1 200 אצות באמצעות מתודולוגיה של Culturable
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
מחבר מפגין: בראדלי שמיץ
אצות הן קבוצה הטרוגנית מאוד של מיקרואורגניזמים שיש להם תכונה…
- לשקול מדגם 10 גרם של אדמה כי נאסף לח מהשדה, או היו מים הוסיף אליו, כך שהוא נשאר לח במשך 2-3 ימים. שים לב כי האדמה צריכה להיות לחה אך לא רוויה.
- הכן סדרת דילול פי 10 על-ידי הוספת 10 גרם אדמה ל-95 מ"ל של הפתרון של בריסטול שונה(איור 1). כדי ליצור פתרון בריסטול שונה, להמיס את הדברים הבאים ב 1,000 מ"ל של מים: 0.25 גרם NaNO3, 0.025 גרם CaCl2, 0.075 גרם MgSO-4 · 7H2O, 0.075 גרם K2HPO4,0.018 גרם KH2PO4, 0.025 גרם NaCl, ו 0.5 מ"ג FeCl3.
- המשך סדרת הדילול על ידי תוספת של 1 מ"ל של השעיה A עד 9 מ"ל של הפתרון של בריסטול ודילולים רציפים נוספים.
- לחסן 5 צינורות לשכפל כל אחד המכיל 9 מ"ל של פתרון בריסטול שונה עם 1 מ"ל כל דילול 10-2 עד 10-6 (טבלה 1).
- לדגור על הצינורות capped עד 4 שבועות באזור חשוף לאור השמש.
- שימו לב לצינורות לצמיחת אצות אחת ל-7 ימים. צינורות עם צמיחת אצות נראים ירוקים.
איור 1. כיצד ליצור סדרת דילול פי 10.
| צינור | דילול |
| B | 10-2 |
| C | 10-3 |
| D | 10-4 |
| E | 10-5 |
| F | 10-6 |
טבלה 1. צינורות ודילולים.
אצות הן אורגניזמים פוטוסינתטיים שחיים במגוון סביבות. ניתן לגדל אצות השוכנות בקרקע במעבדה, ולספור את ריכוזן באמצעות חישובים פשוטים.
אצות הן קבוצה הטרוגנית מאוד של אורגניזמים שיש להם תכונה משותפת אחת, כלומר החזקה של פיגמנטים פוטוסינתטיים, בדרך כלל כלורופיל. הרוב המכריע של האצות הן מיקרוסקופיות, אולם ההגדרה המדויקת של הקבוצה שנויה במחלוקת, וכוללת גם אצות, שהן בדרך כלל מקרוסקופיות.
בסביבה, אצות עלולות לגרום לבעיות במים עיליים כגון אגמים או מאגרים, וליצור פריחות אצות שמרוקנות את חומרי הזנת המים, לחסום אור העובר מעבר לפני המים, ולשחרר רעלים.? היכולת לספור אצות בדגימות מאפשרת למדענים להעריך את הבריאות של מערכת אקולוגית, ואת הסיכון הפוטנציאלי לצמיחת יתר של אצות.?
אוכלוסיות אצות בקרקעות מתרחשות לעתים קרובות בסביבות עשרת אלפים תאים לגרם. מספרים אלה בדרך כלל נמוכים מהריכוזים המקבילים של חיידקים, פטריות או אקטינומיצטים, מכיוון שאצות דורשות אור שמש לפוטוסינתזה, שאינה יכולה לחדור הרבה מתחת לפני האדמה.
סרטון זה ימחיש כיצד לגדל אצות מהאדמה במעבדה, וכיצד לספור את ריכוז האצות בדגימת הקרקע ההתחלתית.
לאצות יש השפעות מועילות על מערכות אקולוגיות. לאצות כחולות-ירוקות, או ציאנובקטריה, יש את היכולת לקבע גז חנקן מהאטמוספרה, מה שהופך אותן לשימושיות בהגדלת החנקן בקרקע בסביבות צחיחות למחצה וגם ככלי פוטנציאלי לייצור דלק ביולוגי.
אצות אחרות הן איקריוטיות, ונעות בין אורגניזמים חד-תאיים לאורגניזמים רב-תאיים מורכבים, כמו אצות. אלה כוללים אצות ירוקות, אוגלנואידים, דינופלגלטים וצורניות, אצות חומות ואצות אדומות.
אצות הן פוטוטרופיות, ומקבלות אנרגיה מפוטוסינתזה ופחמן לביומסה מפחמן דו חמצני. כתוצאה מכך, ניתן לגדל אותם במצע המורכב כולו מחומרים מזינים אנאורגניים, ללא תוספת מצע פחמן אורגני. מחסור זה במצע אורגני מונע צמיחה של חיידקים הטרוטרופיים, התלויים בפחמן אורגני חיצוני לצמיחה.
