תצפית מיקרוסקופית, רגישות לתרופות (MODS) assay היא בעלות נמוכה, low-tech כלי לגילוי בעל ביצועים גבוהים של שחפת (TB) ו multidrug עמיד שחפת (MDRTB). וידאו זה מתאר את שיטת התקשורת MODS נוזלי תרבות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חולים עם שחפת ריאתית פעילה (TB) 10-15 להדביק אנשים אחרים בשנה, מה שהופך לאבחון שחפת פעילה חיוני הן לרפא את המטופל ומניעת זיהומים חדשים. יתר על כן, את הופעתה של multidrug שחפת עמידים (MDRTB) כלומר זיהוי של עמידות לתרופה הכרחי לעצור התפשטות של זנים עמידים לתרופה. תצפית מיקרוסקופית, רגישות לתרופות (MODS) assay היא בעלות נמוכה, low-tech כלי לגילוי בעל ביצועים גבוהים של שחפת MDRTB. Assay MODS מבוססת על שלושה עקרונות: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) גדל מהר יותר בתקשורת נוזל מאשר על התקשורת מוצק 2) צמיחה MTB מיקרוסקופי ניתן לאתר מוקדם יותר בכלי התקשורת נוזל מאשר לחכות להופעת מקרוסקופית של מושבות על התקשורת מוצק, כי הצמיחה האופיינית MTB, שמאפשר לו להבחין בין זיהום mycobacteria או פטרייתי או חיידקי טיפוסיות 3) התרופות isoniazid ו ריפמפיצין ניתן לשלב assay MODS כדי לאפשר זיהוי ישיר סימולטני של MDRTB, obviating את הצורך תת לבצע תרופה עקיף רגישות הבדיקה. אבחון הנוכחית מתחרים הם הקשו על ידי רגישות נמוכה למרוח עם כיח, עיכובים ארוכים עד לאבחון עם תרבות התקשורת מוצק, עלות גבוהה להחריד עם נוזל התקשורת השיטות הקיימות התרבות, צריך לעשות תת לבדיקת רגישות עקיף התרופה כדי לזהות MDRTB. לעומת זאת, שיטה שאינה קניינית MODS בעל רגישות גבוהה עבור שחפת MDRTB, היא שיטה התרבות מהירה יחסית, מספק בדיקות סימולטני הרגישות תרופה MDRTB, והוא נגיש מוגבל משאב הגדרות בבית רק תחת $ 3 עבור בדיקת שחפת MDRTB.
פרוטוקול
- הכינו פתרונות מניות
- פוספט חיץ מניות
- מערבבים 950ml של תמיסת נתרן dibasic (9.47g של dibasic סודיום פוספט מומס במים מזוקקים 1000ml) עם 950ml של תמיסת אשלגן זרחתי monobasic (9.07g של פוספט monobasic אשלגן מומס במים מזוקקים 1000ml) ומערבבים; לשמור על הגב של 50 מ"ל כל פתרון כדי להתאים pH במידת הצורך
- התאם ל-pH 6.8 ± 0.2: להוסיף נתרן זרחתי פתרון dibasic להעל....
- פוספט חיץ מניות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Assay MODS מיועד משאב מוגבל הגדרות. בפעם הראשונה, MODS מביא את היכולת לאיתור מהיר תרבות נוזלי של שחפת multidrug שחפת עמידים משאב מוגבל רק על הגדרות תחת 3 דולר הבדיקה. MODS הוא שאינה קניינית, איטרטיבי מתודולוגיה, והקהילה MODS מעוניינת תמיד שיפורים מעבדות אחרות הצליחו לעשות.
החשש הוא חוזר biosafety של תרבות התקשורת נוזלי משחפת בגלל נוזלים יכול להיות שנשפך או aerosolized. אנו מאמינים כי assay MODS הוא biosafe יותר assay כל כך רגישות מעורב בעקיפין בדיקות סמי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
ברצוננו להודות שון Fitzwater וכרמן Giannina לונה קולומבו עבור קטע וידאו צמיחה שחפת זמן לשגות. אנו מודים מרטי רופר על המשוב יסודי מעולה שלה במהלך העריכה עריכה משותפת המדריך למשתמש, שממנו פרוטוקול הנוכחי נלקח בעיקר מילה במילה. הפקת וידאו זה מומן על ידי NIH / פוגארטי המרכז הבינלאומי http://www.fic.nih.gov/ דוד AJ מור תרם כמו עמית מחקר Wellcome Trust קליניים ברפואה Reader טרופי ועל מחלות זיהומיות באימפריאל קולג' בלונדון (Fellowship פרס מספר 078067/Z/05). מארק פ בריידי תרמו כמו עמית NIH / פוגארטי מרכז המחקר הבינלאומי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| מקרר/מקפיא | ציוד | לאחסון מצע דשחה (broth) שהוכן מראש ומלאי של אנטיביוטיקה | ||
| ערבוב במכשיר וורטקס (Vortex) | ציוד | כדי לסייע בדה-קונטמינציה של ליחה | ||
| צנטריפוגה | ציוד | לריכוז ליחה; מסוגל להגיע ל-3000 g; d–אין צורך בקירור, אך חובב שהדבר יהיה בטוח ביולוגית (ניתן לאטום את הדליים) | ||
| אינקובטור (37 מעלות צלזיוס) | ציוד | לתרבית; אין צורך בהעשרה ב-CO2 | ||
| מיקרוסקופ אור הפוך | מיקרוסקופ | לקריאת פלטות MODS | ||
| אוטוקלאב | ציוד | לעיקור מצעים, PBS וצלחות משומשות | ||
