Why is aseptic technique critical in environmental microbiology research?

Aseptic technique prevents bacterial and fungal contamination of reagents, culture media, and environmental samples, while avoiding cross-contamination between samples. Contamination can result in prohibitive costs to replace cultures, especially rare isolates from unique environments that may be irreplaceable. The technique also protects researchers by reducing pathogen transmission during laboratory work.

What are the main sources of contamination in a microbiology laboratory?

Common contamination sources include airborne microorganisms adhering to dust and lint particles, microbes on laboratory benches and unsterilized equipment, and microbes transferred from the researcher's hair, body, and clothing. Understanding these sources helps guide proper aseptic practices to maintain sterile working environments and protect culture integrity.

How does a Bunsen burner create a sterile working environment?

A Bunsen burner generates heat that causes air convection, creating an updraft that lifts airborne contaminants away from the flame vicinity. This updraft establishes a sterile field where aseptic experimental work can be conducted safely. The flame also sterilizes tools like inoculation loops and glass rods through direct heat exposure.

What is the proper procedure for sterilizing growth media in an autoclave?

Dissolve solid medium components in the specified liquid solvent in an autoclavable container with a magnetic stir bar. Loosely cap glass vessels to allow gas expansion during heating. Apply autoclave tape, then sterilize according to manufacturer instructions, typically 20 minutes at 121°C. Verify the tape stripes turned black, indicating proper temperature was reached.

How do you aseptically transfer bacteria using an inoculating loop?

Sterilize the inoculation loop by passing it through a flame until red hot. For solid agar, gently tap the hot loop on empty agar to cool it, then scrape a single colony. For liquid culture, pass the container mouth through flame 2-3 times, insert the cooled loop, and remove one loopful. Always sterilize the loop after use to prevent contamination.

What technique produces isolated bacterial colonies on an agar plate?

Streak the inoculation loop back-and-forth across one sector of sterile agar. Sterilize and cool the loop, then make a second streak at an obtuse angle, crossing the first streak on initial strokes only. Repeat sterilization and streaking two more times. Individual colonies appear on the final streak, while a bacterial lawn covers earlier streaks.

How are aseptic techniques applied to studying bacteriophages in environmental samples?

Researchers grow bacterial cultures under aseptic conditions, then mix soil-derived phage solutions with the bacterial culture and plate onto agar. A bacterial lawn forms on the plate, but plaques—clearings where viruses killed bacteria—appear at infection sites. Phage can then be purified from these plaques for further study using detection of bacteriophages in environmental samples methods.

טכניקה אספטית במדעי הסביבה

0 צפיות10:48 דק'

1. הכנה לעבודה אספטית

השגו והחלו את פריטי ה- PPE הבאים: חלוק מעבדה, כפפות לטקס או ניטריל (ללא דמעות או חורים) ומשקפי בטיחות(איור 1). לבטיחות במקרה של שימוש בלהבה פתוחה, לקשור את השיער הארוך.

איור 1: PPE: חלוק מעבדה, כפפות לטקס ומשקפי בטיחות.
היבט חשוב שני של טכניקה אספטית הוא עיקור ואחסון נאותים של מדיה / ריאגנטים לשימוש במעבדה. הכן מדיום מרק נוזלי(למשל,ציר סויה טריפטי) ומדיה מבוססת אגר(למשל,R2A) על ידי שקילה של הכמות הנכונה של אבקת בסיס מיובש, אשר מתווסף לכמות המתאימה של מים דה מיוננים.
עבור מדיום המרק, להמיס את האבקה על צלחת חמה עם חום נמוך מוחל, ולחלק את הנוזל או בנפחים 100 מ"ל לתוך צלוחיות בורג זכוכית העליון, או בנפחים 10 מ"ל לתוך מבחנות בורג זכוכית העליון. בעזרת מוט ערבוב מגנטי, מערבבים את מדיום האגורוז על מערבל הצלחת החמה עד שהאבקה מתמוססת לחלוטין.
החלת סרט אוטומטי על הגורמים המכילים, ובודד את המדיה באופן אוטומטי בהתאם להוראות היצרן (למשל,20 דקות ב- 121 °C(איורים 2 ו - 3). שים לב שצבע הפסים בקלטת ההקלבה האוטומטית צריך להשתנות מלבן (טרום-autoclave) לשחור (לאחר ההקלבה האוטומטית). למרות שינוי הצבע בדרך כלל מציין כי עיקור היה מוצלח, בדיקות עיקור באמצעות ערכות רצועת נבג ניתן לבצע כדי לאמת את תהליך autoclaving.

