ידי ערבוב של 5 µL של 2× SYBR Green master mix, 3 µL של מים נטולי RNase, ו-1 µL של פריימרים קדמיים ואחוריים מעורבבים מראש בריכוז של 10 µM לכל אחד.
    2. חלק 9 µL של master mix לכל באר בפלטת qPCR של 96 באערים.
    3. הוסף 1 µL של cDNA לכל באר כדי להגיע לנפח תגובה סופי של 10 µL.
    4. אטום את הפלטה בעזרת סרט דביק אופטי (optical adhesive film) וצנטריפוגה במהירות של 1,000 × g למשך 1 min.
    5. בצע דנטורציה ראשונית ב-95 °C למשך 30 s.
    6. בצע 40 מחזורי הגברה של 95 °C למשך 5 s ואחריהם 60 °C למשך 30 s.
    7. בצע אנליזת עקומת התכה (melt-curve analysis) כדי לאשש את ספציפיות האמפליקון.
      הערה: הרץ כל דגימה בכפולה או בשלישייה.
    8. חשב ביטוי יחסי של הגן מטרה באמצעות שיטת 2−ΔΔCt. נרמל את ערכי ה-Ct לגן בית (housekeeping gene) כגון GAPDH, וכוייל את הביטוי אל מול דגימות hiPSC לא מובחנות.

7. ניתוח סטטיסטי

  1. הצג נתונים כמותיים כערך ממוצע ± סטיית תקן (SD) משלושה שחזורים ביולוגיים עצמאיים לפחות (n ≥ 3) לכל תנאי.
  2. יש להתייחס לכל סבב (batch) עצמאי כשכפול ביולוגי אחד עבור מדידות קוטר האגרגטים והאורגנואידים, ולחשב ממוצע של 30 המבנים האינדיבידואליים שנמדדו בתוך כל סבב כדי לקבל ערך ממוצע אחד לרמת הסבב.
  3. מדידות של שטח כלי דם ממוצע, כיסוי פריציטים ומדד הסתעפות ממספר אורגנואידים או שדות בתוך כל סבב (batch), כדי לקבל ערך יחיד ברמת הסבב, ושימוש בערכים אלו ברמת הסבב לצורך השוואות סטטיסטיות.
  4. השוו את הפרוטוקול המותאם (optimized protocol) לפרוטוקול Wimmer המקורי באמצעות מבחן t של Student דו-זנבי למדגמים בלתי זוגיים. t-בדיקה.
  5. הגדירו מובהקות סטטיסטית כ- p < 0.05. ציין את רמות המובהקות כ- p < 0.05, p < 0.01, ו- p < 0.001, לפי העניין.
  6. בצע את כל הבדיקות הסטטיסטיות באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי גרסה 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול האופטימלי המתואר כאן מאפשר יצירה של אורגנואידים כלי דם בוגרים מ-hiPSCs תוך כ-15 ימים באמצעות אסטרטגיית דיפרנציאציה מדורגת (איור 1A). בקצרה, אגרגטים של hiPSC נוצרו בלוחיות בעלות היצמדות נמוכה (low-attachment) בתוספת 0.25% PVA על מנער אורביטלי (יום 1-). השראה של מזודרם הותחלה ביום 0 באמצעות CHIR99021 (12 µM) ו-BMP-4 (30 ng/mL) למשך 3 ימים, ולאחריהם מפרט של שורת כלי דם עם VEGF-A (100 ng/mL) ופורסקולין (2 µM) למשך יומיים (ימים 3–5). ביום 5, האגרגטים הוטמעו במטריצת קולגן I וממברנת בסיס ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול האופטימלי המתואר כאן מציג מספר שיפורים מרכזיים במערכת הבידול של אורגנואידים וסקולריים שבוששה במקור על ידי Wimmer et al.18, במטרה לשפר את ההומוגניות, השחזוריות והשלמות המבנית של יצירת האורגנואידים הוסקולריים. בהשוואה לפרוטוקול המקורי, השיטה האופטימלית מספקת שיפורים משמעותיים בהיבטים הבאים. ראשית, אופטימיזציה של תנאי היווצרות האגרגטים משפרת באופן משמעותי את ההומוגניות של הגופים העובריים (embryoid bodies). הפרוטוקול המקורי השתמש באגרגציה טבעית בלוחיות 6-well בעלות הידבקות נמוכה ליצירת אגרגט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים פיננסיים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (NSFC) באמצעות קרן מדענים צעירים (C) (מס' 32200655) והתוכנית הכללית (מס' 32270847). המחברים מודים גם לפלטפורמת השירותים הציבוריים של אוניברסיטת אנהוי על תמיכתה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 μm מסנן לראש בקבוקNalgeneFPE204030לסינון סטרילי של מצעים ובופרים
