$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
מדידת קצב הגידול של חיידקים היא טכניקה מיקרוביולוגית בסיסית, ויש לה שימוש נרחב במחקר בסיסי כמו גם ביישומים חקלאיים ותעשייתיים.
חיידקים הם בין צורות החיים הנפוצות ביותר על פני כדור הארץ, והם נוכחים בכל מערכת אקולוגית, כולל גוף האדם. מיני חיידקים מסוימים הם גם בעלי יכולת גנטית גבוהה, ונרתמו כמודלים מחקריים או לייצור מוצרים טבעיים או סינתטיים בקנה מידה תעשייתי. אולם לא כל מיני החיידקים ניתנים לתרבית במעבדה. למי שיכול, מאפיין חשוב הוא קצב הכפל, או "קינטיקה של צמיחה".
מדידת קצב הגדילה של תרבית חיידקים יכולה ליידע מדענים על התפקודים הפיזיולוגיים והמטבוליים שלהם, והיא גם שימושית להשגת מספר תאים מדויק של החיידקים ליישומים במורד הזרם.
סרטון זה יציג את העקרונות מאחורי ניתוח קצב גידול חיידקים, ידגים פרוטוקול לאפיון קצב הגדילה עם "עקומת גדילה", ולבסוף, יחקור מספר יישומים במדעי הסביבה למדידת קינטיקה של גדילת חיידקים.
חיידקים בדרך כלל מתרבים בצורה א-מינית, ומתרבים על ידי ביקוע בינארי פשוט שבו תא הורה אחד מתחלק לשני תאי בת זהים. בתנאי גידול נוחים שבהם חומרי הזנה זמינים בשפע ופרמטרים סביבתיים כמו טמפרטורה תורמים כולם לצמיחה, קצב ההתרבות עולה בהרבה על שיעור התמותה. התוצאה היא צמיחה אקספוננציאלית.
על ידי מדידת כמות החיידקים בתרבית כפונקציה של זמן, ניתן לקבל עקומת גדילה. גידול חיידקים בתרבית נוזלית בתנאים אופטימליים מייצר עקומת גידול בעלת צורה אופיינית הניתנת לחלוקה לשלבים שונים. העקומה מתחילה ב"שלב השהיה", כאשר הצמיחה איטית בזמן שהחיידקים מתאקלמים לתנאי התרבית. הבא הוא ה"לוג" או "השלב האקספוננציאלי", כאשר החיידקים חווים צמיחה אקספוננציאלית. הצמיחה נעצרת בסופו של דבר ברגע שחומרי המזון מתרוקנים ומצטברים מוצרי פסולת, וכתוצאה מכך נוצר "שלב נייח". לבסוף, ברגע שקצב ההכפלה עוקף את קצב המוות של התאים, התרבית נכנסת ל"שלב המוות".
כדי לבנות עקומת גידול, מספרי חיידקים בבקבוק של תרבית נוזלית נספרים בנקודות זמן שונות לאורך תקופה מסוימת של תרבית. ניתן להשיג ספירת חיידקים במספר שיטות שונות. גישה נפוצה אחת היא למדוד צפיפות אופטית - או "OD" - 600, שהיא ספיגת האור של תמיסת החיידקים באורך גל של 600 ננומטר.
שיטה נוספת היא לקבוע את ה-"CFU", או יחידות יצירת המושבה, למיליליטר של התרבית. בשל האופי המשובט של גידול חיידקים, חיידק אחד בתרבית יכול באופן תיאורטי להתרחב למושבה אחת הניתנת לצפייה על צלחת אגר. על ידי ציפוי סדרה של דילולים של תרבית חיידקים כדי להגיע לריכוז חיידקים שבו ניתן לצפות במושבות בודדות ובדידות, שיטה הנקראת "ציפוי דילול סדרתי", ניתן להשתמש בספירת המושבות כדי לחשב לאחור את ריכוז החיידקים במונחים של CFU למ"ל.
כעת, לאחר שהבנתם כיצד ניתן לנתח צמיחת חיידקים, בואו נעבור על פרוטוקול לביצוע ניתוח עקומת גדילה על תרביות טהורות של מודל חיידקי מבוסס היטב, Escherichia coli, בשיטת ציפוי דילול סדרתי.
