מאמר מחקר

מיקוד בפרופטוזיס (Ferroptosis) וקופרופטוזיס (Cuproptosis) בקוलाइट כיבית: ממצאים מביו-אינפורמטיקה מקיפה ותיקוף ניסויי

80 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73656

⸱

25 באוגוסט 2026

 ,  ,  , 
1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2The Third Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מזהה חמישה סמנים ביולוגיים הקשורים ל-cuproptosis ול-ferroptosis בקוﻻיטיס כיבית באמצעות למידת מכונה משולבת, רצף RNA של תא בודד ואימות ניסויי, ובכך מספק תובנות לאבחנה קלינית ואימונותרפיה ממוקדת.

תקציר

קולייטיס כיבית (UC) היא הפרעה מעיית כרונית עם פתוגנזה שאינה מוגדרת במלואה, ושיעורי שכיחות ואשפוז עולים במדינות מתועשות חדשות. ב-UC, מוות מוגבר של תאי אפיתל המעי משבש את מחסום הרירית ומעורר תגובות דלקתיות. פרופטוזיס (Ferroptosis) וקופרופטוזיס (Cuproptosis) הן שתי צורות של מוות תאי מתוכנן שתוארו לאחרונה. רוב המחקרים על UC בחנו תהליכים אלו בנפרד; עם זאת, תפקידם המשולב בהתקדמות ה-UC נותר לא מאופיין מספיק. כדי לחקור את תפקידם הסינרגי בפתוגנזה של UC, השתמשנו בגישה מדורגת הכוללת פרופיל טרנסקריפטומי רחב היקף לזיהוי מטרות מועמדות, ולאחריה תיקוף במודלים in vitro. גנים בעלי ביטוי שונה (DEGs) הושוו לגנים הקשורים לפרופטוזיס (FRGs) ולגנים הקשורים לקופרופטוזיס (CRGs). המטרות החופפות תועדפו באמצעות קונסנזוס של אלגוריתמי למידת מכונה ואנליזת רשת של ביטוי גנים משותף משוקלל (WGCNA). חמישה סמנים ביולוגיים — LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2, ו-CD274 — הראו עלייה משמעותית בביטוי ב-UC. אנליזה של תאים בודדים אפיינה את ביטוים בסוגי תאים שונים, כאשר LCN2 ו-NOS2 היו מועשירים בעיקר בתאי אפיתל. הרלוונטיות המכניסטית של סמנים אלו הוערכה בהמשך באמצעות בדיקות in vitro. טיפול במעכבי פרופטוזיס או קופרופטוזיס הקל על דלקת הקשורה ל-UC ושינה את ביטוי הסמנים הביולוגיים במודלים של תאי Caco-2. ממצאים אלו מזהים חמישה סמנים ביולוגיים הקשורים להתקדמות UC ומספקים ראיות ניסיוניות התומכות בפוטנציאל יישומם באבחון קליני ובהתערבות טיפולית.

מבוא

קוליטיס כיבית (UC) היא מחלה דלקתית של המעי המתאפיינת בהישנות, והיא קשורה לנטל גלובלי הולך וגדל ולעלויות טיפול משמעותיות לטווח ארוך1,2. למרות שטיפולים באמינוסליצילטים, קורטיקוסטרואידים, תרופות ביולוגיות וטיפולים במולקולות קטנות הרחיבו את אפשרויות הטיפול, השגת רמיסיה עמידה נותרה מאתגרת עבור מטופלים רבים3,4. צורך קליני לא מסופק זה מדגיש את החשיבות של זיהוי סממנים מולקולריים ניתנים לשחזור ומנגנונים ניתנים לטיפול שעשויים לתמוך באבחנה מוקדמת יותר ובטיפול מונחה-מנגנון5.

פרופטוזיס (Ferroptosis) היא צורה של מוות תאי מווסת התלוי בברזל, המונעת על ידי פריקסדציה של ליפידים, דלדול של גלוטתיון ופגיעה בפעילות של GPX46. רמות מוגברות של ברזל ומלונדיאלדהיד ב-UC עולות בקנה אחד עם פגיעה אפיתליאלית פרופטוטית, בעוד שהפעלה ניסיונית של ציר ה-SLC7A11–GSH–GPX4 או עיכוב ישיר של פרופטוזיס יכולים להגן על מחסום המעי7,8.

קופרופטוזיס (Cuproptosis), שתואר בשנת 2022, מופעל כאשר נחושת נקשרת לחלבונים מיטוכונדריאליים שעברו ליפויליזציה, מה שמוביל לצבירת חלבונים ולעקה פרוטאו-טוקסית9. מכיוון שהמעי ממלא תפקיד מרכזי בטיפול בנחושת, שיבוש של מסלול זה עשוי להגביר פגיעה אפיתלית חמצונית ודלקתית ב-UC10.

פרופטוזיס (Ferroptosis) וקופרופטוזיס (cuproptosis) עשויים להתלכד דרך חוסר איזון של יוני מתכות, מטבוליזם מיטוכונדריאלי, דלדול גלוטתיון ועקה חמצונית11. עם זאת, השאלה האם קשר הדדי זה מייצר חתימה מולקולרית הניתנת לשחזור ב-UC והאם חתימה כזו מגיבה לעיכוב ספציפי למסלול, נותרה לא פתורה.

השערת המחקר הייתה כי הפרה של הדיאלוג (crosstalk) בין פרופטוזיס (ferroptosis) לקופרופטוזיס (cuproptosis) ב-UC מתכנסת לחתימה של סמנים ביולוגיים הניתנים לשחזור, שניתן לתת להם עדיפות במערכי נתונים טרנסקריפטומיים של תאים בודדים ושל אוכלוסיות תאים (bulk), ולהפחית אותם באמצעות עיכוב ספציפי למסלול במודל של פגיעה באפיתל המעי. בהתאם לכך, שולבו ביו-אינפורמטיקה של מספר קוהורטות, למידת מכונה, ניתוח תאים בודדים וניסויים ממוקדים בתאי Caco-2 כדי לזהות ולהעריך תפקודית סממנים ביולוגיים מועמדים (איור 1).

תרשים עיצוב מחקר משולב; גילוי טרנסקריפטומי, הערכת סמנים ביולוגיים, תיקוף ניסיוני.
איור 1: זרימת עבודת המחקר. זרימת עבודה משולבת לסריקה טרנסקריפטומית של מספר קוהורטות, תיעדוף סמנים ביולוגיים מבוסס רשתות ולמידת מכונה, לוקליזציה של תא בודד ותיקוף מבוסס מעכבים בתאי Caco-2. UC: colitis ulcerative; GEO: Gene Expression Omnibus; WGCNA: weighted gene co-expression network analysis; PPI: protein–protein interaction; ROC: receiver operating characteristic; GSEA: gene set enrichment analysis. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

מחקר זה השתמש במערכי נתונים הזמינים לציבור ובקווי תאים אנושיים הזמינים מסחרית. לא היו מעורבים משתתפים אנושיים, רקמות אנושיות שנאספו לאחרונה או בעלי חולחול; לפיכך, לא נדרש אישור מוועדת אתיקה מוסדית. כלי המחקר, התוכנות והמשאבים המקוונים ששימשו בפרוטוקול מפורטים בטבלת החומרים.

1. עיבוד נתונים לניתוח ביטוי דיפרנציאלי

כדי לבסס את קבוצות הגילוי והתיקוף הטרנסקריפטומיות, בוצע חיפוש במאגר הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) באמצעות המונח “ulcerative colitis”. ארבעה סטים של נתונים — GSE87466, GSE92415, GSE107499 and GSE75214 — שימשו כסט האימון, בעוד ש-GSE47908 נשמר לתיקוף חיצוני. סטי נתוני האימון נורמלו ועברו תיקון אפקטים של אצוות (batch-correction) באמצעות ComBat בתוכנת Sangerbox 3.0, בעוד שסט נתוני התיקוף עובד באופן עצמאי.

סה"כ 583 גנים הקשורים לפרופטוזיס (FRGs) הופקו מ-FerrDB והושלמו בגנים שדווחו בספרות המקצועית כדי להפחית הטיות הנובעות ממקור יחיד12סט של 96 גנים הקשורים לקופרופטוזיס (CRGs) נערך מתוך מחקרים שפורסמו12,13,14ביטוי דיפרנציאלי נותח באמצעות limma עם ספי thresholds של |log₂ שינוי מכפלה > 1 ובתיקון Benjamini–Hochberg P < 0.05. תרשימי אבחון של נורמליזציה, תיקון אפקט של סדרות (batch correction), ביטוי דיפרנציאלי והקבצה מוצגים ב- איור משלים 1הרכב הדגימות, הפלטפורמות והקצבת הקוהורטות מפורטים ב- טבלה נלווית 1.

