הפקת סמנים ביולוגיים משקעים - מיצוי ממס מואץ
מקור: המעבדה של ג'ף סלקופ - אוניברסיטת מסצ'וסטס אמהרסט
ההפצה של קבוצה של סמנים ביולוגיים אורגניים הנקראים גליצריל-דיאלקל גליצרול-טטראת'רס (GDGTs), המי…
1. איסוף החומרים הדרושים
- לחלץ דגימות. דגימות (במקרה זה, משקעים) קפואים, מיובשים בהקפאה, מרוסקים והומוגניים לפני החילוץ, ומופקים בקבוצות כדי למקסם את היעילות.
- בהתאם לגודל המדגם, השתמש בבקבוקוני אוסף עם נפחים של 40 או 60 מ"ל. לניסוי זה, בקבוקוני זכוכית בורוסיליקט (40 מ"ל) וכובעים בטוחים ממס משמשים. בקבוקוני Combust, פיפטות זכוכית בורוסיליקט, ופחיות שקילה ב 550 °C (6 שעות לפני להבטיח הסרה של מזהמים אורגניים אפשריים.
- דיכלורומטן (DCM) ומתנול נפוצים ברוב מעבדות הגיאוכימיה האורגנית. השתמש בהם בנפרד, (מתנול הראשון, ואחריו DCM) לשטוף כלי מעבדה וכלי זכוכית לפני השימוש. תערובת של דיכלורומתאן למתנול (MeOH; 9:1) משמשת במעבדות רבות לחילוץ יעיל של סמנים ביולוגיים עם מגוון רחב של קוטביות. ממיסים צריכים להיות נקיים ממזהמים אורגניים.
- להשיג מחלץ ממס מואץ לשימוש לניסוי זה.
2. הכנת תאים לדוגמה
- להרכיב תא לדוגמה עבור כל דגימה שיש לחלץ, בתוספת ריק אחד.
- עבור כל תא, בורג מכסה קצה בקצה אחד של גוף התא.
- מניחים מסנן סיבי זכוכית בעירה על גבי כל תא באמצעות פינצטה שטופה בממס. לאחר מכן, לחץ בעדינות ובאיטיות את המסנן למטה לתוך התא באמצעות בוכנה המסנן.
- תייג את גופי התא לפי מספר (לדוגמה 1 - 22) עבור כל דגימה וכתוב "ריק" בתא הריק.
- מלאו את החסר באדמה הצורנית (או בחול) וכובע עם מכסה קצה שני. להדק ביד.
3. הכנת דוגמאות
- מניחים פח שקילה בעירה על סולם המעבדה ואז טרה.
- לשטוף את מרית המעבדה עם ממס, ולאחר מכן להשתמש בו כדי להעביר מסה מתאימה של מדגם לתוך פח שקילה, ולתעד את המסה.
- המסה של המדגם משתנה בהתאם לתוכן החומר האורגני שלה. חומר אורגני יחסית חומר רזה (בוץ ימי) עשוי לדרוש מספר גרם, בעוד חומר אורגני עשיר (רקמת עלה) עשוי לדרוש הרבה פחות.
- מעבירים את כל החומר בפח השקילה לתא ASE מוכן.
- מניחים מסנן סיבי זכוכית נוסף על החלק העליון של התא, ולאחר מכן לחץ לאט ובעדינות כלפי מטה עד שהוא מגיע לחלק העליון של המדגם באמצעות בוכנה המסנן.
- הוסף אדמה הצורנית (או חול) לתא עד שהוא כמעט מלא. היזהר להסיר את כל הפסולת מחוטים גוף התא.
- כיפה החלק העליון של התא עם מכסה קצה אחר.
- חזור על שלבים 3.1 - 3.6 עבור כל דגימה.
4. הכנת בקבוקוני אוסף
- סמן כל תקנה במספר של תא מתאים(למשל 1 - 22 או ריק) וכובע עם מכסה ביקציית אוסף ASE.