יום אחד לפני איסוף נקודת הזמן, חסנו 20 מ"ל של מרק סויה טריפטיקאז מעוקר מראש, או TSB, בינוני בבקבוק של 50 מ"ל עם מושבה אחת של E. coli.
לדגור על התרבות בן לילה בגיל 37? C עם טלטול. עבור E. coli, זה יביא לאוכלוסיית פאזה נייחת של כ-109 CFU/mL.
למחרת, לחסן 100? L של תרבית הלילה ל -250 מ"ל TSB בבקבוק של 500 מ"ל. מערבבים היטב. זה מייצר תרבית מדוללת של כ-4 x 105 CFU/mL. אחסן 5 מ"ל מהתרבית המדוללת הזו בצינור תרבית. זהו ה-aliquot מנקודת זמן 0, או T0. מקררים מיד ב-4 ?C.
מדגרים את הנפח הנותר של התרבית ב-37 ? C עם טלטול. בכל שעה לאחר מכן עד 8 שעות, אספו 5 מ"ל מהתרבית. ייעד את הדוגמאות הללו T1 עד T8, ואחסן את כולן ב-4? C עד השימוש.
ביום הניסוי, הוציאו את נקודות הזמן של E. coli מהמקרר ושמרו אותם על קרח. השתמש בצינורות מיקרופוגה סטריליים, כל אחד עם 900? L של מי מלח סטריליים, כדי להגדיר סדרת דילול עבור כל אליקוט לפי הטבלה הבאה.
מערבבים היטב את תרבית T0 על ידי מערבולת עדינה, ואז מוסיפים 100 ? L לצינור A מסדרת הדילול שלו, מה שיוצר דילול של 1 ל-10, או 10-1. מערבולת צינור A לערבוב, ובעזרת קצה פיפטה טרי, הוסף 100 ? L של צינור A לצינור B, מה שהופך את הדילול של 1 ל-100, או 10-2.
חזור על התהליך עבור כל תרבית ובצע את סדרת הדילול המתאימה לפי טבלה 2. לאחר ביצוע סדרת הדילול עבור כל דגימות נקודת הזמן, הכינו את המספר המתאים של צלחות אגר סויה טריפטיקאז סטריליות לציפוי חיידקים.
3 דילולים של כל תרבית נקודת זמן יהיו מצופים בשלוש עותקים לפי הטבלה הבאה. סמן את הצלחות בהתאם. ואז, פיפטה 100? L של כל תרבית מדוללת כראוי על מרכז צלחת האגר המתאימה. יש לעקר מוט זכוכית בצורת "L", לקרר על ידי נגיעה במוט באגר הרחק מהחיסון, ולפזר מיד את הנוזל על פני האגר. שימו לב שעיכוב בהתפשטות עלול לגרום לצמיחת יתר של חיידקים במקום החיסון.
המשך לצפות כל סדרת דילול עבור כל 9 תרביות נקודות הזמן, תוך עיקור להבה של מוט פיזור הזכוכית בין כל סדרת דילול.
לאחר שנותנים לצלחות להתייבש במשך מספר דקות, הופכים ומניחים אותן ב -37 ? C אינקובטור לילה. לאחר תקופת גידול זו, ניתן לאחסן צלחות בטמפרטורה של 4 ?C.
לאחר דגירה של לילה של לוחות הדילול, בדוק אותם לזיהום ואחידות של מושבות. עבור כל תרבית נקודת זמן, בחר דילול שעבורו יש בין 30-300 מושבות לצלחת. ספרו את מספר המושבות בכל אחת מהלוחות המשולשים לדילול זה.
באמצעות מספר המושבות הממוצע לכל דילול ומקדם הדילול, חשב את ריכוז החיידקים בתרבית המקורית בכל נקודת זמן ב-CFU/mL. לדוגמה, אם יש בממוצע 30 מושבות מקבוצת הלוחות המשולשים המתקבלות מ-0.1 מ"ל של דילול 10-4, או 1 ל-10,000, אז יהיו 30 חלקי 0.1 מ"ל כפול 10,000, או 3 מיליון CFU/מ"ל.