2. זיהוי של CF-DEGs ב-UC

ניתוח מתאם פירסון בוצע תוך שימוש בסף של |r| > 0.5 ו- P < 0.05 כדי לזהות FRGs ו- CRGs בעלי ביטוי משותף. קבוצת הגנים שהתקבלה הועברה לחיתוך עם הגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEGs) כדי לזהות גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי המבטאים ביטוי משותף של קופרופטוזיס-פרופטוזיס (CF-DEGs).

3. אנליזת העשרה

ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) ו-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) בוצעו באמצעות clusterProfiler והפלטפורמה Bioinformatics.com.cn. ערך P < 0.05 המתוקנן לפי Benjamini–Hochberg שימש כסף המובהקות. תרשימי העשרה מוצגים ב-איור משלים 2.

4. ניתוח רשת ביטוי משותף שקולה של גנים (WGCNA)

המבנה המודולרי העומד בבסיס פרופילי ביטוי הגנים נותח באמצעות ניתוח רשת ביטוי גנים משותף משוקלל (WGCNA). דגימות חריגות זוהו והוצאו באמצעות קיבוב היררכי בשילוב עם הפונקציה goodSamplesGenes. לאחר מכן נקבע ערך סף רך (β) מתאים כדי לספק את קריטריון הטופולוגיה חסרת הקנה (scale-free topology) לבניית הרשת.

נתוני הביטוי המעובדים שימשו לבניית מטריצת חפיפה טופולוגית (TOM) לצורך ניתוח ביטוי גנים משותף (co-expression). באמצעות גישת חיתוך עץ דינמי, גנים בעלי דפוסי ביטוי עקביים מאוד אורגנו למודולי גנים, כאשר כל מודול הכיל לפחות 100 גנים. קשרים בין גנים ייצגיים של המודולים (MEs) לבין פנוטיפים נותחו כדי לזהות מודולים הקשורים לתהליך המחלה ולהפיק את קבוצות הגנים התואמות. אבחון סינון של WGCNA מוצג ב-איור משלים 3.

5. בחירת סמנים ביולוגיים

כדי לתעדף מועמדים להמשך מעקב ניסיוני, הוחלו במקביל שלושה אלגוריתמים של למידת מכונה15. רגרסיית LASSO (Least absolute shrinkage and selection operator) שימשה לבחירת תכונות, יער אקראי (random forest) עם ntree = 500 שימש לדירוג חשיבות הגנים, ושיטת SVM-RFE (support vector machine–recursive feature elimination) שימשה לזיהוי תת-קבוצת התכונות עם שגיאת האימות הצולב (cross-validation error) הנמוכה ביותר. אבחוני סריקה מלאים מוצגים באיור משלים 5.

חשיבות הגנים הוערכה על פי התרומה של גנים בודדים לדיוק הסיווג, וגנים שדורגו גבוה נאספו כדי ליצור סט גנים ראשוני16. אלגוריתם ה-SVM-RFE ביצע סינון מאפיינים ואופטימיזציה של המודל באמצעות השמטה איטרטיבית של מאפיינים, מה שאיפשר זיהוי של תת-קבוצת המאפיינים האופטימלית לסיווג17. גנים המשותפים לשלושת האלגוריתמים נחשבו כביומרקרים מועמדים שזוהו באמצעות למידה חישובית.

ה-CF-DEGs שימשו לבניית רשת אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI), ו-CytoHubba שימשה לדירוג צומת-ליבה. החיתוך בין מודולי WGCNA מרכזיים, שלושת הפלטים של למידת המכונה ומערכת הליבה של ה-PPI הגדיר חמישה סממנים ביולוגיים מועמדים משולבים: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 ו-CD274. גנים אלה סווגו כמועמדים אבחנאיים הקשורים ל-UC. ניסויי עיכוב המשך סיווגו את LCN2, IDO1, CXCL2 ו-NOS2 כסממנים המגיבים לעיכוב פרוטוזיס, ואת CD274 כסממן המגיב לעיכוב קופרוטוזיס. גנים אלה לא נחשבו לווסתים שמע (upstream regulators) מוכחים של אף אחת מהמסלולים.

6. פיתוח מודל חיזוי והערכה רב-שיטתית

כדי להעריך את פוטנציאל התרגום הקליני של חתימת הגנים שזוהתה, נבנה נומוגרמה באמצעות חבילת rms להערכת הביצועים האבחנתיים. ביצועי המודל הוערכו באמצעות עקומת כיול, מבחן Hosmer–Lemeshow (HL) ומדד ההתאמה של Harrell (C-index).

כיול המודל הוערך באמצעות מבחן HL וטעות מוחלטת ממוצעת (MAE). ערך P > 0.05 ו-MAE < 0.1 נקבעו כספי שערים להתאמה ומדויקות קבילה של המודל, בהתאמה. עקומות מאפיין תגובה (ROC) הופקו, והשטח תחת העקומה (AUC) חושב כדי להעריך את הביצועים הניבויים של הנומוגרמה עבור UC. מאגר נתונים בלתי תלוי שימש להערכת היכולת של המודל להכללה ויציבותו.

7. ניתוח העשרה של קבוצות גנים (GSEA)

בסט האימון, בוצע ניתוח מתאם של Spearman בין כל סמן ביולוגי לבין כל שאר הגנים. תוצאות המתאם דורגו כדי להפיק סט גנים מסודר. ניתוח העשרה של סט גנים (GSEA) בוצע באמצעות סט הגנים c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols ממאגר החתימות המולקולריות (MSigDB) כייחוס. מסלולים ביולוגיים עם P < 0.05 נחשבו להעשירה באופן מובהק.

8. ניתוח נוף חסוני

נעשה שימוש בכלי CIBERSORT ובמטריצת החתימה LM22 לביצוע אנליזת דקונבולוציה (deconvolution) של נתוני הביטוי ולהערכת הפרופורציות של 22 תתי-סוגים של תאי חיסון. לאחר מכן בוצע אנליזת מתאם ספירמן (Spearman correlation) כדי להעריך קשרים בין חמשת הסמנים הביולוגיים לבין תתי-הסוגים של תאי החיסון.

9. ניתוח רשת רגולטורית

מידע על ויסות של גורמי שעתוק (TF) ומיקרו-RNA (miRNA) הקשורים לגנים הופק ממאגרי המידע המשולבים ChEA3 ו-TarBase 9.0 באמצעות פלטפורמת NetworkAnalyst. MiRNAs הקשורים לפחות לשני צמתים נכללו ברשת הוויסות.

10. ריצוף RNA מתאיים בודדים (Single-cell RNA-seq)

בוצעו אינטגרציה למאגרי הנתונים של תאים בודדים של UC, GSE116222, הכולל שלושה דגימות בריאות ושלוש דגימות UC, ו-GSE214695, הכולל שש דגימות בריאות ושש דגימות UC. תאים נשמרו כאשר הם הכילו 200–5,000 גנים מזוהים, >1,000 מזהים מולקולריים ייחודיים (unique molecular identifiers), < 30% תמלילי מיטוכונדריה, < 3% תמלילי המוגלובין, ו-< 50% תמלילי ריבוסומים. לצורך נורמליזציה נעשה שימוש בפונקציה NormalizeData, ולצורך תיקון אפקט של סדרות (batch correction) לפני צבירה (clustering) ואנוטציה נעשה שימוש ב-Harmony.

לאחר הסינון, הנתונים נורמלו באמצעות פונקציית NormalizeData. נעשה שימוש ב-Harmony כדי למזער השפעות אלוף (batch effects) בין הדגימות. קירוב ומסגור של סבך אחיד (UMAP) והטמעה סטוכסטית של שכנים מפוצלים לפי התפלגות t (t-SNE) שימשו להפחתת ממדיים ולצבירה של תאים (cell clustering) על מנת לאפיין מבנים מקומיים וגלובליים בתוך אוכלוסיית התאים. בסך הכל 31,712 תאים באיכות גבוהה נשמרו להמשך הניתוח. סוגי התאים סווגו בהתאם לגנים מסמנים (marker genes) קנוניים של התאים.

