הפקת סוניקציה של סמנים ביולוגיים שומנים ממ משקעים

הצעד הראשון בפליאוקלימטולוגיה הוא לאסוף, או לחלץ, את הסמנים הביולוגיים מהמשקעים שבהם הם נמצאים. דגימות סביבתיות מורכבות מרכיבים לא אורגניים, כגון מינרלים, מים ומתכות, ורכיבים אורגניים שנוצרים על ידי אורגניזמים חיים באזור. לפני שמדענים יוכלו להשתמש ברכיבים האורגניים האלה כדי להבהיר מידע על העבר, יש להוציא אותם מסביבתם. סוניקציה, המשתמשת בגלים קוליים, היא הפשוטה והזולה ביותר מבין הטכניקות הללו.

סרטון זה הוא חלק מסדרה על מיצוי שומנים, טיהור וניתוח ממשקעים. זה ימחיש מיצוי שומנים על ידי אולטרסאונד ויציג כמה יישומים של השיטה.

בגלל המגוון הרחב של סמנים ביולוגיים, אין ממס אחד המותאם למיצוי כולם. זה מסוכם על ידי הכלל שנקרא 'דומה מתמוסס כמו', לפיו מולקולות אפולריות יחסית מתמוססות בממיסים אפולאריים כמו דיכלורו-מתאן, ומולקולות קוטביות נוספות מתמוססות בממיסים קוטביים יותר כמו מתנול. תערובות ממס למיצוי שומנים ספציפיים או קבוצות שומנים מותאמות בדרך כלל באופן אמפירי.

כדי להאיץ את המיצוי ולהגדיל את התשואה, משתמשים במערכת סוניקציה ליישום אולטרסאונד - גלים בתדרים הגדולים מ -20 קילו-הרץ, בשילוב עם תערובת הממס. כאשר גלים אלה יוצרים קשר עם השלב האורגני הנוזלי, הם גורמים להיווצרות מיקרו-בועות קצרות מועד של אדי ממס הגדלים ומתמוטטים במהירות. בעת קריסה, בועות אלו משחררות כמות עצומה של אנרגיה כגזירה מכנית, מה שמקל על המסת שומנים ומגדיל באופן דרמטי את יעילות המיצוי.

לאחר תהליך מיצוי הממס בסיוע אולטרסאונד, התוצאה היא תכשיר תמצית גולמית, הנקרא תמצית שומנים כוללת, הנתון לטיהור נוסף כדי לאפשר בדיקה איכותית וכמותית של חתימות השומנים. כעת, לאחר שהבנתם כמה מהעקרונות העיקריים מאחורי מיצוי שומנים על ידי סוניקציה, בואו נסתכל על פרוטוקול לאופן ביצוע ההליך.

אסוף את חומרי הדגימה הדרושים ממיקום נבחר. כמה דוגמאות הן לקוסטרין ומשקעים ימיים, קרקעות יבשתיות, תרביות מיקרוביאליות או עלי צמחים. חומר שנאסף קפוא למשך הלילה. לאחר מכן הוא מיובש בהקפאה במייבש הקפאה למשך יומיים עד שלושה. מרסקים והומוגניזציה של הדגימות המיובשות בהקפאה לפני המיצוי בעזרת מכתש ועלי שטוף בממס. כדי להסיר מזהמים אורגניים, יש לשרוף את פיפטות הזכוכית הבורוסיליקט הנדרשות, בקבוקונים ופחיות שקילה בתנור. לאחר שאפשרו לכלי הזכוכית להתקרר בתנור, שטפו את כלי המתכת בתערובת של דיכלורומתאן ומתנול. לאחר הכנת הדגימה וכלי הזכוכית, הליך הסוניקציה יכול להתחיל.

