ניתוח עקומת גדילה חיידקית והיישומים הסביבתיים שלה
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
הפגנה סופרת: לואיזה איקנר
חיידקים הם בין צורות החיים הנפוצות ביותר על פני כדור הארץ.…
1. אוסף עליקוטים של תרבות חיידקים
- יום אחד לפני איסוף נקודות זמן הצמיחה, לחסן 20 מ"ל של ציר סויה טריפטיאז (TSB) בינוני בבקבוקון 50 מ"ל עם E. coli.
- דגירה לילה ב 27 °C (5 °F). תקופת דגירה ארוכה יחסית זו גורמת לאוכלוסיית שלב נייחת מסוג בר E. coli של כ 109 CFU / mL.
- למחרת, להשתמש 100 μL של התרבות המוכנה כדי לחסן 250 מ"ל של TSB (בבקבוק 500 מ"ל). מערבבים היטב. הסר aliquot 5-mL ומקרר מיד ב 4 °C (5 °F). זוהי נקודת זמן T = 0 או T0, ועליה להכיל כ- 4 x 105 CFU/mL.
- מניחים את הבקבוקון של E. coli הנותר (245 מ"ל) באינקובטור רועד של 37 מעלות צלזיוס. הסר aliquots 5-mL של תרבות כל שעה, עד 8 שעות. יש לאחסן כל עליקוט ב-4 °C (70 °F). ייעדו את עליקוטים אלה T1 עד T8.
2. דילול סדרתי
- מוציאים עליקוטים של אי קולי מהמקרר ומניחים על קרח להובלה. שמור את כל התרבויות על קרח עד השימוש.
- הקימו סדרה של צינורות דילול כדי להשיג דילולים שונים של כל תרבות אי-קולי (איור 3). צינורות מיקרופוגה נוחים לתפקוד זה. כל צינור דילול צריך להיות 900 μL של נוזל דילול (מלוחים סטריליים). סדרת דילול נדרשת עבור כל תרבות E. coli (T0 עד T8); תווית כל צינור לפי טבלה 2.
איור 3. סכמטי המציג את ההליך ל ציפוי E. coli. - התחל דילול על ידי הוספת 100 μL של E. coli מן הצינור שכותרתו T0 (התרבות הראשונית E. coli) לצינור A, שהוא דילול 10-1 של T0. מערבולת הצינור עבור 5s.
- לאחר מכן, להוסיף 100 μL של Tube A לצינור הבא של תמיסת מלח, Tube B, שהוא דילול10 -2 של T0. המשך את סדרת הדילול הדרושה עבור aliquot נקודת זמן. זכור מערבולת כל צינור לפני ההעברה. חשוב גם להשתמש בטיפ פיפטה חדש לכל העברה.
| תרבות ה- E. coli | דילולים נדרשים וצינור # | ||||||
| A | B | C | D | E | F | G | |
| T0 | 10-1 | 10-2 | |||||
| T1 | 10-1 | 10-2 | |||||
| T2 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||||
| T3 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | |||
| T4 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | ||
| T5 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
| T6 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T7 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
| T8 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
טבלה 2. סדרת דילול הנדרשת עבור כל תרבות אי-קולי.
3. ציפוי
- שלושה דילולים עבור כל נקודת זמן תרבות E. coli יהיה מצופה, על פי טבלה 3. תוויות לוחיות עם נקודת הזמן (T1 עד T8), גורם הדילול ונפח ההוספה. השתמש בצלחות משולשות לכל דילול.
- הוסיפו 100 μL של כל דילול לצלחת על ידי צנרת הסכום למרכז צלחת אגר(איור 3). מיד להפיץ את aliquot על ידי שימוש במוט זכוכית בצורת "L" מעוקר להבה. אם aliquot אינו מתפשט מיד, זה סורבים במקום על הצלחת, וכתוצאה מכך גידול יתר חיידקי במקום של חיסון ראשוני.
- חזור על ה ציפוי עבור כל סדרת דילול עבור נקודות זמן T1 עד T8. זכור לחטא את המוט בין הצלחות ובמיוחד בין דילולים שונים.