ניתוח pseudotime בוצע באמצעות Monocle 2 כדי לבחון שינויים במצבים של תאי אפיתל ותאי מיאלואיד מרקמות UC. נבחנו מסלולי התפתחות של תאים והבדלים בין קבוצות, ותבניות ביטוי של סמנים ביולוגיים לאורך מסלול ה-pseudotime הוצגו באופן ויזואלי.

נעשה שימוש ב-CellChat כדי להעריך תקשורת בין תאים בין תתי-אוכלוסיות של תאי אפיתל ותאי מיאלואיד. דפוסי ביטוי ספציפיים לתתי-אוכלוסיות שולבו כדי להסיק הסתברויות לאינטראקציה ומסלולי איתות מרכזיים בין תאי אפיתל לתאי מיאלואיד, וכדי לאפיין את רשתות הבקרה הבין-תאיות הפוטנציאליות שלהם.

11. ניסויי תאים

תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco-2 אנושיים תורבדו במדיום Dulbecco’s modified Eagle המכיל 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin ו-100 µg/mL streptomycin בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO₂. תאי Caco-2 נבחרו כמודל שכבה אפיתליאלית אחת (monolayer) הניתן לשחזור עבור בדיקות של מחסום מעי ופגיעה דלקתית; עם זאת, מקורם הממאיר מגביל הכללה ישירה לאפיתליום של מעי הגס שאינו ממאיר. מידע על מספר המעברים (passage) לא היה זמין ברשומות הניסויים שנשמרו.

מודל של פגיעה דלקתית in vitro הוקם על ידי חשיפת תאים ל-1 µg/mL lipopolysaccharide (LPS) למשך 24 h. התאים חולקו לקבוצת ביקורת שקיבלה dimethyl sulfoxide (הנושא), קבוצת LPS בלבד, קבוצת LPS + 4 µM ferrostatin-1, או קבוצת LPS + 40 µM tetrathiomolybdate, עם ריכוזי ממס סופיים תואמים. קבוצת ה-LPS בלבד שימשה כביקורת חיובית לפגיעה/מודל לצורך השוואות של הצלה באמצעות מעכבים.

  1. חיוניות תאיים
    נבדקה חיוניות התאים באמצעות בדיקת חיוניות תאים בהתאם להוראות היצרן. לאחר דגירה ב- 37 °C במשך כשעתיים, נמדדה הבליעה באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלטה.
  2. מדידת MDA ו-Fe²⁺ רמות
    מאלונדיאלדהיד (MDA) וברזל (Fe) תוך-תאיים2⁺ את הרמות נמדו באמצעות ערכות הבדיקה המתאימות, בהתאם להוראות היצרן. כמות החלבון הכוללת נקבעה באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA), וכל קריאה נורמלה לתכולת החלבון של הדגימה המתאימה.
  3. בדיקת גשושית פלורסצנטית ליון נחושת
    לאחר הסרת מצע התרבית, Cu2⁺נוסף גשש פלואורסצנטי ספציפי בריכוז סופי של 1 µM והודגרו למשך 30 דקות ב- 37 °Cהתמונות הופקו באופן מיידי ללא שטיפה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך באורכי גל של עירור ופליטה של 510 ו-578 ננומטר, בהתאמה. הגדרות הרכישה נותרו קבועות בכל הקבוצות, וסרגל קנה המידה של התמונה כולל כיול של 50 µm.
  4. RT-qPCR
    בוצלה בידוד של RNA כולל באמצעות ריאגנט למיצוי RNA המבוסס על פנול-גואנידיניום. DNA משלים סונתז מ- 1 µg של RNA באמצעות ערכה לסינתזה של DNA משלים לגדיל ראשון, ובמטרה לבצע real-time PCR נעשה שימוש בריאגנטים מבוססי SYBR Green. כל תגובה בוצעה בשלוש חזרות טכניות. רצפי הפריימרים מופיעים ב- טבלה משלימה 2, ומישור השפעות היחסי של ה-mRNA חושב באמצעות שיטת ה-2^-ΔΔCt⁻ΔΔCt שיטה.

12. ניתוח סטטיסטי

נורמליות והומוגניות של השונות הוערכו באמצעות מבחני Shapiro–Wilk ו-Levene המבוסס על החציונים, בהתאמה. נתונים שעמדו בשתי ההנחות נותחו באמצעות t-test דו-זנבי למדגמים בלתי תלויים או ניתוח שונות חד-גורמי (one-way ANOVA), ולאחריו מבחן Tukey’s honestly significant difference. כאשר אחת מההנחות לא התקיימה, נעשה שימוש ב-Welch’s t-test או בניתוח שונות של Welch, ולאחריו השוואות Games–Howell.

התוצאות מוצגות כממוצע ± סטיית תקן. מספר החזרות ביולוגיות בפועל, ערכי P מדויקים דו-צדדיים ובדיקות הנחות מדווחים בטבלה משלימה 3. גיליון המקור של איור 13 בארכיון מכיל פחות חזרות של בקרה עבור פאנלים A (n = 4), C (n = 4), ו-F (n = 2), בעוד שכל שילובי הפאנל/קבוצה האחרים מכילים n = 6.

ניתוחים חישוביים בוצעו באמצעות R וספריות העבודה limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC, rms, Seurat v4, Harmony, Monocle 2, CellChat, ו-Cytoscape/CytoHubba. משאבים מקוונים שנעשה בהם שימוש כללו את FerrDB, GEO, STRING, ChEA3, TarBase 9.0, NetworkAnalyst, CIBERSORT/LM22, MSigDB, Bioinformatics.com.cn, ו-Sangerbox 3.0.

תוצאות

זיהוי ואנוטציה פונקציונלית של גנים המבטאים ביטוי משותף של cuproptosis ו-ferroptosis

שולבו ארבעה מאגרי נתוני אימון הכוללים 421 דגימות UC ו-97 ביקורות בריאות. זוהו סך הכל 551 גנים עם ביטוי Differentially Expressed, הכוללים 362 גנים עם ביטוי מוגבר (upregulated) ו-189 גנים עם ביטוי מופחת (downregulated). ניתוח מתאמי העלה 444 גנים הקשורים ל-ferroptosis ו-cuproptosis, וחיתוך עם הגנים בעלי הביטוי השונה הניב 32 גנים בעלי ביטוי שונה המבטאים ביטוי משותף של cuproptosis ו-ferroptosis (CF-DEGs).

32 ה-CF-DEGs היו מועשרים בתגובות לפציעה, יוני נחושת, הובלת חומצות שומן, ליפופוליסכריד, מחלת מעי דלקתית, סיגנל NF-κB, סיגנל TNF ופרופטוזיס (טבלה נלווית 4).

תיעדוף של ביומרקרים מרכזיים באמצעות למידה חישובית משולבת ו-WGCNA

ניתוח רשתות ביטוי גנים משותף משוקלל (WGCNA) זיהה את MEpurple, MEbrown ו-MEblack כמודולים בעלי הקשר החזק ביותר ל-UC. יחד, המודולים שנבחרו הכילו 1,426 גנים (טבלה נלווית 5).

אלגוריתמי Least absolute shrinkage and selection operator (LASSO), support vector machine–recursive feature elimination (SVM-RFE) ו-random forest בחרו 21, 32 ו-19 מאפיינים, בהתאמה. שלושה עשר גנים היו משותפים לשלושת המודלים. אינטגרציה של קונסנזוס למידת המכונה, ליבת אינטראקציות חלבון-חלבון שדורגה באמצעות CytoHubba והמודולים שנבחרו ב-WGCNA הניבה חמישה סממנים ביולוגיים מועמדים הקשורים ל-UC: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 ו-CD274.

הערכה אבחנתית והעשרת מסלולים של חתימת הביומארקרים

כל חמשת הביומארקרים המועמדים נמצאו במתאם חיובי ובעל ביטוי מוגבר ב-UC בקוהורט האימון (איור 2A, B). כל מרקר השיג שטח תחת עקומת ROC (receiver operating characteristic) של > 0.80 בקוהורט האימון ושל > 0.75 בקוהורט האימות העצמאי GSE47908 (איור 2C–E).

הנומוגרמה של חמשת הגנים הראתה כיול חיובי, עם ערך P של Hosmer–Lemeshow > 0.05 ושגיאה מוחלטת ממוצעת < 0.1, ויכולת הבחנה בקוהורט שנבדק, עם שטח תחת העקומה ומדד התאמה (concordance index) של 0.945 ורווח ברסון של 95% עבור מדד ההתאמה של 0.922–0.968 (איור 3).