מבחנה קונית בנפח 15 מ"לSparkJadeGD0001סטרילי
מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"לEppendorf22363204סטרילי
2-מרקפטואתנול (1000×)Gibco21985023יש להשתמש במכסוף כימיים
Alexa Fluor 488 AffiniPure F2 פרגמנט של נוגדן חמור נגד IgG (H+L) של ארנבתוויתY1104נוגדן משני; דילול 1:300
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab)′)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)מסומןY1007נוגדן משני; לדלל ביחס של 1:300
נוגדן Anti-CD31אותיות תאיים3528 שניותנוגדן ראשוני; לדלל ביחס של 1:100 בבופר חסימה
Anti-PDGFR β נוגדןZenbio347269נוגדן ראשוני; לדלל ביחס של 1:100 בתמיסת חסימה
סופר תאים אוטומטיLife TechnologiesCountess™ IIכולל זכיות תא ספירה
תוסף B27 (50×)Gibco17504044עבור מצע N2B27; הפשר בטמפרטורה של 4°Cºג', חלק למנות (aliquot) ואחסן ב- −20ºג', הימנעו מהפשרה והקפאה חוזרת
צנטריפוגה שולחניתזונקיהSC-3610עם רוטור בעל דליים נתירים (swinging-bucket)
קבינה לבטיחות ביולוגית (Class II)Thermo Fisherלא זמיןלא ניתן לספק תרגום כיוון שלא הוזן טקסט מקור. אנא ספק את הטקסט באנגלית המיועד לתרגום.
BMP4ProteintechHZ-1045שחזר במים מזוקקים סטריליים (ddH)20 עד 100 ננוגרם/μL, חלק למכסויות (aliquot) ואחסן ב- −20 °C
אלבומין מסרום בקר (BSA)Biosharp9048-46-8עבור תמיסת חסימה (blocking buffer)
CHIR99021MCEHY-10182הכינו תמיסת מלאי (stock) בריכוז 10 mM ב-DMSO, ושמרו בטמפרטורה של −20ºבטמפרטורה של C למשך עד שנה אחת
CO2 אינקובטורFisher ScientificLS-CO15037 ºC, 5% CO2, מולחח
צלחת לדימוי קונפוקאליBiosharpBS-20-GJMלצילום לאחר צביעה
מיקרוסקופ קונפוקליLEICAלא זמיןמצויד ב-10×, 20×, 63× עדשות אובייקטיביות ותוכנת ZEN
DMEMVivacellC3113-0500עבור דילול Matrigel ותמיסת קולגן I
DMEM/F-12, תוסף GlutaMAXGibco10565018עבור דילול Matrigel ומצע N2B27
EDTA (0.5 M, pH 8.0)InvitrogenAM9260Gדללו עם PBS לריכוז של 0.02% לצורך מעבר (passaging)
סרום עגל עוברי (FBS)Gibco10270-106עבור מצע בידול מלא N2B27 (ריכוז סופי 15%)
FGF-2NovoproteinC046הכינו תמיסת מקור בריכוז 1 מג/מ"ל ב-PBS סטרילי, חלק למקבצים ושמרו ב- −20ºC
פורסקוליןR&D Systems1099הכינו תמיסת סטוק בריכוז 10 mM ב-DMSO, ואחסנו ב- −20ºC
HEPES (1M)Gibco15630080עבור תמיסת קולגן I
HoechstBeyotimeC1071S-4הכינו תמיסת מלאי בריכוז 1 מ"ג/מ"ל במים דה-יוניים, חלקו למנבים ושמרו בטמפרטורה של −20ºC
מיקרוסקופ הפוךLEICADMIL LEDתצפית שגרתית על תאים
Matrigel (עם רמות מופחתות של גורמי גדילה)STEEMABM05יש לשמור ב- −20ºלאחר חלוקה למנות (aliquoting), יש להימנע מההפשרה וההקפאה חוזרת; יש לטפל על קרח
תמיסת חומצות אמ[]ינו שאינן חיוניות עבור MEM ‏(NEAA, 100×)Gibco11140035עבור מצע N2B27
תוסף N2 (100×)Gibco17502048עבור מצע N2B27; אחסון ב- −20ºהגנה מאור
מצע נוירובסאל (Neurobasal Medium)Gibco21103049עבור מצע N2B27
מים נקיים מנוקלאז (נקיים מ-DNase/RNase)תוויתDoo55WJלהכנת RNA/cDNA ולביצוע qPCR
מנער מסלול (Orbital Shaker)מעבדת ג'ואןלא זמיןעבור שלבי השטיפה