משלב זה ואילך, יש לשרוף את כל המכולות וכלי הזכוכית לפני השימוש. מניחים את פח השקילה על משקל וטרה. שטפו את מרית המעבדה בתערובת הממס, ולאחר מכן, השתמשו בה כדי להעביר מסה מתאימה של דגימה הומוגנית מיובשת בהקפאה לתוך פח השקילה ורשמו את המסה. העבירו בזהירות את הדגימה השוקלת לבקבוקון מסומן. בעזרת בקבוק השפריץ של DCM:MeOH, הוסף מספיק כדי שהדגימה תהיה מכוסה ב-1 עד 2 ס"מ של ממס, וכסה את הבקבוקון. הנח את הבקבוקון על מתלה עמיד למים, מוכן כעת לסוניקציה. הנח את המתלה ישירות לתוך אמבט הסוניקציה. בדוק שמפלס המים באמבט הסוניקציה עמוק מספיק כדי להטביע את בקבוקוני הדגימה עד לחלק העליון של ממס המיצוי. סוניקציה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סוניקציה, הסר את המתלה מהסוניקטור. הניחו לבקבוקונים לשבת כדי לאפשר למשקעים להתרחש.

הסר את השלב העליון של דיכלורומתאן-מתנול מבקבוקון המיצוי באמצעות פיפטה ונורה, והעביר לבקבוקון אחר שנשקל מראש ומסומן. חזור על תהליך הסוניקציה בסך הכל שלוש פעמים עבור כל דגימה. אוספים את התמציות לבקבוקון אחד. אפשר לדגימות שחולצו להתייבש בבקבוקונים שלהן, מכסים ובמכסה המנוע, מכוסה באופן רופף בחתיכת נייר כסף. סמן כ'שאריות מיצוי' ואחסן בממס המיצוי. כעת, לאחר שהסמנים הביולוגיים חולצו, יש לטהר אותם לפני שניתן יהיה לבצע ניתוח.

סוניקציה מאיצה מספר תהליכי מיצוי ממס ונמצאת בשימוש נרחב במחקרים גיאוכימיים. ארכיאולוגים רבים עובדים עם גיאוכימאים על מנת לשחזר את הנסיבות הסביבתיות והתרבותיות שבהן חיו הציוויליזציות האנושיות המוקדמות. כלי חרס, אחת ההמצאות האנושיות העתיקות ביותר, כאשר נחשפו, ניתן למצוא מאובנים מולקולריים שיוריים מיין, אורז או תוכן אחר שאוחסנו בעבר בפנים.

כדי לחשוף עדויות כימיות לחומרים הנספגים על פני השטח, דגימות קטנות של כלי חרס עוברות סוניקציה בנוכחות ממיסים אורגניים וניתן לזהות לאחר מכן תרכובות שהופקו במורד הזרם בשיטות ספקטרוסקופיות. ניתוח מסוג זה מסייע לארכיאולוגים לזהות את סוגי המשאבים שהיו זמינים לאוכלוסיות קדומות ולשחזר את תנאי בית הגידול שלהם.

מיקרו-אצות פוטוסינתטיות נמצאות במערכות אקולוגיות ימיות ומים מתוקים. מכיוון שהם גדלים במדיה מבוססת מי ים והתרבות שלהם תופסת שטחים קטנים משמעותית, הם נחקרים כעת באופן נרחב כחלופה מבטיחה לצמחים יבשתיים לייצור דלקים ביולוגיים.

כדי לחלץ שומנים מביומסה של מיקרו-אצות, חוקרים אלה מתארים מיצוי ממס בסיוע סוניקציה. קוויטציה אקוסטית במהלך סוניקציה משבשת ביעילות את דפנות תאי האצות המיקרו-אצות הנוקשות על מנת לשחרר שומנים. טכניקות כאלה מסייעות באפיון של מיקרו-אצות חדשות מהסביבה לייצור מקורות אנרגיה שאינם נפט.

זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE למיצוי בעזרת סוניקציה של סמנים ביולוגיים ממשקעים. הסרטונים הבאים יסבירו כיצד מטוהרים עוד יותר את התמצית לניתוח.

תודה שצפית!