ניתוח העשרה של קבוצות גנים קשר את חמשת המועמדים למסלולי האיתות JAK–STAT, interferon–RIPK1/3 ו-Toll-like receptor–NF-κB (איור 4).

תרשימי ניתוח ביטוי גנים; תרשימי עוגה, עקומות ROC ותרשימי קופסה להשוואה בין UC לבריאים.
איור 2: ביטוי של סמנים ביולוגיים מועמדים וביצועים אבחנאיים. (A) מפת חום של מתאמים. (B, C) ביטוי של סמנים ביולוגיים ועקומות מאפיין תפעול מקלט (receiver operating characteristic) בקבוצת האימון. (D, E) ביטוי של סמנים ביולוגיים ועקומות מאפיין תפעול מקלט בקבוצת האימות GSE47908. ROC: receiver operating characteristic; AUC: שטח תחת העקומה; UC: colitis ulcerative. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת נומוגרמה, עקומת כיול ואנליזת ROC להערכת מודל חיזוי.
איור 3: פיתוח והערכה של נומוגרמת ה-UC. (A) נומוגרמה של חמישה גנים. (B) גרף כיול. (C) עקומת מאפייני תגובה של מקלט (Receiver operating characteristic). ROC: receiver operating characteristic; UC: ulcerative colitis; AUC: area under the curve; C-index: concordance index. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

גרפים של ניתוח העשרה של קבוצות גנים; דירוגים לעומת ציוני העשרה; מערכי נתונים השוואתיים.
איור 4: ניתוח העשרה של קבוצות גנים עבור חמשת הביומארקרים המועמדים. (A–E) תוצאות ניתוח העשרה של קבוצות גנים עבור LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2, ו-CD274, בהתאמה. GSEA: gene set enrichment analysis. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח של נוף המיקרו-סביבה החיסונית ושל רשת הבקרה

דגימות UC הראו פרופורציות מוגברות של נויטרופילים, תאי CD4⁺ T זיכרון מופעלים, מקרופאגים M1, ותאי מאסט מופעלים, עם ירידות הדדיות במקרופאגים M2, תאי מאסט במצב מנוחה, ותאים דנדריטיים במצב מנוחה. דפוסים אלו שוחזרו בקוהורט התיקוף (איור 5A–E).

חמשת המועמדים נמצאו במתאם חיובי עם נויטרופילים, תאי T זיכרון CD4⁺ מופעלים ומקרופאגים M1, ובמתאם הפוך עם תאי מאסט במצב מנוחה ומקרופאגים M2 (איור 5F–J). רשת הגנים וה-miRNA כללה 98 צמתים ו-146 קשתות. hsa-miR-34a-5p ו-hsa-miR-16-5p הראו את הקישוריות הגבוהה ביותר כביו-מרקרים, בעוד ש-AR ו-RELA היו גורמי השעתוק בעלי הקישוריות הגבוהה ביותר (איור 6).

הרכבי תאי חיסון ומפות חום של מתאם; גרפי ניתוח הממחישים נתוני ביטוי גנים.
איור 5: ניתוח חדירת תאי חיסון. (A) הרכב תאי חיסון. (B) הבדלים בין-קבוצתיים בפרופורציות של תאי חיסון. (C) מפת חום של מתאמי תאי חיסון. (D, E) חדירת תאי חיסון בקוהורטות האימון והתיקוף. (F–J) מתאמים בין ביומרקרים מועמדים לאוכלוסיות של תאי חיסון. UC: ulcerative colitis. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

דיאגרמת אינטראקציה של רשת גנים; מדגישה אינטראקציות בין חלבונים וניתוח מסלולים רגולטוריים.
איור 6: רשתות חזויות של miRNA וגורמי שעתוק. (A) רשת גן–miRNA. עיגולים מציינים ביומרקרים מועמדים, וריבועים מציינים miRNAs. (B) רשת גורם שעתוק–גן. מעוינים מציינים ביומרקרים מועמדים, ומשולשים הפוכים מציינים גורמי שעתוק. miRNA: microRNA; TF: גורם שעתוק (transcription factor). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דינמיקת ביטוי מרחבית-זמנית ברזולוציה של תא בודד

לאחר בקרת איכות, 31,712 תאים יצרו 22 אשכולות שסווגו כתשע אוכלוסיות תאים עיקריות (איור 7A–C). פרופורציות של תאי אפיתל ותאי פלסמה היו גבוהות יותר ב-UC. LCN2 ו-NOS2 היו מועשרים בתאי אפיתל, בעוד ש-IDO1, CXCL2 ו-CD274 היו מועשרים בתאי מיאלואיד (איור 7D–G).

תת-צבירה של תאי אפיתל זיהתה 11 תתי-קבוצות, עם התרחבות של קולונוציטים דלקתיים והעשרה של LCN2 ו-NOS2 בתת-קבוצה זו (איור 8). תת-צבירה של תאי מיאלואיד זיהתה שבע תתי-קבוצות, עם עלייה במונוציטים, ירידה במקרופאגים, והעשרה של IDO1, CXCL2 ו-CD274 במונוציטים (איור 9).

קולונוציטים דלקתיים הצטברו בשלב מאוחר של המסלול האפיתליאלי, עם ביטוי גובר של LCN2 ו-NOS2 (איור 10). מונוציטים הפגינו מסלול נפרד הקשור ל-UC, עם ביטוי דינמי של IDO1, CXCL2 ו-CD274 (איור 11).

קולונוציטים דלקתיים הראו את האותיות היוצאות החזקות ביותר ותקשורת בולטת עם מונוציטים. APP–CD74 היה זוג ליגנד–רספטור מוביל בין תתי-אוכלוסיות אלו (איור 12).

דיאגרמת אשכולות UMAP וגרף נקודות המראים את התפלגות סוגי התאים ואת ביטוי הגנים בדגימות.
איור 7: ביטוי של ביומארקרים מועמדים באוכלוסיות תאים שונות. (A) אשכולות תאים. (B) סמני אנוטציה. (C) תשע אוכלוסיות תאים עם אנוטציה. (D, E) התפלגויות ופרופורציות של תאים בדגימות בריאות ובדגימות UC. (F, G) ביטוי של ביומארקרים מועמדים כפי שמוצג ב-UMAP ובגרף בועות. UC: ulcerative colitis; UMAP: uniform manifold approximation and projection. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

הפעלת t-SNE וניתוח של סוגי תאי אפיתל; גרף ומפת חום המציגים תבניות נתונים.
איור 8: תתי-צבירי תאי אפיתל וביטוי של מועמדים. (A) צבירי תאי אפיתל ראשוניים. (B) סממני אנוטציה. (C) תת-קבוצות של תאי אפיתל עם אנוטציה. (D) פרופורציות של תת-קבוצות בדגימות בריאות ובדגימות UC. (E) ביטוי של LCN2 ו-NOS2 על פני תתי-קבוצות של תאי אפיתל. t-SNE: t-distributed stochastic neighbor embedding; UC: colitis ulcerative. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח אשכולות t-SNE ותרשים עמודות של אשכולות מיאלואידיים; ביטוי חיסוני; ריצוף RNA של תא בודד.
איור 9: תת-אשכולות של תאים מיאלואידיים וביטוי של מועמדים. (A) אשכולות ראשוניים של תאים מיאלואידיים. (B) סממני אנוטציה. (C) תתי-אוכלוסיות של תאים מיאלואידיים עם אנוטציה. (D) פרופורציות של תתי-אוכלוסיות בדגימות בריאות ובדגימות UC. (E) ביטוי של IDO1, CXCL2 ו-CD274 על פני תתי-אוכלוסיות של תאים מיאלואידיים. t-SNE: t-distributed stochastic neighbor embedding; UC: ulcerative colitis. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות הפחתת ממדיות ואשכול (clustering), המציגות מיפוי רכיבים וגרפים של ניתוח פסאודו-זמן (pseudotime).
איור 10: ניתוח פסאודו-זמן של תאי אפיתל. (A) מסלול פסאודו-זמן והקצאות מצבים. (B) התפלגות של תאי אפיתל בריאים ותאי אפיתל עם UC לאורך המסלול. (C) דינמיקת ביטוי של LCN2 ו-NOS2 לאורך הפסאודו-זמן. UC: colitis ulcerative. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גרף התאמה ספקטרלית; ניתוח נתונים של קשרי רכיבים; תוצאות התאמה של ניתוח גלובלי.
איור 11: ניתוח פסאודו-זמן (pseudotime) של תאים מיאלואידיים. (A) מסלול פסאודו-זמן והקצאות מצב. (B) התפלגות של תאים מיאלואידיים בריאים ותאים עם UC לאורך המסלול. (C) דינמיקת ביטוי של IDO1, CXCL2 ו-CD274 לאורך הפסאודו-זמן. UC: colitis ulcerative. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

רשתות אינטראקציה של חלבונים ועוצמת אינטראקציה; תוצאות נתונים בתרשימי פיזור ומפות חום.
איור 12: תקשורת אפיתליאלית–מיאלואידית. (A) מספר ועוצמת אינטראקציות. (B) עוצמות איתות יוצאות ונכנסות. (C) אינטראקציות המערבות קולונוציטים דלקתיים. (D) מפת חום של עוצמת תקשורת. (E) זוגות ליגנד–רספטור המערבים קולונוציטים דלקתיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

In vitro תיקוף ניסיוני של התערבויות ב-ferroptosis וב-cuproptosis

חשיפה לליפופוליסכריד (LPS) הפחיתה את חיוניות תאי Caco-2 והגבירה את הביטוי של IL-6 ו-IL-1β ביחס לבקרת ה-vehicle (איור 13A–C ו-איור משלים 5).