איור 2: הקלטת המוחלת אוטומטית על חומר.

איור 3: שים לב לשינוי הצבע של פסים בקלטת אוטומטית מלבן (טרום-אוטוקלבה) לשחור (לאחר ההקלבה האוטומטית).
מצננים את המרק הנוזלי לטמפרטורת החדר, ואז מאחסנים בטמפרטורת החדר או בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
מצננים את מדיום האגורוז על ידי הנחת המיכל באמבט מים מוגדר ~ 50 מעלות צלזיוס. לאחר התקררות, ניתן לשפוך את המדיה למנות פטרי סטריליות. אפשר למדיום להתקרר ולחזק, ולאחר מכן להתאחד לאחסון בטמפרטורות שצוינו על-ידי היצרן.
ישנם מספר סוגים של מדיה תרבותית כי לא ניתן autoclaved כמו הטמפרטורות הגבוהות להשפיל מרכיבים קריטיים. חיטוי אלה דורשים עיקור מסנן באמצעות מערכת סינון ואקום המשתמשת מסנן 0.22-μm, ואחריו אחסון בטמפרטורה המתאימה.
לפני ביצוע העבודה על הספסל, לחטא את פני השטח באמצעות פתרון מתאים (למשל,אקונומיקה 500-ppm). זה מוריד את הסיכון להעברת מזהמים משטח העבודה לתרבויות ומדיה סטרילית.
כדי להקים שדה סטרילי, הפעל מבער בונזן. סוג הלהבה המתאים ביותר לחיטוי לולאות חיטוי מתכת הוא להבה כחולה עזה, עם קונוס כחול מוחלט שנצפו באמצע(איור 4).

איור 4: העברת חיידקים מצלחת פטרי אחת המציגה צמיחה של איזולט בתרבית ללוח פטרי לא מחוסן אחר המכיל מדיום גדילה מבוסס אגר.
לאט לאט להעביר את הלולאה המחסנת דרך החלק החם ביותר של הלהבה (קצה החרוט הכחול). הלולאה צריכה להפוך אדומה חמה לצורך עיקור.

2. העברות חיידקים: מצלחת פטרי לצלחת פטרי

תרחיש אחד של העברת חיידקים הוא מצלחת פטרי אחת המציגה צמיחה של איזולט בתרבית לצלחת פטרי סטרילית המכילה מדיום צמיחה מבוסס אגר.
ראשית, פתחו מעט את צלחת הפטרי המכילה את תרבית החיידקים הטהורה, והקשו בעדינות על לולאת החקוס החמה והמיערת על פני השטח של אגר.
יש לאחזר מושבה מבודדת אחת מפני השטח של הלוח באמצעות לולאת החנק המקוררת, ולסגור את צלחת הפטרי.
בצע פס לבידוד באמצעות צלחת פטרי טרייה המכילה מדיום תרבות, עם המכסה מעט פתוח.
עבור כל חלק של פס הבידוד (3 סה"כ לצלחת), לחטא את לולאת החנק רגע לפני השימוש. כמו כן, לחטא את הלולאה מיד לאחר ביצוע הרצף הסופי על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר עשויים מאוחר יותר להשתמש או לבוא במגע עם לולאות הפיקוח.
מניחים את הצלחות המפוספסות באינקובטור לצמיחה בן לילה.

3. העברות חיידקים: מתרבות מרק לצלחת פטרי

תרחיש שני של העברת חיידקים הוא מתרבות מרק המציגה צמיחה, כפי שנצפו בדרך כלל על ידי עכוז, לצלחת פטרי סטרילית המכילה מדיום צמיחה.
הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את התרבות החיידקית הטהורה, ולהעביר את פתיחת המיכל 2-3x דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
מנמיכים בזהירות את לולאת החנק המעוקרת לתוך הצינור/הבקבוקון, ולחצו בעדינות על צד המיכל כדי להתקרר רגע לפני הכניסה לתרבות המרק.
הסירו לולאה אחת של תרבות המרק(איור 5)והחליפו מיד את המכסה.

