בדיקה למזונות מהונדסים גנטית

1. הפקת דנ"א מדגימות מזון

1. הוסף 500 μL של מטריצת תערובת PCR שנרכשה לכל אחד מ-2 צינורות מכסה הברגים באמצעות צינור העברה או 200-1,000 מיקרופיפט בנפח מתכוונן של 200-1,000 μL. פיפטה למעלה ולמטה עם הצינור בין כל aliquot לערבב באופן שווה את מטריצת PCR.
2. תייג צינור בורג אחד "ללא רכיבים מהונדסים גנטית" והשני "בדיקה".
3. יש לשקול 0.5 גרם של מזון מוסמך ללא רכיבים מהונדסים גנטית ולשים אותו במרגמה.
4. מוסיפים 2.5 מ"ל של מים מזוקקים וטוחנים עם עלה במשך 2 דקות כדי ליצור רפש.
5. מוסיפים עוד 2.5 מ"ל של מים מזוקקים וממשיכים לטחון עם עלה עד שההתרפסות הופכת לחלקה מספיק כדי להזרים.
6. Pipet 50 μL של תרחיף הקרקע לצינור בורג-cap המכיל 500 μL של PREMIX PCR שכותרתו "ללא מהונדס גנטית" באמצעות סימן 50-μL על צינור מדורג. צינור סיכום.
7. חזור על שלבים 1.3-1.6 כדי להכין את דגימת המזון לבדיקה.
8. Pipet 50 μL של מזון מבחן הקרקע slurry לצינור בורג-cap שכותרתו "מבחן". צינור סיכום.
9. מערבולת מזון ללא GMO וצינורות PCR מזון מבחן במשך 1 דקות ומניחים צינורות באמבט מים 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. אם אין מערבולת זמינה, להקפל את הצינור מספר פעמים לערבב לפני הצבה באמבט מים.
10. מניחים צינורות בצנטריפוגה למשך 5 דקות. גלולה מוצקה צריכה להיווצר בתחתית הצינור. אם הכדור אינו נוצר לאחר 5 דקות, צנטריפוגה שוב במשך 2 דקות מרווחים עד שנוצר גלולה.
11. צינורות יכולים לשמש באופן מיידי עבור PCR או מאוחסנים במקרר עד שבוע אחד.

2. הגדרת תגובות PCR

1. מספר צינורות PCR 1-6 וראשי תיבות אותם. המספרים אמורים להתאים לתוכן הצינור הבא המפורט בטבלה 1.
2. מניחים כל צינור PCR מסומן במחזיק microTube עם כובעים פתוחים.
3. באמצעות עצה חדשה עבור כל תוספת, להוסיף 20 μL של פריימר המצוין על טבלה 1 לכל צינור PCR. צינורות כובע.
4. באמצעות קצה טרי עבור כל צינור, להוסיף 20 μL של דגימת ה- DNA המצוין על שולחן 1 לכל צינור PCR, להיות בטוח pipette רק מן supernatant והימנעות גלולה מוצק בתחתית הצינורות.
5. לאחר כל דגימת DNA הוא pipetted לתוך צינור PCR המתאים, להשתמש pipette לערבב DNA פריימר על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה; סיכום צינורות.
6. מקם צינורות PCR ב אופניים תרמי ולתכנת את רוכב האופניים עבור:
   דנטורה ראשונית: מחזור אחד ב 94 °C (70 °F) במשך 2 דקות.
   הגברה: 40 מחזורים ב 94 °C (74 °F) במשך 1 דקות (denature), 59 °C (חישול), ו 72 °C (72 °F) במשך 2 דקות (הארכה).
   הארכה סופית: מחזור אחד ב 72 °C (72 °F) במשך 10 דקות.
   החזקה: 4 °C ללא הגבלת זמן.