LPS העלה את רמות ה-Fe2⁺, המלונדיאלדהיד, ואת שפע ה-mRNA של LCN2, IDO1, CXCL2 ו-NOS2, בעוד ש-ferrostatin-1 הפך כל אחד מהשינויים הקשורים ל-LPS (איור 13D–I). עבור ההשוואות בין LPS לבין LPS + ferrostatin-1, ערכי P דו-צדדיים מדויקים נעים בין 9.45 × 10⁻5 ל-0.0027 לאחר חישוב ממוצע של חזרות טכניות בתוך כל חזרה ביולוגית.

LPS הפחית את החיוניות והעלה את רמות IL-6, IL-1β, FDX1/DLAT, CD274, ואת הפלואורסצנציה הרגישה לנחושת, בעוד ש-tetrathiomolybdate הפך שינויים אלו (איור 14 A–E). עבור ההשוואות בין LPS לבין LPS + tetrathiomolybdate, ערכי P דו-צדדיים מדויקים נעו בין < 1 × 10⁻15 ל-0.0008.

יחד, זיהו הניתוחים חמישה מועמדים אבחנתיים הקשורים ל-UC, מיקמו את ביטויים באוכלוסיות אפיתליאליות ומילואיות, והראו כי LCN2, IDO1, CXCL2 ו-NOS2 הגיבו לעיכוב פרופטוזיס, בעוד ש-CD274 הגיב לכלציה של נחושת בתאי Caco-2.

דיאגרמות של חיוניות תאים וביטוי mRNA המשוות בין טיפולי בקרה, LPS ו-LPS+Fer.
איור 13: Ferrostatin-1 מפחית שינויים דלקתיים ושינויים הקשורים לפרופטוזיס שנובעים מ-LPS בתאי Caco-2. (A) חיוניות תאים. (B, C) ביטוי messenger RNA של IL-6 ו-IL-1β. (D, E) רמות תוך-תאיות של malondialdehyde ו-Fe2⁺. (F–I) ביטוי messenger RNA של LCN2, IDO1, CXCL2, ו-NOS2. ממוצעים של שלשות טכניות חושבו עבור כל שכפול ביולוגי בלתי תלוי; פסי השגיאה מציינים סטיית תקן. מספר השכפולים הביולוגיים הזמינים היה Control n = 4 ב-A וב-C, Control n = 2 ב-F, ו-n = 6 עבור כל שילובי הפאנלים/קבוצות האחרים. ערכי P דו-צדדיים מדויקים ובדיקות הנחות מדווחים ב-Supplementary Table 5. Fer-1: ferrostatin-1; LPS: lipopolysaccharide; MDA: malondialdehyde. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשימי עמודות של חיות תאים וביטוי mRNA; מיקרוסקופיה המראה את התפלגות הגשש לנחושת.
איור 14: Tetrathiomolybdate מפחית שינויים דלקתיים ושינויים הקשורים ל-cuproptosis המושרים על ידי LPS בתאי Caco-2. (A) חיות תאים. (B, C) ביטוי messenger RNA של IL-6 ו-IL-1β. (D) ביטוי messenger RNA של FDX1 ו-DLAT. (E) ביטוי messenger RNA של CD274. (F) פלואורסצנציה של Cu2⁺ תוך-תאי; סרגל קנה מידה = 50 µm. ממוצע של שלשות טכניות חושב בתוך כל אחת משש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות לכל קבוצה; פסי השגיאה מציינים סטיית תקן. ערכי P דו-צדדיים מדויקים ובדיקות הנחות מדווחים ב-Supplementary Table 5. TTM: tetrathiomolybdate; LPS: lipopolysaccharide. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

נתונים גולמיים ומעובדים, סקריפטים של ניתוח וגיליונות מקור של ניסויי תאים זמינים לציבור בכתובת https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720.

איור משלים 1: עיבוד מקדים של נתונים ואבחון ביטוי Differentially Expressed. (A–F) התפלגויות דגימות לפני (A–C) ואחרי (D–F) תיקון אפקט סדרה (batch correction). (G) תרשים Volcano של גנים עם ביטוי דיפרנציאלי. (H) מפת חום (Heatmap) של דפוסי ביטוי מנורמלים. DEGs: גנים עם ביטוי דיפרנציאלי; GEO: Gene Expression Omnibus.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: ניתוח העשרה של CF-DEGs. (A) העשרת Gene Ontology. (B) העשרת Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. CF-DEGs: גנים המובעים באופן דיפרנציאלי המובעים במשותף בתהליכי cuproptosis ו-ferroptosis; GO: Gene Ontology; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

איור משלים 3: דיאגנוסטיקה של סריקת WGCNA. (A) בחירת סף רך. (B) מקבץ של module-eigengenes. (C) דנדרוגרמה של גנים ומודולים. (D) קשרים בין מודולים לתכונות. (E–G) יחסי מובהקות-גן/חברות-במודול עבור המודולים הסגול, החום והשחור. WGCNA: weighted gene co-expression network analysis; UC: ulcerative colitis.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 4: סריקת ביומרקרים רב-שלבית. (A, B) בחירת מאפיינים באמצעות LASSO. (C, D) בחירת מאפיינים באמצעות SVM-RFE. (E, F) דירוג מאפיינים באמצעות Random-forest. (G) קונסנזוס בין שלושת המודלים. (H, I) רשת PPI וצמתים מרכזיים של CytoHubba. (J) אינטגרציה של תוצאות למידה חישובית, WGCNA ו-PPI. (K) מיקומים כרומוזומליים של חמשת המועמדים. LASSO: least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE: support vector machine–recursive feature elimination; RF: random forest; PPI: protein–protein interaction; WGCNA: weighted gene co-expression network analysis.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 5: תיקוף מודל LPS בתאי Caco-2. (A) חיוניות תאים. (B, C) ביטוי mRNA של IL-6 ו-IL-1β. בוצע ממוצע של שלושה חזרות טכניות בתוך שש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות לכל קבוצה; פסי השגיאה מציינים סטיית תקן. LPS: ליפופוליסכריד.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 1: מאגרי נתונים של GEO ששימשו לגילוי ואימות. מספרי גישה למאגרי הנתונים, פלטפורמות, הרכב דגימות והקצאות קוהורט עבור מאגרי הנתונים של GEO שנכללו בניתוחי הגילוי והאימות. GEO: Gene Expression Omnibus.אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה נלווית 2: רצפי פריימרים ל-Reverse transcription quantitative PCR. רצפי פריימרים ששימשו לניתוח Reverse transcription quantitative PCR של הגנים שנבחנו במחקר זה.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 3: פרטים סטטיסטיים עבור איורים 13, 14 ואיור נלווית 1. מספר חזרות ביולוגיות, בדיקות הנחות יסוד, שיטות ניתוח סטטיסטי וערכי P מדויקים עבור ההשוואות הניסיוניות המצוינות.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה נלווית 4: גנים המבטאים ביטוי דיפרנציאלי המבטאים ביטוי משותף של קופרופטוזיס-פרופטוזיס. רשימה של CF-DEGs שזוהו על ידי הצלבת גנים הקשורים לפרופטוזיס-קופרופטוזיס עם גנים המבטאים ביטוי דיפרנציאלי.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה נלווית 5: גנים במודולים של WGCNA שנבחרו לסריקת סממנים ביולוגיים. רשימת הגנים הכלולים במודולים של WGCNA שנבחרו לסריקת סממנים ביולוגיים בהמשך. WGCNA: weighted gene co-expression network analysis.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

מחקר זה שילב טרנסקריפטומיקה של אוכלוסיות תאים (bulk transcriptomics), למידת מכונה, ניתוח של תאים בודדים וניסויי תאים ממוקדים כדי לבחון את השפע והקשר (crosstalk) בין פרופטוזיס (ferroptosis) לקופרופטוזיס (cuproptosis) בקוﻻיטיס כיבבית (UC). חמישה מועמדים לאבחנה הקשורים ל-UC נמצאו ניתנים לשחזור הן בקבוצת הגילוי והן בקבוצת האימות, אותרו בעיקר במדורים האפיטלייאליים והמיאלואידיים, והראו ביטוי המגיב לעיכוב של מסלולים בתאי Caco-2. ממצאים אלו תומכים בזרימת עבודה מדורגת שבה תיעדוף חישובי מנחה אימות ביולוגי ממוקד, תוך הימנעות מהטענה החזקה יותר כי חמישה גנים אלו הם ווסתים מוקדמים (upstream regulators) מבוססים של פרופטוזיס או קופרופטוזיס.

