זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאז הפיתוח שלה על ידי Sakmann ואת נהר 1, 2, מהדק את התיקון הפך הוקמה טכניקה שימושית מאוד עבור מדידה אלקטרו של תעלות יונים יחיד או מספר תאים. טכניקה זו ניתן להחיל על תעלות יונים בסביבה הן מולדתם והביעו בתאים Heterologous, כגון ביציות שנקטפו מן הצפרדע טפרים אפריקה, Xenopus laevis. כאן אנו מתארים את הטכניקה מבוססת היטב של הקלטה תיקון מהדק מ ביציות Xenopus. טכניקה זו משמשת כדי למדוד את המאפיינים של תעלות יונים לידי ביטוי גם באוכלוסיות (macropatch) או בנפרד (יחיד ערוץ הקלטה). אנו מתמקדים וטכניקות על מנת למקסם את איכות הביצית הכנה הדור חותם. עם כל הגורמים אופטימיזציה, טכניקה זו נותנת הסתברות של הדור חותם מוצלח מעל 90 אחוז. התהליך עשוי להיות מותאם באופן שונה על ידי כל חוקר מבוסס על הגורמים הוא או היא מוצאת החשוב ביותר, ואנחנו מציגים את הגישה כי יש להוביל להצלחה רבה בידינו.
פרוטוקול
חלק 1: הסרת הממברנה vitelline
- הכן שני סטים של מלקחיים. אנחנו מעדיפים 5 מס 'מלקחיים, שם קבוצה אחת כבר חידד מעט עם קובץ. כמו כן להכין פיפטה העברת זכוכית ידי זמירה ואת האש ליטוש 7 "פיפטה פסטר.
- מומלץ: כדי למנוע את החלקת ביציות, לחתוך עיגול של רשת (1 ריבועים מ"מ) דבק לתוך החלק התחתון של צלחת פטרי 60mm. מנה זו ניתן לעשות שימוש חוזר ללא הגבלת זמן, אם הזמן לנקות בין השימושים.
- מלאו את צלחת פטרי באמצע פתרון hyperosmotic (ראו מתכון) ומקום ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנם פרמטרים רבים הקלטה אלקטרו לא נדון כאן. התקנת המתקן, רעש מערכת ניהול, הביטוי הערוץ, ופרוטוקולים הקלטה דבר קריטי גם תוצאות הניסוי טוב.
מניסיוננו, אלו הם הפרמטרים הקריטיים ביותר עבור יצירת חותמות אמין: ביציות באיכות גבוהה, הסרת קרום vitelline מהר (aka, "פילינג"), משך השימוש pipettes החדש מוגן מפני אבק, טפטפות חלקה, לחץ חיובי מוחל בעת הזנת אמבטיה הפתרון, פעמים קצר באמבטיה לפני האיטום. להיות זה אמר, חוויה משתנה מאוד ואחרים סטים משלהם הגורמים הח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
מתכון הפתרון הוא כיווץ מהמעבדה של RW אולדריץ'. אנו מודים סוכנויות מימון הבאים היסודות תמיכה: National Institutes of Health, הקרן הלאומית למדע, איגוד הלב האמריקני, איגוד ניוון שרירים, ב 'דונלד E. בקסטר דליה קרן, קרן Klingenstein ולקרן מק' נייט למדעי המוח.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| מגבר Patch Clamp &תוכנה | מכשיר | HEKA Instruments | EPC-10 | או מכשיר דומה אחר (למשל HEKA EPC-9 או Axopatch 200B) |
| פינצטות מס' 5 (שני זוגות) | כלי | Fine Science Tools | ||
| תמיסה לכיווץ ביציות | ריאגנט | רכיב N-methyl-D-glucamine בריכוז mMN HEPES 220 MgCl2 10 EGTA 1 חומצה אספרטית 220 KCl 2 pH ל-7.4 באמצעות N-methyl-D-glucamine | ||
| רשת ארוגה | 800 מיקרון | Spectrum Labs | 146481 |
מקורות
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