איור 5: לולאה אחת של תרבות מרק.
בצע פס לבידוד באמצעות צלחת פטרי טרייה המכילה מדיום תרבות, עם המכסה מעט פתוח.
עבור כל חלק של הרצף (3 סה"כ לצלחת), לחטא את לולאת החנק רגע לפני השימוש. כמו כן, לחטא את הלולאה מיד לאחר ביצוע הרצף הסופי על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר עשויים מאוחר יותר להשתמש לולאות חיטוי.
מניחים את הצלחות המפוספסות לבידוד באינקובטור לצמיחה בן לילה.

4. העברות חיידקים: מצלחת פטרי עם צמיחה לבינוני נוזלי סטרילי

תרחיש שלישי של העברת חיידקים הוא מצלחת פטרי המכילה פס תרבות מבודד לצינור / בקבוקון המכיל מדיום צמיחה נוזלי סטרילי.
פתחו מעט את צלחת הפטרי המכילה את תרבית החיידקים הטהורים, וקררו את לולאת החנק החמה על ידי הקשה עליה בעדינות על משטח אגר.
יש לאחזר מושבה מבודדת אחת מפני השטח של הלוח באמצעות לולאת החנק המקוררת, ולסגור את צלחת הפטרי.
הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את מדיום הצמיחה הנוזלי סטרילי, ולהעביר את פתיחת המיכל 2 עד 3 פעמים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, אל תניח את המכסה על הספסל.
בזהירות להוריד את המושבה המופקת לתוך מדיום מרק נוזלי, בעדינות להסעיר את הלולאה על מנת לשחרר את החיידקים. החליפו מיד את המכסה.
עקר להבה את לולאת החנק על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר מאוחר יותר עשויים להשתמש לולאות חיטוי.
מניחים את הבקבוקון לתוך אינקובטור לצמיחה בן לילה.
הסר את הבקבוקון מדגירה למחרת. בצע סדרת דילול כדי למנות את התרבות.
צלחת הדילולים מהסדרה על מדיה תרבות agarose, ודגורת הצלחות בן לילה.
הסר את הצלחות למחרת, ולהתבונן לכל זיהום.

5. העברות חיידקים: מתרבות מרק למדיום צמיחה נוזלי סטרילי

תרחיש רביעי של העברת חיידקים הוא מתרבות מרק המציגה צמיחה לצינור / בקבוקון המכיל מדיום צמיחה נוזלי סטרילי.
הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את התרבות החיידקית הטהורה, ולהעביר את פתיחת המיכל פעמיים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
בזהירות להוריד את לולאת החנק לתוך הצינור / בקבוקון, ולחץ בעדינות על הצד של המיכל להתקרר רק לפני הכניסה לתרבות המרק.
הסר לולאה אחת של תרבות מרק, ומיד להחליף את הכובע.
הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את מדיום הצמיחה הנוזלי סטרילי, ולהעביר את פתיחת המיכל פעמיים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
בזהירות להוריד את הלולאה המופקת לתוך מדיום מרק נוזלי סטרילי, בעדינות להתסיס את הלולאה על מנת לשחרר את החיידקים. החליפו מיד את המכסה.
עקר את לולאת ההשמדה (איור 6) כדי למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה שעשויים מאוחר יותר להשתמש בלולאות המחסנות.

איור 6: לולאה מחסן שהופכת ללחמה אדומה בזמן שהיא מעוקרת עם מבער בונזן.
מניחים את הבקבוקון לתוך אינקובטור לצמיחה בן לילה.
הסר את הבקבוקון מדגירה למחרת. בצע סדרת דילול כדי למנות את התרבות.
צלחת הדילולים מהסדרה על מדיה תרבות agarose, ודגורת הצלחות בן לילה.
הסר את הצלחות למחרת, ולהתבונן לכל זיהום.