| מאזניים | ציוד | לשקול isoniazid, rifampicin ו-NALC | ||
| ציר Middlebrook 7H9 (Difco) | ריאגנט | Fisher Scientific | DF0713-17-9 | 500 גרם/בקבוק; בסיס למצע גידול |
| Casitone (קזאין שעבר עיכול פןקראטי) | ריאגנט | Fisher Scientific | DF0259‐17‐9 | 500 גרם/בקבוק; בסיס למצע גידול |
| גליצרול (גליצרין) ליופיליזציה (lyophilized) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | G‐33‐500 | 500 מ"ל לבקבוק; בסיס למצע גידול |
| PANTA (תערובת אנטיביוטיקה ליאופיליזציה BD) | ריאגנט | Fisher Scientific | B4345114 | 6 בקבוקים למארז; תוסף אנטיביוטי למצע גידול |
| OADC (העשרה Middlebrook OADC של BD) | ריאגנט | Fisher Scientific | B11886 | 10 x 20 מ"ל למארז; תוסף למצע תזונתי |
| דימתיל סולפוקסיד (Hibri-Max) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | D-2650 | 100 מ"ל לבקבוק; להכנת תמיסת אם של rifampicin |
| תמיסות מאסף של אנטיביוטיקה: isoniazid | ריאגנט | Sigma-Aldrich | I-3377 | 50 גרם לבקבוק; בדיקת רגישות ישירה |
| מלאי אנטיביוטיקה: ריפמפיצין (rifampicin) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | R-3501 | 1 גרם/בקבוק; בדיקת רגישות ישירה |
| נתרן הידרוקסיד (גרגירים) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | 221465 | 500 גרם/בקבוק; דה-קונטמינציה של ליחה |
| נתריום ציטראט (מלח טרי-נתריום דיהידראט) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | S-4641 | 500 גרם/בקבוק; דה-קונטמינציה של ליחה |
| N-acetyl-L-cysteine | ריאגנט | Sigma-Aldrich | A-7250 | 50 גרם/בקבוק; דה-קונטמינציה של ליחה |
| גביש אשלגן פוספט מונובסי, KH2PO4 | ריאגנט | Sigma-Aldrich | P0662 | 500 גרם/בקבוק; דה-קונטמינציה של ליחה |
| נתרן פוספט דו-בסיסי, אנहाइडראס. Na2HPO4 | ריאגנט | Sigma-Aldrich | S0876 | 500 גרם/בקבוק; דה-קונטמינציה של ליחה |
| נתרן היפוכ לוריט | ריאגנט | מסיר כתמים ביתי המכיל כלור (אקונומיקה) | להשליך פסולת מזוהמת | |
| מבחנות צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל (פוליפרופילן, 15 מ"ל Falcon 35)‐2096) | מתכלה | Fisher Scientific | 14‐959‐49B | 500 יחידות למארז; לדה-קונטמינציה וריכוז של ליחה |
| פלטות עם 24 בארות (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35)‐3047) | חומר מתכלה | Fisher Scientific | 08-772-1 | 50 צלחות למארז; לתרבית ולקריאה |
| שקיות פוליאתיל ניתנות לסגירה 6 X 6 “ (שקיות עם סגירה הרמטית) | מתכלה | עבור ביו-אבטחה, להכיל פלטה בעלת 24 בארות | ||
| מבחנות זכוכית עם מכסה (16 x 100 מ"מ ו-18 x 145 מ"מ) | חומר מתכלה | VWR international | 47729-583 | 500 מבחנות למארז; לאחסון של מנות (aliquots) של מצע צמיחה נוזלי (broth) שהוכן |
| מבחנות מיקרוצנטריפוגה עם פקק הברגה (1.5 מ"ל) | חומר מתכלה | Fisher Scientific | 05‐669‐22 | 1000 יחידות למארז; לאחסון מנות (aliquots) של תטירי אנטיביוטיקה |
| 0.22μמסנני $\mu\text{m}$ (ממסים מימי) מסנן מזרקה Millex blue | חומר מתכלה | Fisher Scientific | SLGL 025 OS | 50 יחידות למארז; לסינון מלאי אנטיביוטיקה |
| 0.22μמסנני מזרקה (ממסים אורגניים) Millex צהוב | חומר מתכלה | Fisher Scientific | SLGV 033 RS | 50 יחידות למארז; לסינון מלאי אנטיביוטיקה |
| פיפטות פסטור חד-פעמיות, זכוכית בורוסיליקט 9″ | חומר מתכלה | Fisher Scientific | 13‐678‐20°C | 720 יחידות למארז; לערבב PANTA עם תערובת המצע |
| טיפים עם מחסום לארסול 1000‐1300μנראה כי לא סיפקת טקסט לתרגום. אנא הזן את הטקסט המדעי שברצונך לתרגם מאנגלית לעברית. | חומר מתכלה | Fisher Scientific | 02‐707‐51 | 1000 יחידות למארז; להעברת מצע לתוך צלחת |
| USA Scientific Tips One 1‐200μטיפים צהובים (Yellow tips) | חומר מתכלה | Fisher Scientific | 1111‐0006 | 1,000 טיפים לשקית; לדילול מלאי אנטיביוטיקה |
מקורות
- Arias, M. Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis. Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).
- Caviedes, L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