- לאחר צלחות התייבשו במשך כמה דקות, הפוך ומניחים 37 °C חממה לילה. היפוך הצלחות מונע עיבוי מנפילה על צלחת אגר. לאחר הדגירה הלילית, יש לאחסן צלחות במקרר.
| תרבות אי-קולי | דילול שיש לציפוי | ||
| T0 | 10-1 | 10-2 | 10-3 |
| T1 | 10-1 | 10-2 | 10-3 |
| T2 | 10-2 | 10-3 | 10-4 |
| T3 | 10-3 | 10-4 | 10-5 |
| T4 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| T5 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T6 | 10-6 | 10-7 | 10-8 |
| T7* | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T8* | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
* דילול נמוך יותר לוקח בחשבון אוכלוסיות נמוכות יותר עקב שלב המוות.
טבלה 3. פרוטוקול ציפוי לתרבויות אי-קולי.
4. ספירת מושבות וחישוב זמן הדור הממוצע
- לבחון לוחות לאחידות המושבות וחוסר זיהום.
- עבור כל נקודת זמן (T0 עד T8), לבחור דילול אחד המכיל בין 30 ל 300 מושבות, ולספור לוחות משולשים.
- באמצעות גורם הדילול, חשב לאחור את מספר התאים לכל mL של התרבות המקורית בנקודות זמן T0 עד T8. לדוגמה, אם מספר המושבות הנובע מדילול של10-4 הוא 30, 28 ו- 32:
מספר ממוצע של מושבות = 30 מושבות
אלה עלו מ 0.1 מ"ל של דילול 10-4
מספר מושבות למ"ל = 30 x 104 = 3 x 106 - התוויית יומן רישום 10 CFU/mL לעומת זמן (בשעות).
- מהגרף, זהה את השלב המעריכי של הצמיחה. באמצעות 2 נקודות זמן בתוך שלב הצמיחה המעריכי ומספרי התאים המתאימים בכל פעם, חשב את זמן הדור הממוצע.
מדידת קצב הגידול של חיידקים היא טכניקה מיקרוביולוגית בסיסית, ויש לה שימוש נרחב במחקר בסיסי כמו גם ביישומים חקלאיים ותעשייתיים.
חיידקים הם בין צורות החיים הנפוצות ביותר על פני כדור הארץ, והם נוכחים בכל מערכת אקולוגית, כולל גוף האדם. מיני חיידקים מסוימים הם גם בעלי יכולת גנטית גבוהה, ונרתמו כמודלים מחקריים או לייצור מוצרים טבעיים או סינתטיים בקנה מידה תעשייתי. אולם לא כל מיני החיידקים ניתנים לתרבית במעבדה. למי שיכול, מאפיין חשוב הוא קצב הכפל, או "קינטיקה של צמיחה".
מדידת קצב הגדילה של תרבית חיידקים יכולה ליידע מדענים על התפקודים הפיזיולוגיים והמטבוליים שלהם, והיא גם שימושית להשגת מספר תאים מדויק של החיידקים ליישומים במורד הזרם.
סרטון זה יציג את העקרונות מאחורי ניתוח קצב גידול חיידקים, ידגים פרוטוקול לאפיון קצב הגדילה עם "עקומת גדילה", ולבסוף, יחקור מספר יישומים במדעי הסביבה למדידת קינטיקה של גדילת חיידקים.
חיידקים בדרך כלל מתרבים בצורה א-מינית, ומתרבים על ידי ביקוע בינארי פשוט שבו תא הורה אחד מתחלק לשני תאי בת זהים. בתנאי גידול נוחים שבהם חומרי הזנה זמינים בשפע ופרמטרים סביבתיים כמו טמפרטורה תורמים כולם לצמיחה, קצב ההתרבות עולה בהרבה על שיעור התמותה. התוצאה היא צמיחה אקספוננציאלית.
על ידי מדידת כמות החיידקים בתרבית כפונקציה של זמן, ניתן לקבל עקומת גדילה. גידול חיידקים בתרבית נוזלית בתנאים אופטימליים מייצר עקומת גידול בעלת צורה אופיינית הניתנת לחלוקה לשלבים שונים. העקומה מתחילה ב"שלב השהיה", כאשר הצמיחה איטית בזמן שהחיידקים מתאקלמים לתנאי התרבית. הבא הוא ה"לוג" או "השלב האקספוננציאלי", כאשר החיידקים חווים צמיחה אקספוננציאלית. הצמיחה נעצרת בסופו של דבר ברגע שחומרי המזון מתרוקנים ומצטברים מוצרי פסולת, וכתוצאה מכך נוצר "שלב נייח". לבסוף, ברגע שקצב ההכפלה עוקף את קצב המוות של התאים, התרבית נכנסת ל"שלב המוות".