כדי לגדל אצות לספירה, דגימות קרקע מדוללות באופן סדרתי פי עשרה ל-10-6 גרם אדמה למ"ל, ומתורבתות במצעי גידול. מספר שכפולים נעשים עבור כל דילול. לאחר מכן הם מודגרים באזור מואר היטב עד 4 שבועות כדי לאפשר צמיחת אצות.
נוכחותן של אצות בכל דילול נקבעת על ידי סימן חיובי של צמיחה במדיום, שיופיע בדרך כלל כרפש ירוק. לבסוף, מתייעצים עם טבלאות MPN שפותחו אמפירית המיועדות לגידול אצות, המאפשרות למשתמש לקבוע את ריכוז האצות המקורי על סמך גידול בשכפולי דילול. שיטת MPN מסתמכת על דילול סדרתי של דגימות כך שהאצות מדוללות עד להכחדה, כלומר בדילול מסוים לא מתרחשת צמיחת אצות.
כעת, כשאנחנו מכירים את המושגים שמאחורי גידול וספירת אצות מדגימות בואו נסתכל על האופן שבו זה מתבצע במעבדה.
כדי להתחיל בניסוי, שקלו תחילה 10 גרם של אדמה לחה שנאספה לחה מהשדה, או עברה התייבשות ונשארה לחה במשך יומיים עד שלושה. האדמה צריכה?אבל לא רוויה.
לאחר מכן, הכינו סדרת דילול פי עשרה על ידי הוספת 10 גרם האדמה תחילה ל-95 מ"ל של התמיסה של בריסטול שונה, או MBS. תייגו את זה כמתלה A.
לאחר ניעור נמרץ, המשיכו את סדרת הדילול על ידי הוספת 1 מ"ל של תרחיף A ל-9 מ"ל של MBS במבחנה. המשך בסדרת הדילול הזו פי עשרה עוד 4 פעמים כדי לתת דילולים של עד 10-6 גרם למ"ל.
לאחר מכן, יש לחסן 5 צינורות משוכפלים, שכל אחד מהם מכיל 9 מ"ל של MBS עם 1 מ"ל מכל אחד מהדילולים 10-1 עד 10-5. התוצאה היא 5 צינורות משכפלים לכל דילול מ-10-2 ל-10-6. מכסים את הצינורות בצורה רופפת.
לבסוף, דגרו את הצינורות במשך 4 שבועות מלאים באזור החשוף לאור השמש. התבונן בצינורות לצמיחת אצות אחת ל-7 ימים. צינורות המציגים צמיחת אצות ייראו ירוקים.
ניתוח המספר הסביר ביותר, או MPN, הוא שיטה מתמטית נפוצה לספירת מיקרואורגניזמים הגדלים מדילול של מצע ראשוני מרוכז. על ידי התחשבות בגורמי הדילול של התמיסות, ומספר הצינורות המראים סימני צמיחה חיוביים בכל דילול, ניתן לחשב את המספר הסביר ביותר של אורגניזמים לגרם של דגימת קרקע מקורית באמצעות טבלת MPN ונוסחה פשוטה.
כדי לחשב MPN, לדילול הגבוה ביותר עם המספר הגבוה ביותר של צינורות שכפול חיוביים מוקצית התווית של p1, במקרה זה, השכפולים של שפופרת C. לעומת זאת, חלק מהצינורות מ-D & E הם שליליים ללא סימנים של צמיחת אצות.
מספר הצינורות בשני הדילולים הגבוהים הבאים המראים צמיחה חיובית מסומנים כ-p2 ו-p3. כאן, p2 = D ו-p3 = E.
ניתן למצוא את הערך עבור p1 על ידי התבוננות בעמודה הראשונה בטבלת MPN. אותו הדבר צריך להיעשות עם העמודה p2. לבסוף, הערך של p3, על פני החלק העליון, משמש כדי לחתוך את השניים המוגדרים על ידי p1 ו-p2, כדי לתת ערך של המספר הסביר ביותר של אורגניזמים למ"ל.
לאחר מכן, כדי לחשב את ריכוז האורגניזמים לגרם בדגימת האדמה המקורית, ערך זה מחולק בריכוז האדמה בדילול שאליו הוקצה p2. המשוואה הבאה משמשת להגדרת המספר האמיתי של אורגניזמים לגרם אדמה.
לספירת אצות ולניתוח MPN יש מגוון רחב של יישומים, שחלקם נחקרים כאן.