באמצעות ריכוז החיידקים המחושב עבור כל נקודת זמן, שרטטו גרף של לוג בסיס 10 של ריכוזי החיידקים, ב-CFU/mL, כנגד זמן בשעות. מהגרף, זהה את שלב הלוג של הגידול של תרבית החיידקים המקורית ובחר שתיים מנקודות הזמן בשלב הלוג, וציין את הראשונה מבין נקודות הזמן הללו כ-t = 0. חשב את זמן הדור הממוצע באמצעות המשוואה X שווה ל-2 בחזקת n כפול X0 כאשר X הוא ריכוז החיידקים בזמן t, X0 הוא הריכוז ההתחלתי ב-t = 0, ו-n הוא מספר הדורות שחלפו בין שתי נקודות הזמן.
לדוגמה, נניח ש-X0 הוא 1,000 CFU/mL, וב-t = 6 שעות, הריכוז הוא 16,000 CFU/mL. באמצעות המשוואה, אנו מקבלים ש-4 דורות התרחשו תוך 6 שעות, מה שנותן זמן דור של 6 חלקי 4 או 1.5 שעות לדור.
מדידת קינטיקה של גידול חיידקים היא בסיסית ליישומים רבים למטרות מחקר, חקלאות או ביו-הנדסה.
שימוש אחד לידיעת קצב גידול החיידקים הוא לאפשר קבלת כמות מדויקת של תרבית חיידקים כדי לחסן תרבית או מדיום אחר. לדוגמה, יש לגדל גידולים מסוימים, כגון קטניות, עם חיידקים סימביוטיים המכונים ריזוביה המתיישבים בשורשי הצמחים ליצירת גושים ו"מקבעים" חנקן - המרת חנקן אטמוספרי לאמוניה שיכולה לשמש את הצמח. עבור יישומים חקלאיים, כמות ידועה של ריזוביה מתווספת למדיום פחמן מבוסס כבול, המשמש לאחר מכן לחיסון זרעי קטניות כדי לבסס את הסימביוזה בין הצמח לחיידקים.
ניתוח צמיחה יכול לשמש גם לזיהוי מיני חיידקים שיכולים לפגוע בפסולת תעשייתית ואולי לייצר תוצרי לוואי יקרי ערך. בדוגמה זו, חוקרים חקרו כיצד אמצעי גידול בתוספת ליקר שחור, תוצר פסולת מעיסת עץ וייצור נייר, השפיעו על הצמיחה של מבודד מיקרוביאלי סביבתי.
החיידקים לא רק הראו צמיחה מוגברת עם משקאות שחורים, אלא גם הראו דפוס גדילה "דיפאזי", המעיד על נוכחות של יותר ממקור פחמן אחד במשקאות שחורים שהחיידקים יכולים לעכל אותם. לאחר מכן ניתן היה לחלץ רכיבים בודדים של משקה שחור לניתוח גידול מפורט יותר.
לבסוף, מדידות קצב גידול שימושיות גם לאפיון חיידקים שהונדסו למטרות תעשייתיות מסוימות, למשל, לתיקון זיהום נפט. כאן, מדענים יצרו זני חיידקים מהונדסים גנטית המכילים אנזימים לפירוק מרכיבי הפחמימנים של הנפט. ניתוח גדילה בוצע, למשל, כדי לוודא שהחיידקים המהונדסים הגדילו את קצב הגדילה מאשר חיידקים רגילים בנוכחות הפחמימנים הרעילים, מה שמעיד על סבילות משופרת שתאפשר לחיידקים המהונדסים לבצע את תפקיד ניקוי הזיהום שלהם.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על ניתוח שיעורי גידול חיידקים עם עקומות גדילה. כעת עליך להבין את שלבי הגידול השונים של תרביות חיידקים, כיצד לבצע ניסוי להשגת עקומת גדילה באמצעות איסוף נקודות זמן וציפוי דילול סדרתי, וכיצד ניתן ליישם ניתוח גדילה למטרות מחקר ותעשייתיות. כמו תמיד, תודה שצפית!