ה-CF-DEGs היו מועשרים בתגובות לליפופוליסכריד, טיפול בנחושת, הובלת ליפידים, סיגנל NF-κB/TNF ופרופטוזיס, מה שסיפק קשר קוהרנטי בין עקה חמצונית תלוית-מתכת לבין דלקת רירית10,19.

חמשת המועמדים תופסים הקשרים משלימים של דלקת ועקה של מתכות. LCN2 מקשר בין סקוסטרציה של ברזל, דיסביוזה מיקרוביאלית וציר ה-LCN2–ALOX15 של פרופטוזיס20,21,22,23; IDO1 מקשר בין מטבוליזם של טריפטופן, דלקת רירית ושיבוש בטיפול בברזל24,25,26; ו-CXCL2 מקשר בין סיגנלינג של IL-17/IL-22, גיוס נויטרופילים ופרוקסידציה של ליפידים27,28,29,30. ל-NOS2 יש השפעות תלויות-הקשר, אך הוא יכול להגביר פגיעה חמצונית ורגישות לפרופטוזיס כאשר הוא מופעל באופן מופרז31,32,33,34,35,36. CD274 הוא סמן אפיתלי רגולטורי-חיסוני שקשרו עם FDX1 ועם רגישות לאינופור של נחושת מרמז על תגובה לקופרופטוזיס ולא על בקרה של נתיב מוגדר37,38,39. ניסויי המעכבים היו עקביים עם סיווגים אלו: ferrostatin-1 הפחית את LCN2, IDO1, CXCL2 ו-NOS2, בעוד שתטרתיומוליבדאט הפחית את CD274.

הניתוח החיסוני קישר עוד יותר את החתימה המועמדת למקרופאגים מסוג M1, נויטרופילים, תאי CD4⁺ T זיכרון מופעלים ותאי מאסט מופעלים, שכולם מסוגלים להחמיש פגיעה אפיתליאלית באמצעות ציטוקינים, מיני חמצן רדיקליים ואיתות המשבש את מחסום הרירית40,41,42,43,44. RELA, hsa-miR-34a-5p ו-hsa-miR-16-5p עלו כווסתים אפשריים במעלה הזרם, בעוד שהראיות לתפקיד ישיר של קולטן אנדרוגן ב-UC נותרו מוגבלות45,46,47,48,49,50. ממצאים אלה יש לפרש כהיפותזות ברמת הרשת עבור ניסויי הפרעה עתידיים, ולא כהוכחה לוויסות ישיר.

ניתוח של תאים בודדים מיקם את LCN2 ו-NOS2 בתוך קולונוציטים דלקתיים, ואת IDO1, CXCL2 ו-CD274 באוכלוסיות מיאלואידיות עשירות במונוציטים. נחזה כי קולונוציטים דלקתיים משמשים כמרכזי תקשורת, כאשר APP–CD74 הוא אחד מזוגות הליגנד–רצפטור המובילים בממשק הפיתולי–מיאלואידי51,52,53,54,55,56. רזולוציה זו של סוגי התאים מצמצמת את ההקשר הביולוגי שבו יש לבחון את חמשת המועמדים, ותומכת בשימוש במערכות של תרביות משולבות (co-culture) או מערכות של אורגנואידים ותאי מערכת החיסון כשלב הניסויי הבא.

מספר מגבלות מכבילות את הפרשנות. Caco-2 הוא קו תאים של אדנוקרצינומה קולורקטאלית ואינו משחזר באופן מלא אפיתלליום קולוני שאינו ממאיר, הטרוגניות של חולים, אינטראקציות סטרומליות-חיסוניות או UC כרוני; לפיכך, תיקוף בתאי אפיתליום מעיים ראשוניים, אורגנואידים שמקורם בחולה, מערכות של תרביות משולבות (co-culture) ו- in vivo נדרשים מודלים של קוליטיס. הארכיון איור 13 בגיליון המקור חסרו גם כמה רשומות של חזרות בקבוצות הביקורת בפנלים A, C ו-F, מה שהפחית את הדיוק עבור השוואות אלו; כל ספירות החזרות הזמינות והערכים המדויקים P הערכים מפורטים ב- טבלה משלימה 5לבסוף, נתונים על גיל, מין, חשיפה לטיפול ומשתנים קליניים אחרים לא היו זמינים באופן אחיד בכל הקוהורטות הציבוריות. יהיה צורך בקוהורטות פרוספקטיביות רב-מרכזיות ובשיבוב ישיר של חמשת המועמדים כדי לבסס את התועלת האבחנתית ואת התפקידים הסיבתיים. תחת מגבלות אלו, המחקר מספק סט שקוף של היפותזות המעוגנות ניסיונית, הקושרות בין מוות תאי תלוי-מתכת, תקשורת בין תאי אפיתל לתאי מיאלואיד, ובין colitis ulcerosa (UC). מחקר דומה בתחום הפרמקולוגיה של רשתות בסרטן הערמונית ממחיש את הערך של תיעדוף מטרות חישובי ליצירת היפותזות, אך הוא אינו מהווה תיקוף ספציפי ל-UC.57באופן דומה, דיוןים אחרונים בנושא פרופטוזיס (ferroptosis) בדלקת פרקים ניוונית (osteoarthritis) ודגנרציה של העצם משקפים עניין טיפולי רחב במודולציה של פרופטוזיס, אף על פי שלא ניתן להקיש באופן ישיר על מנגנונים ספציפיים למחלה אל על UC.58לפיכך, נעשה שימוש בתיקוף של קהלה חיצונית ובניסויי מעכבים כדי לחזק את הקשרים הביואינפורמטיים, אך לא להגזים בפרשנותם.

גילויים

למחברים אין דבר להצהיר עליו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מלגות Young Qihuang של המנהל הלאומי לרפואה סינית מסורתית (מענק מס' 2022256). תודה מוענית לכל חברי צוותי המחקר באוניברסיטת ליאונינג לרפואה סינית מסורתית ובבית החולים השלישי המסופח לאוניברסיטת ליאונינג לרפואה סינית מסורתית על התמיכה הטכנית והתרומה לאוצרות הנתונים ולניתוח הביואינפורמטיקה.