פאראפורמלידה (תמיסה בריכוז 4%)ServicebioG1101דללו עם PBS לריכוז של 4% לצורך קיבוע; השתמשו במכסורת פטורים (fume hood)
פניצילין-סטרפטומייצין (100×)Gibco15140122עבור מצע N2B27
מצע PGM1CellapyA1517001מצע גידול להתרחבות של hiPSC; אחסון בטמפרטורה של 4 מעלותºיש להגן מאור, יציב למשך שבועיים
תוסף PGM1 (25×)סל-אפי (Cellapy)A1517101לשימוש עם מצע בסיס PGM1
פוליויניל אלכוהול (PVA)Sigma-AldrichP8136המסו ב-PGM1 בריכוז 0.25% (משקל/נפח) כדי לעודד אגרגציה
PureCol (קולגן בקר מסוג I, ריכוז 3 מ"ג/מ"ל)Advanced BioMatrix5005עבור תערובת קולגן I-Matrigel; מנת בדיקה ליכולת פולימריזציה
מכשיר תרמוסייקלר ל-qPCRThermo FisherStepOnePlus™בעל יכולת ביצוע עקומת המסה; לזיהוי באמצעות PCR בזמן אמת
ערכה לשעתוק הפוךביולוגיה מדויקתAG11706לסינתזת cDNA מ-RNA כולל; מכיל תערובת מאסטר ל-RT עם טרנסקריפטאזה הפוכה, בופר, dNTPs ופריימרים אקראיים
ערכה למיצוי RNAYeasen19221ES50לבידוד RNA כולל מאורגנואידים וסקולריים; כולל עמודי הסרה של gDNA ו-DNase I נטול RNase
נתרן ביקרבונט (7.5%)Gibco25080094עבור תמיסת קולגן I
נתרן דאוקסיכולאטSigma-AldrichD6750הכן תמיסה בריכוז 1% (משקל/נפח) במים דאיוניים עבור תמיסת חסימה (blocking buffer)
נתרן הידרוקסיד (1.0 N)Sigma-AldrichS2770לצורך התאמת ה-pH של תמיסת קולגן I
פיפטות סטריליות חד-פעמיות (10 מ"ל)Bkmamlab110205007ארוז בנפרד, סטרילי
טיפי פילטר סטריליים לפיפטה (1000, 200, 20 μL)BiozymVT0270/VT0250/VT0220סטרילי, עם מסנן
מחט סטרילית (30 G)לא צוין טקסט לתרגום. נא לספק את הטקסט באנגלית.לא ניתן לספק תרגום מכיוון שלא הוזן טקסט מקור. אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם.להשגת דיסקציה של רשתות כלי דם
שפכס פטריאלית סטרילי (קצה עגול)Fisher Scientific21-401-5פלדה דלוקסת (נירוסטה)
תערובת מאסטר SYBR Greenביולוגיה מדויקתAG117332× ריכוז עבור qPCR; מכיל DNA פולימראז מסוג hot-start, באפר, dNTPs וצבע SYBR Green
פלטת 12 בארות שעברה טיפול לתרביות רקמהBD Falcon353043לטבילה בג'ל ולתרביות של רשת כלי דם
פלטה בעלת 6 בארות שעברה טיפול לתרביות רקמהEppendorf30720113טיפול סטנדרטי ב-TC
Triton X-100Sigma-AldrichT9084עבור תמיסת חסימה (blocking buffer)
טריפאן בלו (0.4%)Thermo Fisher15250061לספירת תאים
Tween 20Sigma-AldrichP7949עבור תמיסת שטיפה PBS-T בריכוז 0.05%
פלטת 6 בארות בעלת היצמדות נמוכה במיוחד (Ultra-Low Attachment)Corning3471ליצירת אגרגטים ולדיפרנציאציה
פלטת 96 בארות בעלת תחתית עגולה עם היצמדות נמוכה במיוחד (Ultra-Low Attachment)BeyotimeFULA962-6pcsלתרבית תליה של אורגנואידים פסיקולריים (של כלי דם)
VEGF-AProteintechHZ-1038הכן תמיסת מלאי בריכוז 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS סטרילי, חלק לאליקוטים ושמור ב- −20ºC
אמבט מיםפארד כחולHWS-2437ºC
Y-27632MCEHY-10071הכינו תמיסת מומנה (stock) בריכוז 10 mM ב-PBS סטרילי או ב-DMSO, ואחסנו ב- −20ºC; ריכוזי עבודה: 5 μM (הפשרה), 50 μM (היווצרות אגרגטים)

מקורות

  1. Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345:1247125.
  2. Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016;165:1586-1597.
  3. Spence JR, et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 2011;470:105-109.
