מאמר שיטה

ביצוע Patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות

DOI:

10.3791/939

⸱

8 באוקטובר 2008

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University , 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וידאו זה מראה כיצד להשתמש חולץ לתכנות לעשות pipettes תיקון אלקטרודות חדה electrophysiology. הפרוצדורה זהה ניתן להשתמש כדי ליצור מגוון של כלי זכוכית, כולל הזרקה ומחטים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microelectrodes זכוכית (הנקרא גם pipettes) היה סוס עבודה של electrophysiology במשך עשרות שנים. היום, טפטפות כאלה עשויים זכוכית נימים באמצעות חולץ לתכנות. כזה חום המכשירים נימי שימוש או נימה מתכת או לייזר להוציא את הזכוכית באמצעות הכבידה, מנוע או שניהם. Pipettes הקלטה תיקון-clamp נוצרות באמצעות חום כוח הכבידה בלבד, בעוד האלקטרודות חדה הקלטה תאיים להשתמש בשילוב של חום, כוח הכבידה, ואת המנוע. הליך המשמש לייצור טפטפות הקלטה תאיים דומה לזה המשמש לייצור הזרקת מחטים עבור מגוון של יישומים, כולל הזרקה לתוך ביציות Xenopus קרנה. בשנת זכוכית, כללי נימי <1.2 מ"מ קוטר היא נהגה להכין pipettes הקלטה מהדק תיקון, בעוד זכוכית צר משמש להקלטת תאיים (קוטר חיצוני = 1.0 מ"מ). לכל אחד מהכלים, חולץ מתוכנת שונה במקצת. סרט הווידאו הזה מראה איך לעשות את שני סוגי pipettes הקלטה באמצעות שנקבעה מראש תוכניות חולץ.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משיכת pipettes

שימוש microelectrode כזה חולץ כמו סאטר P-97 Flaming / בראון, למשוך קבוצה של כ 10-20 pipettes.

  1. בחר זכוכית נימי שלך. אנו משתמשים בורוסיליקט נימים (סאטר BF150-110-10, 1.5mm קוטר חיצוני, קוטר פנימי 1.1mm, 10 ס"מ אורך). אחסן את הכוס בזהירות כך הוא נשאר נקי אבק חינם.
  2. תוכנית עיצוב מושך. אנו להשתמש בתוכנית 5 צעד, עם החום יורד ומהירות בכל שלב, וכן למשוך קטן על המדרגה האחרונה. פיפטה של ​​סאטר בישול היא הפניה מצוינת לפתח תוכניות מתאימות.
  3. בדוק את הטיפים פיפטה תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בקוטר הפתיחה החלקות. בטל מחוספס, טיפים אחידה, או לא סדיר. פרוטוקול משיכת טוב צריך להבטיח האלה הם נדירים. להקלטת תיקון-clamp סטנדרטי, פתחים טיפ צריך להיות 1-3 מיקרונים בקוטר. להתחדד תלול (בוטה קצה) מוביל התנגדות נמוכה יותר עבור קוטר הפתיחה זהה. הצורה והגודל ניתן לשנות על ידי ליטוש הלחץ.

ליטוש אש pipettes

  1. הגדרת מעטה ליטוש (microforge) עם נימה פלטינה חימום מבוקר על ידי דוושת רגל. ערכת שימושי זמין ALA מדעי (CPM-2) או מנגנון דומה ניתן להרכיב טיפין טיפין.
  2. אופציונלי: מעיל פיפטה עם מבודד כדי להקטין קיבוליות ולשפר את המאפיינים רעש. אנו משתמשים שעווה שיניים. Sylgard 184 ™ (poly-דימתיל אלסטומר siloxane הידוע גם בשם PDMS) היא גם אופציה.
  3. אם באמצעות שעווה, לשמור על אספקת מותכת קטן בקרבת מקום. עם לחץ אוויר על גבו של פיפטה לשמור שעווה מלהיכנס פיפטה, טובלים את קצה בקצרה בשעווה נוזלית ולהסיר. עם Sylgard, אלסטומר חנות שהוכנו aliquots קפוא לצבוע את קצה פיפטה תחת מיקרוסקופ. מחממים לרפא את אלסטומר.
  4. מניחים את פיפטה (מצופה או לא) במנגנון ליטוש להביא את קצה ~ 50 מיקרון מן החוט. זכור כי החוט תרחיב כאשר מחומם.
  5. מומלץ: בצע את פרוטוקול נפרד עבור "ליטוש לחץ" כדי לשנות את הצורה של פיפטה להתנגדות אופטימלית קוטר קצה.
  6. הדופק חום קצר (1-2 שניות) הוא מספיק כדי להסיר את השעווה מהקצה של פיפטה וחלק הזכוכית.
  7. מניחים את פיפטה סיים בתיבה סגורה על מנת להגן מפני אבק, חזור עבור 10 pipettes מוצלח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאויר פרוטוקול כאן נמצא בשימוש יומיומי electrophysiology מעבדות משמש גם כדי להפוך את מחטי הזרקה של תאים וחיות. עם חולץ לתכנות, קל לעשות pipettes עבור מגוון רחב של שימושים. עם תשומת לב וטיפול, חולץ על נימה שלך יימשך שנה או יותר. בהצלחה עם הניסויים שלך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים סוכנויות מימון הבאים היסודות תמיכה: National Institutes of Health, הקרן הלאומית למדע, איגוד הלב האמריקני, איגוד ניוון שרירים, ב 'דונלד E. בקסטר דליה קרן, קרן Klingenstein ולקרן מק' נייט למדעי המוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכשיר למשכה של מיקרופיפטותמכשירSutter Instrument Co.P-97או מכשיר דומה (למשל Sutter P-87 או P-2000)
קפילריות זכוכיתריאגנטSutter Instrument Co.BF150-86-10או זכוכית קפילרית דומה. כדי להקל על מילוי הפיפטה, השתמשו בקפילריה עם סיב זכוכית.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patch ClampSutter P97Microforge

מאמרים קשורים