ניתן להשתמש בשיטת תרבות זו של ספירת אצות במגוון הגדרות. ניתן ליישם אותו על נהרות או אגמים כדי לקבוע את רמות האצות, ולהעריך את הסיכונים של פריחת אצות מזיקה. לחלופין, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את הניקיון והבטיחות של מים המשמשים באופן ישיר יותר על ידי בני אדם, כולל בריכות שחייה, מזרקות מים או מקורות מי שתייה אחרים. באופן אידיאלי, בדגימות מי שתייה ובבריכות שחייה, אין אצות.
ניתן ליישם את ניתוח MPN לספירה גם על מיקרואורגניזמים אחרים שאינם אצות. לדוגמה, ניתן להעריך את איכות המים באמצעות אורגניזמים אינדיקטורים כגון קוליפורמים או E. coli. כאן, ניתן לתרבית דגימות עם מדיה המכילה כימיקלים שמשתנים כדי לייצר צבע או פלואורסצנטיות בנוכחות אורגניזמים אינדיקטורים. על ידי ביצוע שכפולים קטנים מרובים של ניסוי זה בתאים בודדים, עם דגימות מדוללות לריכוז ידוע, ניתן להתייחס ליחס התאים החיוביים לטבלת MPN עבור אורגניזם האינדיקטור הספציפי, ולקבוע את הריכוז ההתחלתי בדגימות.
אצות עשויות להיות מתורבתות גם ליישומים מסחריים. לדוגמה, סוגים מסוימים של דשן ביולוגי משתמשים באצות כחולות-ירוקות, שיכולות לפעול כסימביונטים עם צמחים, ולסייע לקיומם ולקליטת חנקן, מה ששימושי במיוחד בסיוע לגידול יבולים באזורים עם אדמה דלה. באופן דומה, ניתן לגדל אצות לדלקים ביולוגיים, או כמקור למזון עשיר בחומרים מזינים לבעלי חיים.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לתרבות האצות וספירתה. כעת עליכם להבין כיצד לדלל דגימות אדמה לגידול אצות, כיצד לגדל אצות במעבדה וכיצד לספור את ריכוז האצות של דגימות ההתחלה שלכם. תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are algae and what makes them unique among microorganisms?
Algae are a heterogeneous group of photosynthetic organisms unified by possession of photosynthetic pigments, commonly chlorophyll. Most algae are microscopic, though the group includes macroscopic seaweeds. Unlike heterotrophic bacteria, algae are phototrophic, obtaining energy from photosynthesis and carbon from carbon dioxide, allowing growth in inorganic media without organic substrates.
Q2: Why are algal populations in soil typically lower than bacterial populations?
Algal populations in soils average around ten thousand cells per gram, lower than bacteria, fungi, or actinomycetes because algae require sunlight for photosynthesis. Sunlight cannot penetrate far below the soil surface, limiting algal growth to shallow depths where light is available for photosynthetic activity.
Q3: How does the serial dilution process work in algal enumeration?
Soil samples are serially diluted tenfold to 10-6 g soil per mL and cultured in growth media with multiple replicates at each dilution. Tubes are incubated in well-lit areas for up to four weeks. The serial dilution dilutes algae to extinction, meaning at some dilution, no algal growth occurs, enabling accurate enumeration using MPN analysis.
Q4: What does a positive result look like when culturing algae in the laboratory?
Algal growth appears as a green slime in the culture medium, resulting from photosynthetic activity. This visible green coloration indicates the presence of algae in that particular dilution and serves as the primary indicator for determining which tubes show positive growth during MPN analysis.
Q5: How is the Most Probable Number calculated from dilution results?
The highest dilution with the most positive replicate tubes is labeled p1, followed by p2 and p3 from higher dilutions. Values are located in an MPN table using p1 and p2 columns, then intersected with p3 across the top to obtain organisms per mL. This value is divided by soil concentration in the p2 dilution to calculate organisms per gram of original soil.
Q6: What are the practical applications of algal enumeration in environmental monitoring?
Algal enumeration assesses algal levels in rivers and lakes to evaluate risks of harmful algal blooms. It also monitors cleanliness and safety of human-use waters including swimming pools and drinking water sources, where ideally no algae should be present. The MPN method can similarly assess water quality using indicator organisms like coliforms or E. coli.
Q7: What beneficial roles do algae play in soil and agriculture?
Blue-green algae, or cyanobacteria, fix nitrogen gas from the atmosphere, increasing soil nitrogen in semi-arid environments. Some algae serve as biofertilizers, acting as symbionts with plants to enhance nitrogen uptake, particularly useful in areas with poor soil. Algae are also cultivated for biofuels and as nutrient-rich livestock feed.