כתמי גרם של חיידקים ממקורות סביבתיים

1. איסוף דוגמאות

1. לאסוף דגימת קרקע ולהעביר למעבדה לניתוח מיקרוביאלי.
2. במעבדה, לשקול מדגם 10 גרם באמצעות איזון אנליטי.
3. לדלל את המדגם 1:10 לתוך 95 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (10 חלקים הקרקע שווה ערך 5 חלקים נוזל מימי), מערבולת לערבב(איור 2,שלב 1).
4. בצע דילולים הבאים של 1:10 עד לפחות^10-5 גרם אדמה למ"ל, ודילול נבחר של צלחת התפשטות בשכפולים של שניים או שלושה על מדיום אגר מיזיני נמוך(למשל,R2A)(איור 2,שלבים 2-3).
5. לדגור על הצלחות במשך שבוע בטמפרטורת החדר(איור 2,שלב 4).
6. בחרו מושבה אחת או שתיים לבידוד, והישארו על לוחות אגר טריים(איור 3,שלבים 1-3).
7. לדגור על לוחות הפס במשך יומיים-שלושה בטמפרטורת החדר(איור 3,שלב 4).

2. הכנת מריחות חיידקיות

1. שימו לב ללוחות הרצף למושבות מבודדות.
2. כדי להכין כל הכנה להכתמה, טובלים לולאה מחוקנת באתנול, מעקרים להבה ומניחים 1 עד 2 לולאות של מים מזוקקים סטריליים על מרכז מגלשות זכוכית שניקו מראש.
3. לחטא את לולאת החנק שוב כפי שתואר בעבר. לאחר התקררות, להסיר כמות קטנה של תרבות ממושבה מבודדת אחת ולערבב אותו עם טיפות מים על המגלשה (הכתם צריך להיות דומה חלב דל שומן מדולל). יש לקרר את לולאת החנק לפני בידוד המושבה. לולאה חמה מדי תגרום למושבה ו/או לבינונית להתיז, מה שעלול להוביל לתרסיס של חיידקים. בדרך כלל, כאשר הלולאה חמה מדי לשימוש, צליל "שורט" יישמע כאשר הוא מוחל על אגר או מושבה. קירור לא תקין של הלולאה עלול גם לגרום להעברת תרבות לשקופית יעילה פחות, ועיוות של מורפולוגיה של תאים.
4. מורחים את הכתם על פני השטח של השקופית בגודל של כ-2.5 ס"מ על 2.5 ס"מ, ומאפשרים לו להתייבש באוויר. חשוב שייבוש אוויר יתרחש בתנאי זרימה למינאריים. אין לפוצץ שקופיות כדי לא לשבש את ההכפשה. כמו כן, שקופיות לא חייב להיות מיובש להבה, על מנת לשמור על מורפולוגיה התא.
5. לאחר הייבוש, חום לתקן את הכתם על ידי העברת השקופית במהירות דרך להבה 2-3x. אין להחזיק את השקופית נייחת בלהבה, כדי למנוע עיוות של מורפולוגיה של תאים ו/או נזק למגלשת הזכוכית.

3. כתמי גרם

1. אבטחו את השקופית בקצה אחד באמצעות סיכת כביסה נקייה.
2. מכסים את הכתם עם סגול קריסטל (כתם ראשוני) ומחזיקים במשך 2 עד 3 דקות.
3. לשטוף בזהירות את המגלשה עם מים מזוקקים. אין לכוון את זרם המים אל הכתם על מנת למנוע נזק ו/או ניתוק ממגלית הזכוכית.
4. מכסים את הכתם ביוד של גרם ומחזיקים במשך 2 דקות, ואז שוטפים בעדינות את המגלשה במים.
5. Decolorize את הכתם באמצעות 95% אתנול עד כתם כבר לא שוטף מן השקופית (זה בדרך כלל לוקח לא יותר מ 20 s בהתאם לעובי של כתם), ולאחר מכן מיד לשטוף עם מים מזוקקים. שלב זה הוא קריטי כדי למנוע צביעה יתר של השקופית, אשר עלול להוביל ייעוד כתם גרם כוזב (כלומר, משתנה גרם).
6. מוסיפים את הכתם הנגדי (ספרנין) להכפשה ומחזיקים במשך 30 s. לאחר מכן יש לשטוף בעדינות את המגלשה במים מזוקקים ולייבש כתם באמצעות נייר סופג.

4. התבוננות מיקרוסקופית בשקופיות

1. שים לב לשקופיות באמצעות מטרות נמוכות(למשל,פי 4 או פי 10), יבשות גבוהות(למשל,פי 40) וטבילת שמן (פי 100X). לטבילת שמן, מוסיפים את השמן ישירות למרוחה.
2. לקבלת תוצאות מייצגות של חיידקי קרקע גראם-חיוביים וגרם שליליים, ראו איורים 4 ו-5 .

איור 2. טכניקת דילול וכתיבת ציפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. בידוד המושבה באמצעות טכניקת לוח הרצף.

איור 4. חיידק קרקע גראם חיובי סטפילוקוקוס אאורוס.

איור 5. חיידק אדמה גרם שלילי Escherichia coli.