כדי לבנות עקומת גידול, מספרי חיידקים בבקבוק של תרבית נוזלית נספרים בנקודות זמן שונות לאורך תקופה מסוימת של תרבית. ניתן להשיג ספירת חיידקים במספר שיטות שונות. גישה נפוצה אחת היא למדוד צפיפות אופטית - או "OD" - 600, שהיא ספיגת האור של תמיסת החיידקים באורך גל של 600 ננומטר.
שיטה נוספת היא לקבוע את ה-"CFU", או יחידות יצירת המושבה, למיליליטר של התרבית. בשל האופי המשובט של גידול חיידקים, חיידק אחד בתרבית יכול באופן תיאורטי להתרחב למושבה אחת הניתנת לצפייה על צלחת אגר. על ידי ציפוי סדרה של דילולים של תרבית חיידקים כדי להגיע לריכוז חיידקים שבו ניתן לצפות במושבות בודדות ובדידות, שיטה הנקראת "ציפוי דילול סדרתי", ניתן להשתמש בספירת המושבות כדי לחשב לאחור את ריכוז החיידקים במונחים של CFU למ"ל.
כעת, לאחר שהבנתם כיצד ניתן לנתח צמיחת חיידקים, בואו נעבור על פרוטוקול לביצוע ניתוח עקומת גדילה על תרביות טהורות של מודל חיידקי מבוסס היטב, Escherichia coli, בשיטת ציפוי דילול סדרתי.
יום אחד לפני איסוף נקודת הזמן, חסנו 20 מ"ל של מרק סויה טריפטיקאז מעוקר מראש, או TSB, בינוני בבקבוק של 50 מ"ל עם מושבה אחת של E. coli.
לדגור על התרבות בן לילה בגיל 37? C עם טלטול. עבור E. coli, זה יביא לאוכלוסיית פאזה נייחת של כ-109 CFU/mL.
למחרת, לחסן 100? L של תרבית הלילה ל -250 מ"ל TSB בבקבוק של 500 מ"ל. מערבבים היטב. זה מייצר תרבית מדוללת של כ-4 x 105 CFU/mL. אחסן 5 מ"ל מהתרבית המדוללת הזו בצינור תרבית. זהו ה-aliquot מנקודת זמן 0, או T0. מקררים מיד ב-4 ?C.
מדגרים את הנפח הנותר של התרבית ב-37 ? C עם טלטול. בכל שעה לאחר מכן עד 8 שעות, אספו 5 מ"ל מהתרבית. ייעד את הדוגמאות הללו T1 עד T8, ואחסן את כולן ב-4? C עד השימוש.
ביום הניסוי, הוציאו את נקודות הזמן של E. coli מהמקרר ושמרו אותם על קרח. השתמש בצינורות מיקרופוגה סטריליים, כל אחד עם 900? L של מי מלח סטריליים, כדי להגדיר סדרת דילול עבור כל אליקוט לפי הטבלה הבאה.
מערבבים היטב את תרבית T0 על ידי מערבולת עדינה, ואז מוסיפים 100 ? L לצינור A מסדרת הדילול שלו, מה שיוצר דילול של 1 ל-10, או 10-1. מערבולת צינור A לערבוב, ובעזרת קצה פיפטה טרי, הוסף 100 ? L של צינור A לצינור B, מה שהופך את הדילול של 1 ל-100, או 10-2.
חזור על התהליך עבור כל תרבית ובצע את סדרת הדילול המתאימה לפי טבלה 2. לאחר ביצוע סדרת הדילול עבור כל דגימות נקודת הזמן, הכינו את המספר המתאים של צלחות אגר סויה טריפטיקאז סטריליות לציפוי חיידקים.
