ניתוח עקומת גדילה חיידקית והיישומים הסביבתיים שלה

1. אוסף עליקוטים של תרבות חיידקים

1. יום אחד לפני איסוף נקודות זמן הצמיחה, לחסן 20 מ"ל של ציר סויה טריפטיאז (TSB) בינוני בבקבוקון 50 מ"ל עם E. coli.
2. דגירה לילה ב 27 °C (5 °F). תקופת דגירה ארוכה יחסית זו גורמת לאוכלוסיית שלב נייחת מסוג בר E. coli של כ 10⁹ CFU / mL.
3. למחרת, להשתמש 100 μL של התרבות המוכנה כדי לחסן 250 מ"ל של TSB (בבקבוק 500 מ"ל). מערבבים היטב.  הסר aliquot 5-mL ומקרר מיד ב 4 °C (5 °F). זוהי נקודת זמן T = 0 או T_0, ועליה להכיל כ- 4 x 10⁵ CFU/mL.
4. מניחים את הבקבוקון של E. coli הנותר (245 מ"ל) באינקובטור רועד של 37 מעלות צלזיוס. הסר aliquots 5-mL של תרבות כל שעה, עד 8 שעות. יש לאחסן כל עליקוט ב-4 °C (70 °F). ייעדו את עליקוטים אלה T₁ עד T₈.

2. דילול סדרתי

1. מוציאים עליקוטים של אי קולי מהמקרר ומניחים על קרח להובלה. שמור את כל התרבויות על קרח עד השימוש.
2. הקימו סדרה של צינורות דילול כדי להשיג דילולים שונים של כל תרבות אי-קולי (איור 3). צינורות מיקרופוגה נוחים לתפקוד זה. כל צינור דילול צריך להיות 900 μL של נוזל דילול (מלוחים סטריליים). סדרת דילול נדרשת עבור כל תרבות E. coli (T₀ עד T₈); תווית כל צינור לפי טבלה 2.
   
   איור 3. סכמטי המציג את ההליך ל ציפוי E. coli.
3. התחל דילול על ידי הוספת 100 μL של E. coli מן הצינור שכותרתו T₀ (התרבות הראשונית E. coli) לצינור A, שהוא דילול 10^-1 של T₀. מערבולת הצינור עבור 5s.
4. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של Tube A לצינור הבא של תמיסת מלח, Tube B, שהוא דילול^{10 -2} של T₀. המשך את סדרת הדילול הדרושה עבור aliquot נקודת זמן. זכור מערבולת כל צינור לפני ההעברה. חשוב גם להשתמש בטיפ פיפטה חדש לכל העברה.

תרבות ה- E. coli	דילולים נדרשים וצינור #
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

טבלה 2. סדרת דילול הנדרשת עבור כל תרבות אי-קולי.

3. ציפוי

1. שלושה דילולים עבור כל נקודת זמן תרבות E. coli יהיה מצופה, על פי טבלה 3. תוויות לוחיות עם נקודת הזמן (T₁ עד T₈), גורם הדילול ונפח ההוספה. השתמש בצלחות משולשות לכל דילול.
2. הוסיפו 100 μL של כל דילול לצלחת על ידי צנרת הסכום למרכז צלחת אגר(איור 3). מיד להפיץ את aliquot על ידי שימוש במוט זכוכית בצורת "L" מעוקר להבה. אם aliquot אינו מתפשט מיד, זה סורבים במקום על הצלחת, וכתוצאה מכך גידול יתר חיידקי במקום של חיסון ראשוני.
3. חזור על ה ציפוי עבור כל סדרת דילול עבור נקודות זמן T₁ עד T₈. זכור לחטא את המוט בין הצלחות ובמיוחד בין דילולים שונים.
4. לאחר צלחות התייבשו במשך כמה דקות, הפוך ומניחים 37 °C חממה לילה. היפוך הצלחות מונע עיבוי מנפילה על צלחת אגר. לאחר הדגירה הלילית, יש לאחסן צלחות במקרר.

תרבות אי-קולי	דילול שיש לציפוי
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7*	10-5	10-6	10-7
T8*	10-4	10-5	10-6

^* דילול נמוך יותר לוקח בחשבון אוכלוסיות נמוכות יותר עקב שלב המוות.

טבלה 3. פרוטוקול ציפוי לתרבויות אי-קולי.

4. ספירת מושבות וחישוב זמן הדור הממוצע

1. לבחון לוחות לאחידות המושבות וחוסר זיהום.
2. עבור כל נקודת זמן (T₀ עד T₈), לבחור דילול אחד המכיל בין 30 ל 300 מושבות, ולספור לוחות משולשים.
3. באמצעות גורם הדילול, חשב לאחור את מספר התאים לכל mL של התרבות המקורית בנקודות זמן T₀ עד T₈. לדוגמה, אם מספר המושבות הנובע מדילול של^10-4 הוא 30, 28 ו- 32:
   מספר ממוצע של מושבות = 30 מושבות
   אלה עלו מ 0.1 מ"ל של דילול 10^-4
   מספר מושבות למ"ל = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. _{התוויית יומן} רישום 10 CFU/mL לעומת זמן (בשעות).
5. מהגרף, זהה את השלב המעריכי של הצמיחה. באמצעות 2 נקודות זמן בתוך שלב הצמיחה המעריכי ומספרי התאים המתאימים בכל פעם, חשב את זמן הדור הממוצע.