במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster
במאמר זה
סיכום
תקציר
מערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי תסיסנית הוא מורכב הבינו היטב. אחת הדרכים לחקור את מערכת העצבים המרכזית היא להשתמש אימונוהיסטוכימיה לבחון את הביטוי של רומן שונים וחלבונים הסמן. הכתמה של הזחלים כל מעשי משום לציפורן קשה מונע נוגדנים לחדור בתוך חלל הגוף. על מנת כתם אלה רקמות יש צורך לנתח את הבהמה לפני תיקון ו מכתים. במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח הזחלים תסיסנית מבלי לפגוע במערכת העצבים המרכזית. בגין על ידי קורעת את הזחל במחצית עם זוג מלקחיים בסדר, ולאחר מכן להפעיל את הקוטיקולה "מבפנים החוצה" כדי לחשוף את מערכת העצבים המרכזית. אם הניתוח מבוצע בזהירות CNS תישאר מחוברת לציפורן. אנחנו בדרך כלל לשמור על מערכת העצבים המרכזית מחוברת לציפורן בכל הצעדים קיבעון ו מכתים, ורק להסיר לחלוטין את מערכת העצבים המרכזית של לציפורן ממש לפני הרכבה דגימות בשקופיות זכוכית. אנחנו גם להראות כמה תמונות של נציג CNS הזחל מוכתם וחוה, גורם שעתוק לידי ביטוי משנה של נוירונים במערכת העצבים המרכזית. המאמר מסתיים בדיון על כמה שימושים מעשיים של טכניקה זו ועל הקשיים הפוטנציאליים שעלולים להתעורר.
פרוטוקול
- מנתחים 3 rd הזחלים instar, עוזב CNS מחוברת לציפורן. מקום צינור 1.5 מ"ל.
- תקן של PBS (1x) המכיל פורמאלדהיד 2% עבור 40 דקות עם נדנדה. ; השתמש 250ul לכל CNS גזור 5-10.
- הסר פורמאלדהיד בקצרה לשטוף 3 פעמים עם PBS 0.1% + טריטון X-100 (PBST). השתמש משך דק פיפטה פסטר כדי למנוע אובדן של רקמות.
- בלוק הלא ספציפית אתרי חלבון מחייב permeabilize קרום התא על ידי דוגרים 1-8 שעות רקמות PBST BSA + 5%, מתנדנד על 4 ° C.
- מדגירים את הנוגדן העיקרי מדולל PBST + 5% BSA נדנדה ב 4 ° C למשך הלילה. דילול נוגדן אופטימלית ישתנו עבור נוגדנים שונים.
- לשטוף 3x ב PBST ואחריו שני שוטף 30 דקות ב 4 ° C.
- דגירה של נוגדנים משני מדולל PBST BSA + 5% עבור שעות 1-3 נדנדה ב 4 ° C. לשטוף 3x ב PBST ואחריו שני שוטף 30 דקות ב 4 ° C. אם משני הוא מצומדות למתחם רגיש לאור, לעטוף את צינור בנייר אלומיניום.
- לנתח רקמות נוספות (במידת הצורך) ואת הר בשקופיות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
וידאו זה מדגים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar. לאחר דיסקציה, CNS יכול להיות מוכתם באמצעות פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי. נכון לעכשיו, עדיין לא ידוע הרבה על איך מערכת העצבים הבוגרת מופק וכן כיצד הוא מאחסן ומעביר מידע. מחקרים של מערכת העצבים המרכזית תסיסנית בפיתוח הזחל צריך לשפר את הידע שלנו על חיווט למערכת העצבים לתפקד.
הזחלים תסיסנית התערוכה מספר התנהגויות stereotpyed, כגון בתגובה לאותות סביבתיים. כיצד התנהגויות אלה ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| פינצטה | בעלת קצה דק | |||
| זכוכית שעון בעלת 9 שקעים | ||||
| צלחת פטרי מפלסטיק |
מקורות
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13, 507-523 (1994).
- Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S. even skipped is required to produce a trans-acting signal for larval neuroblast proliferation that can be mimicked by ecdysone. Development 128. , 1899-1909 (2001).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