OpenAI Codex (OpenAI) שימש במהלך העריכה אך ורק כדי לסייע בעריכה של השפה האנגלית, בפורמט המסמך ובבדיקת איכות האיורים. כל התוכן המדעי, הניתוחים, הציטוטים וההצגה הסופית נסקרו ואומתו על ידי המחברים, הנושאים באחריות מלאה לכתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכה לבדיקת חלבון BCABeyotime Institute of BiotechnologyP0010כימות חלבונים לצורך נורמליזציה.
Bioinformatics.com.cnBioinformatics.com.cnפלטפורמה מקוונת; נגישה בשנת 2026פלטפורמה לניתוח ולהצגה חזותית של GO/KEGG.
קו תאי Caco-2ATCCHTB-37קו תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס והחך של בני אדם המשמש למודל של פגיעה אפיתלית.
ערכה לספירת תאים 8 (Cell Counting Kit-8)GLPBioGK10001בדיקת חיוניות תאים שנמדדה באורך גל של 450 ננומטר.
CIBERSORT עם חתימת LM22מפתחי CIBERSORTLM22דה-קונוולוציה (Deconvolution) של 22 פракציות של תאי מערכת החיסון.
ChEA3מעבדת מעייןפלטפורמה מקוונת; נגישה בשנת 2026העשרה של גורמי שעתוק וחיזוי רשתות בקרה.
CO2 אינקובטורלא הוקלטלא רלוונטיאינקובטור לח (Humidified incubator) המשמש לתרבית ב- 37 °C ו-5% CO22.
נחושת<סגנון ספאן ="גודל גופן: 10.8333px;">2+ גשוש פלואורסצנטיBIOFOUNTCAS 98907-26-7נחושת תוך-תאית (Cu)2+ גילוי פלואורסצנציה.
Cytoscape עם CytoHubbaקונסורציום Cytoscapeהגרסה לא תועדהויזואליזציה של PPI ודירוג צמתי-ליבה.
מצע דאלבקו המשופר (Dulbecco's modified Eagle medium)Gibco11965092מצע גידול לתאי Caco-2.
דימתיל סולפוקסידלא הוקלטלא רלוונטיביקורת נשאי תרופה (Vehicle control).
סרום בקר עוברילא הוקלטלא רלוונטיתוסף מצע בריכוז של 10%.
Fe2+ ערכת בדיקהAbcamab83366מדידת Fe תוך-תאי2+.
FerrDBמפתחי FerrDBמאגר נתונים מקוון; נגישה בשנת 2026מקור של גנים הקשורים לפרופטוזיס (ferroptosis).
Ferrostatin-1Sigma-AldrichSML0583מעכב פרופטוזיס; ריכוז סופי 4 µM.
הרמוניהמכון ברוד/קהילהגרסה לא תועדהתיקון אפקטי batch ברמה התאית (Single-cell batch correction).
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוךOlympusIX71נחושת2+ דימות פלואורסצנציה בעירור/פליטה של 510/578 ננומטר.
ליפופוליסכרידלא הוקלטלא רלוונטיגירוי פגיעה דלקתית ב- 1 µg/mL למשך 24 שעות.
ערכה לבדיקת מלונדיאלדהידBeyotime Institute of BiotechnologyS0131Sמדידה של פירוקסידציה של ליפידים.
קורא מיקרו-פלטותלא הוקלטלא רלוונטימדידת בליעה באורך גל של 450 ננומטר.
MonocleBioconductor/קהילהגרסה 2ניתוח פסאודו-זמן של תא בודד.
מאגר חתימות מולקולריותBroad Institutec2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hsסט גנים ייחוס עבור GSEA.
NetworkAnalystמפתחי NetworkAnalystפלטפורמה מקוונת; נגישה לשנת 2026אינטגרציה של רשתות גורמי שעתוק ו-miRNA.
פניצילין–סטרפטומייציןלא תועדלא רלוונטי100 U/mL פניצילין ו- 100 µg/mL סטרפטומייצין.
RR Foundation for Statistical Computingגרסה לא תועדהסביבת ניתוח ביואינפורמטית.
סט חבילות RCRAN/Bioconductorבניית חבילות שלא תועדוסבבי עבודה של limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC, ו-rms.
מערכת PCR בזמן אמתלא הוקלטלא רלוונטימכשיר SYBR Green RT-qPCR.
ערכה לסנתז גדיל ראשון של cDNA מסוג RevertAidThermo Fisher ScientificK1622סינתזת cDNA של הגדיל הראשון מ- 1 µg RNA.
Sangerboxמפתחי Sangerbox3.0נורמליזציה ותיקון אפקטים של סדרות (batch correction) באמצעות ComBat.
Seuratמעבדת Satija/קהילהגרסה 4בקרת איכות של תא בודד, נורמליזציה, אשכול (clustering) וויזואליזציה.
תוכנה לניתוח סטטיסטילא הוקלטלא רלוונטיניתוח סטטיסטי של ניסויי התאים המקוריים.
אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם.קונסורציום STRINGמאגר נתונים מקוון; נגישה בשנת 2026חלבון–בניית רשת אינטראקציות בין חלבונים.
ריאגנטים ל-PCR בזמן אמת עם SYBR GreenTakaraRR820APCR כמותי בזמן אמת.
TarBaseכלי DIANA9.0miRNA הנתמך ניסויית–אינטראקציות גנומיות.
טטרתיומוליבдатSigma-Aldrich323446קלטור נחושת; ריכוז סופי 40 µM.
ריאגנט TRIzolTakara9108הפקת RNA כולל.