5. חילוץ
- מקם כל תא לדוגמה בחריץ ממוספר על מגש ASE העליון.
- מקם את בינתון האוסף המתאים באותו חריץ מספר במגש ASE התחתון.
- צור את שיטת החילוץ באמצעות לוח המקשים ב- ASE. לחלץ ב 100 °C (70 °F) ו 1,200 פסאיי. לחלץ כל מדגם 3x עם אחיזה סטטית של 10 דקות לשטוף את גוף התא עם 50% של הנפח הכולל שלה בין החזקות סטטיות.
- ודא בקבוק ממס מכיל מספיק ממס כדי לחלץ את כל הדגימות.
- יש לשטוף את ASE 3x לפני תחילת הריצה על-ידי לחיצה על כפתור השטיפה בלוח הבקרה של ASE.
- לחץ על התחל.
מיצוי ממס מואץ הוא טכניקה מהירה, יעילה ובעלת תפוקה גבוהה המשמשת להפרדת סמנים ביולוגיים אורגניים ממספר רב של דגימות משקעים גיאולוגיים.
באופן מסורתי, נעשה שימוש בשיטות מיצוי כגון סוניקציה או Soxhlet, עם זאת, החיסרון בפרוטוקולים אלה הוא שהם איטיים מכדי לעבד מספיק חומר לשחזור פליאו-אקלימי מפורט. טכניקה חדשה יותר, מיצוי ממס מואץ, או שיטת ASE, פותחה מתוך מחשבה על יעילות ותפוקה גבוהה.
שיטת ASE משתמשת בשילוב של טמפרטורות גבוהות ולחץ גבוה כדי לחלץ דגימות ויכולה לבצע מספר דגימות בריצת הכנה אחת ומהירה יחסית.
סרטון זה הוא השלישי בסדרה המפרטת כיצד לחלץ סמנים ביולוגיים ממשקעים. זה יכסה את ההליך ויספק תובנה לגבי היתרונות של ASE על פני סוניקציה או מיצוי סוקסלט.
במיצוי ממס מואץ, דגימות נטענות לתאי פלדה שנטענים לאחר מכן על קרוסלה. בקבוקוני איסוף עבור כל תא דגימה נטענים גם על קרוסלה נפרדת. המכשיר טוען תא דגימה לתנור פנימי. ממס נשאב מבקבוק ממס דרך סדרת שסתומים עד שמגיעים ללחץ מספיק.
לחץ זה מוחזק למשך פרק זמן המוכתב על ידי הדגימה והאנליט. לאחר מכן, הממס נשטף מתא הדגימה דרך קו פלדה לתוך בקבוקון האיסוף המתאים. ניתן לחזור על התהליך מספר פעמים. ניתן להתאים את הטמפרטורה, הלחץ ומשך הזמן עבור המדגם.
הטמפרטורה הגבוהה בשימוש מגבירה את הקינטיקה של המיצוי בעוד שהלחץ הגבוה מונע מהממס להתנדף. בקבוקון האיסוף מכיל כעת תמצית שומנים כוללת, ומה שנשאר בתא הדגימה נקרא שאריות. הוא מורכב מחומר לא אורגני כמו גם חומר אורגני שאינו ניתן למיצוי ממסים, הנקרא קרוגן.
כעת, לאחר שאנו מכירים את העקרונות מאחורי מיצוי ממס מואץ, בואו נסתכל כיצד זה מתבצע במעבדה.
לאחר איסוף דגימות מעניינות; ייבוש בהקפאה, הומוגניזציה וטיהור כפי שמודגם בסרטון אחר בסדרה זו.
לאחר הכנת כל הדגימות, הרכיבו תא לכל אחת מהן לחילוץ, ואחד נוסף לריק. לשם כך, הברג מכסה קצה על גוף התא. בעזרת פינצטה שטופת ממס, הניחו פילטר סיבי זכוכית בוערים על גבי כל אחד מהם. לאט ובעדינות לחץ על המסנן כלפי מטה?עם הבוכנה.