3 דילולים של כל תרבית נקודת זמן יהיו מצופים בשלוש עותקים לפי הטבלה הבאה. סמן את הצלחות בהתאם. ואז, פיפטה 100? L של כל תרבית מדוללת כראוי על מרכז צלחת האגר המתאימה. יש לעקר מוט זכוכית בצורת "L", לקרר על ידי נגיעה במוט באגר הרחק מהחיסון, ולפזר מיד את הנוזל על פני האגר. שימו לב שעיכוב בהתפשטות עלול לגרום לצמיחת יתר של חיידקים במקום החיסון.
המשך לצפות כל סדרת דילול עבור כל 9 תרביות נקודות הזמן, תוך עיקור להבה של מוט פיזור הזכוכית בין כל סדרת דילול.
לאחר שנותנים לצלחות להתייבש במשך מספר דקות, הופכים ומניחים אותן ב -37 ? C אינקובטור לילה. לאחר תקופת גידול זו, ניתן לאחסן צלחות בטמפרטורה של 4 ?C.
לאחר דגירה של לילה של לוחות הדילול, בדוק אותם לזיהום ואחידות של מושבות. עבור כל תרבית נקודת זמן, בחר דילול שעבורו יש בין 30-300 מושבות לצלחת. ספרו את מספר המושבות בכל אחת מהלוחות המשולשים לדילול זה.
באמצעות מספר המושבות הממוצע לכל דילול ומקדם הדילול, חשב את ריכוז החיידקים בתרבית המקורית בכל נקודת זמן ב-CFU/mL. לדוגמה, אם יש בממוצע 30 מושבות מקבוצת הלוחות המשולשים המתקבלות מ-0.1 מ"ל של דילול 10-4, או 1 ל-10,000, אז יהיו 30 חלקי 0.1 מ"ל כפול 10,000, או 3 מיליון CFU/מ"ל.
באמצעות ריכוז החיידקים המחושב עבור כל נקודת זמן, שרטטו גרף של לוג בסיס 10 של ריכוזי החיידקים, ב-CFU/mL, כנגד זמן בשעות. מהגרף, זהה את שלב הלוג של הגידול של תרבית החיידקים המקורית ובחר שתיים מנקודות הזמן בשלב הלוג, וציין את הראשונה מבין נקודות הזמן הללו כ-t = 0. חשב את זמן הדור הממוצע באמצעות המשוואה X שווה ל-2 בחזקת n כפול X0 כאשר X הוא ריכוז החיידקים בזמן t, X0 הוא הריכוז ההתחלתי ב-t = 0, ו-n הוא מספר הדורות שחלפו בין שתי נקודות הזמן.
לדוגמה, נניח ש-X0 הוא 1,000 CFU/mL, וב-t = 6 שעות, הריכוז הוא 16,000 CFU/mL. באמצעות המשוואה, אנו מקבלים ש-4 דורות התרחשו תוך 6 שעות, מה שנותן זמן דור של 6 חלקי 4 או 1.5 שעות לדור.
מדידת קינטיקה של גידול חיידקים היא בסיסית ליישומים רבים למטרות מחקר, חקלאות או ביו-הנדסה.
שימוש אחד לידיעת קצב גידול החיידקים הוא לאפשר קבלת כמות מדויקת של תרבית חיידקים כדי לחסן תרבית או מדיום אחר. לדוגמה, יש לגדל גידולים מסוימים, כגון קטניות, עם חיידקים סימביוטיים המכונים ריזוביה המתיישבים בשורשי הצמחים ליצירת גושים ו"מקבעים" חנקן - המרת חנקן אטמוספרי לאמוניה שיכולה לשמש את הצמח. עבור יישומים חקלאיים, כמות ידועה של ריזוביה מתווספת למדיום פחמן מבוסס כבול, המשמש לאחר מכן לחיסון זרעי קטניות כדי לבסס את הסימביוזה בין הצמח לחיידקים.
ניתוח צמיחה יכול לשמש גם לזיהוי מיני חיידקים שיכולים לפגוע בפסולת תעשייתית ואולי לייצר תוצרי לוואי יקרי ערך. בדוגמה זו, חוקרים חקרו כיצד אמצעי גידול בתוספת ליקר שחור, תוצר פסולת מעיסת עץ וייצור נייר, השפיעו על הצמיחה של מבודד מיקרוביאלי סביבתי.
