ניתוח RNA של דגימות סביבתיות באמצעות RT-PCR

1. איסוף דוגמאות: דגימת קרקע

1. מצא מיקום לדוגמה באמצעות GPS, קואורדינטות או מראה.
2. לדגימה אקראית, בחרו נקודות אקראיות בתוך אזור כדי לקבל מפקד כללי של בתי גידול מיקרוביאליים. דגימה טרנסקטית אוספת מנקודות לאורך קו ישר, למשל,בסמוך לאפיק נחל. דגימות רשת נלקחות באופן שיטתי מנקודות במרווחי זמן קבועים, והן שימושיות למיפוי קהילות מיקרוביות באזור לא ידוע או משתנה.
3. דגימה בעומק של 7.5-15 ס"מ מספקת גישה לפעילות המיקרוביאלית הנפוצה ביותר הקרובה, אך לא בתוך, הריזוספירה (האזור הצר של האדמה המושפע ישירות משורשי הצמח והמיקרואורגניזמים הקשורים אליהם).
4. כדי לאסוף את דגימת הקרקע, לדחוף ולסובב את היד auger לתוך הקרקע לעומק קבוע מראש.
5. תרים את האוגר. האדמה נמצאת בתוך הגבעול החלול של האוגר.
6. מגרדים את האדמה בתחתית האוגר לתוך שקית איסוף אדמה. הקפד לא לגעת או לזהם את האדמה.
7. סמן את התיק כראוי עם מיקום, שם, תאריך ושעה.
8. במעבדה, להעביר את האדמה דרך מסננת 2 מ"מ כדי להסיר כל חצץ וסלע.
9. לנתח חלק מהאדמה עבור תוכן לחות הקרקע. לקבלת פרטים על שלב זה, אנא עיין בסרטון החינוך המדעי JoVE על לחות הקרקע.

2. איסוף דוגמאות: דגימת מים

1. מצא את המיקום לדוגמה באמצעות GPS, קואורדינטות, או ראייה.
2. לאסוף את המים בבקבוק אחסון. תיעד את נפח המים שנאספו; אם חיידקים במדגם נעשים כמותית, אז הריכוז המיקרוביאלי יכול להיקבע על סמך הנפח שנאסף.
3. בדוק מיד את המים עבור כל הפרמטרים הנדרשים לניסוי (טמפרטורה, pH, מוליכות, מליחות, חנקן ותכולת זרחן וכו ') באמצעות הבדיקות האלקטרוניות המתאימות.
4. מניחים את הבקבוק המכיל את דגימת המים לתוך צידנית עם קרח. מעבירים את הצידנית למעבדה.

3. מיצוי RNA

1. כדי לאסוף ולרכז מיקרואורגניזמים מהדגימה הסביבתית, אנא עיין בסרטון החינוך המדעי JoVE על מיצוי חומצת גרעין קהילתית.
2. לחלץ RNA מווירוסים באמצעות ערכת מיצוי מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
3. בקצרה, תחילה לערבב את הדגימות עם חיץ תמה בתוספת אתנול, ולאחר מכן להוסיף את הדגימות לתוך עמודות ספין.
4. צנטריפוגות העמודות בערך 12,000 x g, להשליך flowthrough. הוסף שוב מאגר כביסה לעמודים וצנטריפוגה.
5. הוסיפו מים נטולי RNase לעמודים וצנטריפוגה למשך 30 s כדי לחמוק מ- RNA לצינורות מיקרופוגה סטריליים של 1.5 מ"ל עם הידבקות נמוכה.

4. תמלול הפוך - PCR

1. אחזר את ריאגנטים הבאים מן המקפיא -20 °C: dNTP, מרוכז (למשל,10x) מאגר תמלול הפוך, פריימרים (בדוגמה זו, פריימרים אקראיים). הפשירו אותם על קרח או בטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע הנקי, ושמירו אותם על קרח לאחר שהופשרו. גם לאחזר את התמלול ההפוך ומעכב RNase ולשמור אותם על קרח.
2. חשב את אמצעי האחסון הריאגנט הדרושים כדי ליצור "תערובת אב" המשלבת את כל הריאגנטים הקבועים בין כל תגובה (ראה טבלה 1 לתגובה לדוגמה). הכן תערובת אב מספיק עבור כל מדגם, כמו גם פקד חיובי (באמצעות תבנית תעתיק ידועה) ושליטה שלילית (למשל,ללא תמלול הפוך, עם רק מים כתבנית, וכו ') תגובות. כלול 10% נוספים בנפח.
3. להרכיב את תערובת האב בצינורות מיקרו-הידבקות נמוכה 1.5 מ"ל. זה ממזער את הכריכה של מולקולות ריאגנט לקירות הפלסטיק של הצינורות.
4. כאשר ריאגנטים מופשרים, הוסף נפחים מחושבים לצינור המיקרו-פוגה. מערבולת בעדינות צנטריפוגה כל צינור לפני תוספת. הקפד לשנות טיפים pipette בין הוספת כל ריאגנט כדי למנוע זיהום.
5. לאחר כל ריאגנטים נוספו, מערבולת וצנטריפוגות תערובת מאסטר כדי להבטיח תערובת הומוגנית. החזירו ריאגנטים לאחסון ב-20 מעלות צלזיוס.
6. הכן וסמן רצועות PCR עם 8 צינורות, וייעד צינור אחד לכל דגימה או תגובת בקרה.
7. Aliquot נפח שווה של תערובת מאסטר לתוך כל צינור. לאחר מכן, הוסף רכיבים ספציפיים לתגובה, כגון תמציות ה- RNA.
8. הניחו את מכסה הרצועה בבטחה על רצועת ה-PCR, וצנטריפוגה במיניצנטריפוגה עם מתאם צינור פסים כדי להבטיח שכל הנוזלים יאספו בתחתית כל צינור(איור 2).
9. מקם את רצועת ה- PCR בבטחה בתרמוסקלר. לחץ למטה כדי להבטיח צינורות מאובטחים.
10. הגדר את התרמו-מחזור להפעלת התוכנית המתאימה לשימוש ב- RT (ראה טבלה 2 עבור פרוטוקול לדוגמה). כאשר התוכנית הושלמה, הצינורות יכילו מוצרי cDNA, אשר לאחר מכן יכול להיות נתון להגברת PCR. לפרטים, עיין בסרטוני החינוך המדעי של JoVE ב- PCR וב- PCR כמותי. יש לאחסן את cDNA ב- -20 °C (70 °F) עד לשימוש.

איור 2. רצועת 8 צינורות עם כתרים המכילה תערובת ותמצית מאסטר.

מגיב	עוצמת קול לתגובה אחת (μL)
מאגר RT 10x	2.0
25x dNTPs	0.8
פריימר אקראי 10x	2.0
ריבוי מנויים	1.0
מעכב רנאז	1.0
כיתה מולקולריתH 2 O	3.2
נפח כולל	10

טבלה 1. RT מאסטר לערבב מרכיבים.

שלב 1	שלב 2	שלב 3	שלב 4
25 °C (5°F), 10 דקות	37 °C (77 °F), 120 דקות	85 °C (5 דקות), 5 דקות	4 °C (5%), ∞

טבלה 2. תוכנית תרמוציקלר תגובת RT.