סמן את גופי התאים לפי מספר עבור כל דגימה, ותייג את הריק בנפרד.? הניחו פח שקילה בוער על משקל מעבדה וטרה. שוטפים מרית עם ממס, ואז השתמשו בה כדי להעביר 5 עד 10 גרם דגימה לתבנית השקילה, ורשמו את המסה.
העבירו את כל החומר בפח השקילה לתא המתאים לו. מניחים מסנן סיבי זכוכית נוסף מעל, ומהדקים בעדינות עד שהוא מגיע לחלק העליון של הדגימה.
הוסף חומר מפזר, כגון אדמה דיאטומית או חול, עד שהוא כמעט מלא, והקפיד להימנע מהכנסת פסולת לחוטי גוף התא. כסו את החלק העליון של התא במכסה קצה נוסף. חזור על שלבים אלה עבור כל דוגמה והריק.
סמן כל בקבוקון איסוף עם המספר של תא דגימה מתאים או ריק, וכובע עם מכסה בקבוקון. הנח כל תא בחריץ ממוספר במגש ה-ASE העליון. הגדר את הפרמטרים לשיטת החילוץ באמצעות לוח המקשים ב-ASE כדי לחלץ ב-100 ? C?ו-1,200 psi. חלץ כל דגימה 3 פעמים עם אחיזה סטטית של 10 דקות ושטוף את גוף התא ב-50% מהנפח הכולל שלו בין אחיזות סטטיות.
לאחר מכן, ודא שבקבוק הממס מכיל מספיק כדי לחלץ את כל הדגימות. שטפו את קווי המכשירים?3 פעמים לפני תחילת הריצה. לבסוף, לחץ על התחל.
הסר את הבקבוקון מה-ASE. כעת, לאחר מיצוי הסמנים הביולוגיים, יש לטהר אותם לפני הניתוח.
מיצוי ממס מואץ הוא טכניקה רב-תכליתית, שניתן להשתמש בה למגוון יישומים, שחלקם נחקרים כאן.
ניתן להשתמש במיצוי ממס מואץ גם על סוגים אחרים של דגימה, כולל מזון. ניתוח שאריות לבדיקת זיהום חומרי הדברה מתבצע לעתים קרובות במתקנים רגולטוריים ותעשייתיים כדי לוודא את בטיחותם ואיכותם של מוצרי מזון כמו פירות או ירקות. ניתן להשתמש ב-ASE כדי לחלץ חומרי הדברה אורגנו-כלוריים מדגימות מזון, ולקבוע את סוגי או רמות השאריות הקיימות בתוצרת. לאחר מכן ניתן להשתמש במידע זה כדי לקבוע אם התוצרת ראויה למאכל אדם או בעלי חיים. לדוגמה, יש למצוא דילדרין בטווח של 0 עד 0.1 חלקים למיליון במזון, תלוי במוצר.
ניתן לחלץ רכיבים תזונתיים של מזון גם באמצעות ASE. לדוגמה, ניתן לחלץ מוצרים כמו שוקולד, שעשויים להיות בעלי תכולת שומן גרבימטרית גבוהה. באמצעות ASE עם אתר נפט כממס, ניתן להפריד שומן מדגימות שוקולד ולעבור ניתוח כמותי כדי לקבוע אחוז שומן מדויק לכמות ידועה של שוקולד. באמצעות מידע זה, גופים רגולטוריים יכולים לאמת טענות של יצרני שוקולד, או יצרנים יכולים לקבל מידע ליצירת תוויות מזון מדויקות.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE למיצוי סמנים ביולוגיים של שומנים באמצעות מיצוי ממס מואץ, או ASE. שיטות להמשך עיבוד וניתוח ניתן למצוא בסרטונים הבאים.
תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.