  4. Lancaster MA, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501:373-379.
  5. Quadrato G, et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 2017;545:48-53.
  6. Takasato M, et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 2015;526:564-568.
  7. Takebe T, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013;499:481-484.
  8. Huch M, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015;160:299-312.
  9. Nakano T, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 2012;10:771-785.
  10. Mansour AA, et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 2018;36:432-441.
  11. Ham O, et al. Blood vessel formation in cerebral organoids formed from human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2020;521:84-90.
  12. Sun XY, et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 2022;11:e76707.
  13. Grebenyuk S, Ranga A. Engineering organoid vascularization. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:39.
  14. Parikh M, Pierce GN. Considerations for choosing an optimal animal model of cardiovascular disease. Can J Physiol Pharmacol. 2024;102:75-85.
  15. Krug A, et al. Three-dimensional spheroid models for cardiovascular biology and pathology. Mechanobiol Med. 2025;3:100144.
  16. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 2003;9:653-660.
  17. Wimmer RA, et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019;565:505-510.
  18. Wimmer RA, et al. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2019;14:3082-3100.
  19. Naderi-Meshkin H, et al. Vascular organoids: unveiling advantages, applications, challenges, and disease modelling strategies. Stem Cell Res Ther. 2023;14:292.
  20. Xu C, et al. Vascular organoid generation from human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 2024;214:e67125.
  21. Frenz-Wiessner S, et al. Generation of complex bone marrow organoids from human induced pluripotent stem cells. Nat Methods. 2024;21:868-881.
  22. Sun D, et al. Matrix viscoelasticity controls differentiation of human blood vessel organoids into arterioles and promotes neovascularization in myocardial infarction. Adv Mater. 2025;37:e2410802.
  23. Hoffmann A, et al. Animal-origin-free method for generating blood vessel organoids. Sci Rep. 2026;16:12096.
  24. Nikolova MT, et al. Fate and state transitions during human blood vessel organoid development. Cell. 2025;188:3329-3348.e31.
  25. Quintard C, et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 2024;15:1452.
  26. Sun L, Wang P, Lin X, Qiu Y. Microfluidic vascular organoids-on-chips: a promising platform for advancing plastic and reconstructive surgery. Chinese Journal of Plastic and Reconstructive Surgery. 2025.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושייםיצירת אורגנואידיםיצירת גופי עוברהשראת מזודרמההתמיינות כליתגיוס פריציטיםרשתות אנדותלאפיון באמצעות אימונופלואורסצנציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.