3. 3% הכנת ג'ל אגרוז

1. באמצעות מעבדה או סרט מיסוך, יש להדביק בבטחה את הקצוות הפתוחים של מגש הג'ל. ודא שהקלטת אטומה בשולי המגש כדי למנוע אגרוז מותך לדלוף החוצה.
2. לשקול 3 גרם של agarose לתוך בקבוקון 250 מ"ל או גדול יותר ארלנמאייר.
3. הוסף 100 מ"ל של מאגר 1x TAE (נרכש או מוכן מהתרכיז).
4. בעזרת צלחת חמה מגנטית עם מוט ערבוב, מחממים את הכוס עד שאגורז מומס לחלוטין במאגר והפתרון רותח ומתבהר. לחלופין, מיקרוגל יכול לשמש על ידי הצבת בתנור וחימום במשך 30 מרווחים, באמצעות מוט ערבוב לערבב כל 10 שניות, חוזר עד התערובת רותחת ומתבהר.
5. הפוך בקבוק ארלנמאייר 50 מ"ל לתוך הפתיחה של בקבוקון 250 מ"ל לשמש ריפלוקס, מניעת פתרון אגרוז מתאדה.
6. אפשר פתרון אגרוז להתקרר עד 60 °C (60 °F), ויוצקים 30-50 מ"ל לתוך כל מגש ג'ל מודבק.
7. מניחים מסרק ג'ל לתוך זוג החיצנים הראשונים כדי ליצור בארות ג'ל.
8. אפשר ג'ל להתקרר לחלוטין לפני הסרת סרט הדבקה ומסרק. הג'ל יתמצק ויהפוך בהיר לענן כאשר הוא מוכן, כ-10-20 דקות.

4. אלקטרופורזה של מוצרי PCR

1. מניחים ג'ל אגרוז 3% עשוי מראש על מגש ג'ל או משתמשים במגש ג'ל ששימש ליציקת ג'ל אגרוז 3% שנשפך.
2. החלק מגש ג'ל לתוך תא האלקטרופורזה עם בארות הקרובות ביותר לקצה הקתודה (שחור).
3. יוצקים 1x חיץ TAE לתוך התא, מספיק כדי לקבל 2 מ"מ של חוצץ מעל החלק העליון של מגש הג'ל.
4. להשיג צינורות PCR מן רוכב האופניים התרמי ומניחים מחזיק microTube.
5. באמצעות טיפ פיפטה טרי בכל פעם, להוסיף 10 μL של צבע טעינה תפוז G שנרכש (LD) לכל מדגם ומערבבים היטב.
6. טען 20 μl של סרגל המשקל המולקולרי ו 20 μL של כל דגימה לתוך הג'ל בסדר המצוין (טבלה 2).
7. הפעל אלקטרופורזה ג'ל במשך 30 דקות ב 100 V.
8. הסר מגש ג'ל מהתא וג'ל שקופית כדי להסיר מהמגש. מניחים ג'ל במגש כתמים.
9. יש לטבול ג'ל בכתם ג'ל DNA שנרכש במשך 5 דקות, ולנער בזהירות את המגש כדי לעזור להפיץ את הכתם לאורך הג'ל.
10. מעבירים את הג'ל למיכל כביסה ושוטפים במי ברז (40-55 מעלות צלזיוס) למשך כ-10 מעלות.
11. יש להקנות על ידי שטיפת 3x במי ברז חמים למשך 6 דקות כל אחד עם רעידות עדינות לקבלת התוצאות הטובות ביותר. במידת הצורך, יש להמשיך להתיר במים חמים עד להגעה לניגוד הרצוי.

מספר צינור	תחל	דגימת דנ"א
1	20 פריימר צמח μL (ירוק)	20 מיקרול DNA בקרת מזון ללא מהונדס גנטית
2	פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום)	20 מיקרול DNA בקרת מזון ללא מהונדס גנטית
3	20 פריימר צמח μL (ירוק)	20 מיקרול בדיקת DNA מזון
4	פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום)	20 מיקרול בדיקת DNA מזון
5	20 פריימר צמח μL (ירוק)	20 μL GMO שליטה חיובית DNA
6	פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום)	20 μL GMO שליטה חיובית DNA

טבלה 1. רשימה של מספרי הצינור המתאימים, פריימרים, ודגימות DNA.

ובכן 1	מדגם 1 בקרת מזון ללא רכיבים מהונדסים גנטית עם פריימרים צמחיים 20 μL.
ובכן 2	דגימה 2 בקרת מזון ללא מהונדס גנטית עם פריימרים מהונדסים גנטית 20 μL.
ובכן 3	מדגם 3 מזון בדיקה עם פריימרים צמחיים 20 μL.
ובכן 4	מדגם 4 מזון בדיקה עם פריימרים GMO 20 μL.
ובכן 5	דגימת 5 GMO DNA חיובי עם פריימרים צמחיים 20 μL.
ובכן 6	דגימת 6 GMO DNA חיובי עם פריימרים GMO 20 μL.
ובכן 7	סרגל משקל מולקולרי PCR 20 μL.
ובכן 8	תשאירו ריקים.

טבלה 2. הסדר המתאים לטעון 20 μL של סרגל המשקל המולקולרי ו 20 μL של כל דגימה לתוך הג'ל.