מקורות

  1. Fu M, Wang QW, Liu YR, Chen SJ. The role of the three major intestinal barriers in ulcerative colitis in the elderly. Ageing Res Rev. 2025;108:102752. https://doi.org/10.1016/j.arr.2025.102752.
  2. Le Berre C, Honap S, Peyrin-Biroulet L. Ulcerative colitis. Lancet. 2023;402:571–584.
  3. Wangchuk P, Yeshi K, Loukas A. Ulcerative colitis: Clinical biomarkers, therapeutic targets, and emerging treatments. Trends Pharmacol Sci. 2024;45:892–903.
  4. Kobayashi T, et al. Ulcerative colitis (primer). Nat Rev Dis Primers. 2020;6:74. https://doi.org/10.1038/s41572-020-0205-x.
  5. Huang J, et al. Comprehensive analysis of cuproptosis-related genes in immune infiltration and diagnosis in ulcerative colitis. Front Immunol. 2022;13:1008146. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1008146.
  6. Liu Y, et al. Development and experimental validation of machine learning-based disulfidptosis-related ferroptosis biomarkers in inflammatory bowel disease. Genes. 2025;16:496. https://doi.org/10.3390/genes16050496.
  7. Hu W, et al. HIF-1α alleviates ferroptosis in ulcerative colitis by regulation of GPX4. Cell Death Dis. 2025;16:542. https://doi.org/10.1038/s41419-025-07883-8.
  8. Zhao C, et al. FXR acts as a therapeutic target for ulcerative colitis via suppressing ferroptosis. Mol Med. 2025;31:258. https://doi.org/10.1186/s10020-025-01305-3.
  9. Tsvetkov P, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375:1254–1261.
  10. Liu J, et al. Unveiling the cuproptosis in colitis and colitis-related carcinogenesis: A multifaceted player and immune moderator. Research (Wash D C). 2025;8:0698. https://doi.org/10.34133/research.0698.
  11. Liu N, Chen M. Crosstalk between ferroptosis and cuproptosis: From mechanism to potential clinical application. Biomed Pharmacother. 2024;171:116115. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2023.116115.
  12. Hao S, et al. Development of prognostic model incorporating a ferroptosis/cuproptosis-related signature and mutational landscape analysis in muscle-invasive bladder cancer. BMC Cancer. 2024;24:958. https://doi.org/10.1186/s12885-024-12716-1.
  13. Wang Z, et al. Exosomes secreted by macrophages upon copper ion stimulation can promote angiogenesis. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2021;123:111981. https://doi.org/10.1016/j.msec.2021.111981.
  14. Zou M, Zhang W, Zhu Y, Xu Y. Identification of 6 cuproptosis-related genes for active ulcerative colitis with both diagnostic and therapeutic values. Medicine (Baltimore). 2023;102:e35503. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035503.
  15. Chen W, Miao J, Chen J, Chen J. Development of machine learning models for diagnostic biomarker identification and immune cell infiltration analysis in PCOS. J Ovarian Res. 2025;18:1. https://doi.org/10.1186/s13048-024-01582-8.
  16. Lv JH, et al. WGCNA combined with machine learning to find potential biomarkers of liver cancer. Medicine (Baltimore). 2023;102:e36536. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000036536.
  17. Wu Q, Yang C, Huang C, Lin Z. Screening key genes for intracranial aneurysm rupture using LASSO regression and the SVM-RFE algorithm. Front Med. 2025;11:1487224. https://doi.org/10.3389/fmed.2024.1487224.
  18. Tang D, Pu B, Liu S, Li H. Identification of cuproptosis-associated subtypes and signature genes for diagnosis and risk prediction of ulcerative colitis based on machine learning. Front Immunol. 2023;14:1142215. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1142215.
  19. Yang C, et al. Identification of cuproptosis hub genes contributing to the immune microenvironment in ulcerative colitis using bioinformatic analysis and experimental verification. Front Immunol. 2023;14:1113385. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1113385.
  20. Yadav SK, et al. Fecal Lcn-2 level is a sensitive biological indicator for gut dysbiosis and intestinal inflammation in multiple sclerosis. Front Immunol. 2022;13:1015372. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1015372.
  21. Luo Q, et al. Bioinformatics analysis reveals potential crosstalk genes and molecular mechanisms between ulcerative colitis and psoriasis. Arch Dermatol Res. 2024;317:118. https://doi.org/10.1007/s00403-024-02856-1.
  22. Nielsen OH, et al. Rectal dialysate and fecal concentrations of neutrophil gelatinase-associated lipocalin, interleukin-8, and tumor necrosis factor-alpha in ulcerative colitis. Am J Gastroenterol. 1999;94:2923–2928.
  23. Sun Y, et al. Natural polyphenol rutin inhibits ferroptosis in ulcerative colitis by regulating lipid metabolism via blocking the LCN2-ALOX15 axis. Food Funct. 2025;16:7169–7186.
  24. Sofia MA, et al. Tryptophan metabolism through the kynurenine pathway is associated with endoscopic inflammation in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 2018;24:1471–1480.
  25. Shon WJ, et al. Severity of DSS-induced colitis is reduced in Ido1-deficient mice with down-regulation of TLR-MyD88-NF-kB transcriptional networks. Sci Rep. 2015;5:17305. https://doi.org/10.1038/srep17305.
  26. Zeng T, et al. Indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 enhances hepatocytes ferroptosis in acute immune hepatitis associated with excess nitrative stress. Free Radic Biol Med. 2020;152:668–679.
  27. Pavlidis P, et al. Interleukin-22 regulates neutrophil recruitment in ulcerative colitis and is associated with resistance to ustekinumab therapy. Nat Commun. 2022;13:5820. https://doi.org/10.1038/s41467-022-33333-3.
  28. Urzua U, et al. The ovarian transcriptome of reproductively aged multiparous mice: Candidate genes for ovarian cancer protection. Biomolecules. 2020;10:113. https://doi.org/10.3390/biom10010113.
  29. Zahn A, et al. Transcript levels of different cytokines and chemokines correlate with clinical and endoscopic activity in ulcerative colitis. BMC Gastroenterol. 2009;9:13. https://doi.org/10.1186/1471-230X-9-13.
  30. Yi Q, et al. Application of genomic selection and experimental techniques to predict cell death and immunotherapeutic efficacy of ferroptosis-related CXCL2 in hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 2022;12:998736. https://doi.org/10.3389/fonc.2022.998736.
  31. Kolios G, Valatas V, Ward SG. Nitric oxide in inflammatory bowel disease: A universal messenger in an unsolved puzzle. Immunology. 2004;113:427–437.
  32. Cheng F, et al. Identification of differential intestinal mucosa transcriptomic biomarkers for ulcerative colitis by bioinformatics analysis. Dis Markers. 2020;2020:8876565. https://doi.org/10.1155/2020/8876565.
  33. Tratensek A, et al. Oxidative stress-related biomarkers as promising indicators of inflammatory bowel disease activity: A systematic review and meta-analysis. Redox Biol. 2024;77:103380. https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103380.
  34. Zhang JL, et al. Jatrorrhizine alleviates ulcerative colitis via regulating gut microbiota and NOS2 expression. Gut Pathog. 2022;14:41. https://doi.org/10.1186/s13099-022-00516-7.
  35. Li H, et al. Development of a prognostic model based on ferroptosis-related genes for colorectal cancer patients and exploration of the biological functions of NOS2 in vivo and in vitro. Front Oncol. 2023;13:1133946. https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1133946.
  36. Seibt TM, Proneth B, Conrad M. Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication. Free Radic Biol Med. 2019;133:144–152.
  37. Holland T, Mattner J. Intestinal eosinophils: Characterization of elusive granulocytes as anti-bacterial and immunomodulatory effector cells in colitis. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:321. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01588-4.
  38. Nguyen J, et al. Overexpression of programmed death ligand 1 in refractory inflammatory bowel disease. Hum Pathol. 2022;126:19–27.
  39. Shen Z, et al. Exploration of a screening model for intrahepatic cholangiocarcinoma patients prone to cuproptosis and mechanisms of the susceptibility of CD274-knockdown intrahepatic cholangiocarcinoma cells to cuproptosis. Cancer Gene Ther. 2023;30:1663–1678.
  40. Niu Y, et al. Platelet activation stimulates macrophages to enhance ulcerative colitis through PF4/CXCR3 signaling. Int J Mol Med. 2025;55:78. https://doi.org/10.3892/ijmm.2025.5499.
  41. Qu F, et al. The role of macrophage polarization in ulcerative colitis and its treatment. Microb Pathog. 2025;199:107227. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2025.107227.
  42. Danne C, Skerniskyte J, Marteyn B, Sokol H. Neutrophils: From IBD to the gut microbiota. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2024;21:184–197.
  43. Zhao Q, et al. CD4+ T cell activation and concomitant mTOR metabolic inhibition can ablate microbiota-specific memory cells and prevent colitis. Sci Immunol. 2020;5:eabc6373. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abc6373.
  44. Chen E, et al. Inflamed ulcerative colitis regions associated with MRGPRX2-mediated mast cell degranulation and cell activation modules, defining a new therapeutic target. Gastroenterology. 2021;160:1709–1724.
  45. Xu H, Wu C, Wang D, Wang H. Alleviating effect of Nexrutine on mucosal inflammation in mice with ulcerative colitis: Involvement of the RELA suppression. Immun Inflamm Dis. 2024;12:e1147. https://doi.org/10.1002/iid3.1147.
  46. Luo Y, et al. Rab27A promotes cellular apoptosis and ROS production by regulating the miRNA-124-3p/STAT3/RelA signalling pathway in ulcerative colitis. J Cell Mol Med. 2020;24:11330–11342.
  47. Pace F, Watnick PI. The interplay of sex steroids, the immune response, and the intestinal microbiota. Trends Microbiol. 2021;29:849–859.
  48. Rodriguez J, Olivares M, Delzenne NM. Implication of the gut microbiota in metabolic inflammation associated with nutritional disorders and obesity. Mol Nutr Food Res. 2021;65:e1900481. https://doi.org/10.1002/mnfr.201900481.
  49. Ojha R, et al. Emerging role of circulating microRNA in the diagnosis of human infectious diseases. J Cell Physiol. 2019;234:1030–1043.
  50. Tian Y, et al. LncRNA CDKN2B-AS1 relieved inflammation of ulcerative colitis via sponging miR-16 and miR-195. Int Immunopharmacol. 2020;88:106970. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2020.106970.
  51. Kulkarni N, Pathak M, Lal G. Role of chemokine receptors and intestinal epithelial cells in the mucosal inflammation and tolerance. J Leukoc Biol. 2017;101:377–394.
  52. Stadnyk AW. Intestinal epithelial cells as a source of inflammatory cytokines and chemokines. Can J Gastroenterol. 2002;16:241–246.
  53. Xu Y, Chen N. DUOX2-mediated innate immune hyperactivation drives macrophage M1 polarization via the APP-CD74 axis in inflammatory bowel disease. Presented at: 19th Congress of the European Crohn’s and Colitis Organisation (ECCO 2026); Stockholm, Sweden; 2026. https://academic.oup.com/ecco-jcc/article/20/Supplement_1/jjaf231.232/8432779.
  54. Shi CL, et al. Single-nucleus transcriptome unveils the role of ferroptosis in ischemic stroke. Heliyon. 2024;10:e32727. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e32727.
  55. Tu H, et al. Integrated single-cell analysis with experimental validation reveals ANXA2 as a therapeutic target for ferroptosis in inflammatory bowel disease. Am J Transl Res. 2026;18:91–111.
  56. Yan C, et al. Exploring the anti-ferroptosis mechanism of Kai-Xin-San against Alzheimer's disease through integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation strategy in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol. 2024;326:117915. https://doi.org/10.1016/j.jep.2024.117915.
  57. Shaik JP, Ahmad A. Pharmacological mechanism of cinnamic acid in the treatment of prostate cancer by network pharmacology. Archives of Medical Reports. 2024;1(2):1–6. https://doi.org/10.26524/amr.2024.2.1.
  58. Nimmagadda S, Patel S, MR Vishwathika. Targeting ferroptosis: A novel therapeutic avenue in osteoarthritis and bone degeneration. Archives of Medical Reports. 2025;2(5):6–9. https://doi.org/10.26524/amr.2025.5.2.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מוות תאי מווסתתאי אפיתל של המעיפרופיל תעתוק (Transcriptomic Profiling)גנים עם ביטוי שונה (DEGs)ניתוח באמצעות למידת מכונהניתוח תאים בודדיםתיקוף סממנים ביולוגיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.