החיידקים לא רק הראו צמיחה מוגברת עם משקאות שחורים, אלא גם הראו דפוס גדילה "דיפאזי", המעיד על נוכחות של יותר ממקור פחמן אחד במשקאות שחורים שהחיידקים יכולים לעכל אותם. לאחר מכן ניתן היה לחלץ רכיבים בודדים של משקה שחור לניתוח גידול מפורט יותר.
לבסוף, מדידות קצב גידול שימושיות גם לאפיון חיידקים שהונדסו למטרות תעשייתיות מסוימות, למשל, לתיקון זיהום נפט. כאן, מדענים יצרו זני חיידקים מהונדסים גנטית המכילים אנזימים לפירוק מרכיבי הפחמימנים של הנפט. ניתוח גדילה בוצע, למשל, כדי לוודא שהחיידקים המהונדסים הגדילו את קצב הגדילה מאשר חיידקים רגילים בנוכחות הפחמימנים הרעילים, מה שמעיד על סבילות משופרת שתאפשר לחיידקים המהונדסים לבצע את תפקיד ניקוי הזיהום שלהם.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על ניתוח שיעורי גידול חיידקים עם עקומות גדילה. כעת עליך להבין את שלבי הגידול השונים של תרביות חיידקים, כיצד לבצע ניסוי להשגת עקומת גדילה באמצעות איסוף נקודות זמן וציפוי דילול סדרתי, וכיצד ניתן ליישם ניתוח גדילה למטרות מחקר ותעשייתיות. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the four main phases of a bacterial growth curve?
A bacterial growth curve has four distinct phases. The lag phase occurs when bacteria acclimate to culture conditions and growth is slow. The exponential or log phase follows, with rapid bacterial multiplication. The stationary phase begins when nutrients deplete and waste accumulates, halting growth. Finally, the death phase occurs when cell death exceeds multiplication.
Q2: How does serial dilution plating help determine bacterial concentration?
Serial dilution plating involves creating successive 10-fold dilutions of a bacterial culture and plating each on agar. Individual colonies that grow represent colony forming units, or CFUs. By counting colonies on plates with 30-300 colonies and applying the dilution factor, researchers back-calculate the original bacterial concentration in CFU per milliliter. This method is fundamental to culturing and enumerating bacteria from soil samples and other environmental sources.
Q3: What is optical density 600 and why is it used to measure bacterial growth?
Optical density at 600 nanometers, or OD600, measures a bacterial solution's absorbance of light at that wavelength. This method provides a quick, non-destructive way to estimate bacterial cell density in liquid culture. OD600 is commonly used alongside other counting methods to track population changes during growth curve analysis.
Q4: How can bacterial growth rate analysis improve agricultural applications?
Growth rate analysis enables precise inoculation of known bacterial quantities for agricultural use. For example, legume crops require symbiotic rhizobia bacteria that fix nitrogen from the atmosphere. By measuring rhizobia growth kinetics, researchers can add exact bacterial amounts to peat-based media used to inoculate legume seeds, establishing optimal plant-bacterial symbiosis.
Q5: How is bacterial growth analysis used to identify waste-degrading microorganisms?
Researchers measure how environmental bacteria grow when exposed to industrial waste products like black liquor from paper production. Enhanced growth indicates the bacteria can metabolize waste components. Diphasic growth patterns reveal multiple carbon sources present. This analysis helps identify candidate organisms for bioremediation and guides extraction of individual waste components for further study.
Q6: What does mean generation time tell us about bacterial growth?
Mean generation time is the duration required for a bacterial population to double. Calculated from growth curve data using the equation X equals 2 to the power of n multiplied by X0, it quantifies how rapidly bacteria reproduce under specific conditions. For example, if a population doubles every 1.5 hours, the mean generation time is 1.5 hours per generation.
Q7: How does growth analysis support development of engineered bacteria for environmental remediation?
Scientists measure growth rates of genetically engineered bacterial strains designed to degrade pollutants like hydrocarbons from oil spills. Growth analysis verifies that engineered bacteria exhibit increased growth rates compared to normal bacteria when exposed to toxic compounds. This improved tolerance indicates the engineered organisms can survive and perform their pollution cleanup function effectively in contaminated environments.