כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)

1. להפוך את השלב הנייד

1. הכן את השלב הנייד על ידי הוספת 400 מ"ל של acetonitrile כ 1.5 ליטר של מים DI מטוהרים.
2. בזהירות להוסיף 2.4 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית לפתרון זה.
3. לדלל את הפתרון לנפח כולל של 2.0 L בבקבוק נפחי עם מי DI מטוהרים. הפתרון המתקבל צריך להיות pH בין 2.8 ל 3.2.
4. התאם את רמת ה-pH ל-4.2 על-ידי הוספת 40% נתרן הידרוקסיד, מבחינת ירידה עם שימוש במד pH דיגיטלי מכויל. הוסף לאט מאוד ברגע pH מגיע 4.0. זה צריך לקחת סביב 50 טיפות כדי להשיג.
5. לסנן את השלב הנייד באמצעות מסנן ממברנה ניילון 66 0.47-μm תחת ואקום כדי degas הפתרון כדי להסיר מוצקים שיכולים לחבר את העמוד הכרומטוגרפי. חשוב degas השלב הנייד כדי למנוע בועה, אשר יכול גם לגרום חלל בשלב הנייח בכניסת העמודה או לעבוד את דרכו לתוך תא הגלאי, גרימת חוסר יציבות עם ספיגת UV.

2. יצירת פתרונות הרכיבים

שלושת המרכיבים שצריכים להיעשות הם קפאין (0.8 מ"ג/מ"ל), אשלגן בנזואט (1.4 מ"ג/מ"ל) ואפרטם (L-אספרטיל-L-פנילאלנין מתיל אסתר) (6.0 מ"ג/מ"ל). ריכוזים אלה, פעם מדולל באותה צורה, לשים את הסטנדרטים ברמות שנמצאו דגימות סודה.

1. הוסיפו 0.40 גרם קפאין לבקבוק נפחי של 500 מ"ל, ואז לדלל לסימן 500 מ"ל עם מי DI.
2. הוסיפו 0.70 גרם בנזואט לבקבוק נפחי של 500 מ"ל, ואז לדלל לסימן 500 מ"ל עם מי DI.
3. הוסף 0.60 גרם אספרטיים לבקבוק נפחי של 100 מ"ל, ולאחר מכן לדלל לסימן 100 מ"ל עם מי DI. מניחים את הפתרון הזה במקרר כדי למנוע פירוק במהלך האחסון.

3. יצירת 7 פתרונות סטנדרטיים

שלושת הרכיבים כולם יש מקדמי הפצה שונים, אשר משפיע על האופן שבו כל אינטראקציה עם שני השלבים. ככל שמקדם ההפצה גדול יותר, כך הרכיב מבלה יותר זמן בשלב הנייח, וכתוצאה מכך זמני שמירה ארוכים יותר בהגעה לגלאי.

1. לאחר התרשים בטבלה 1, הזרם את הכמות המתאימה של כל רכיב לבקבוק נפחי של 50 מ"ל.
2. לדלל כל אחד מפתרונות המניה לסימן 50 מ"ל על הבקבוקונים הנפחיים עם שלב נייד.
3. יוצקים כל פתרון סטנדרטי לבקבוקונים קטנים המסומנים בארון דוגמה.
4. אחסן את מדפי הדגימות במקרר, יחד עם הפתרונות הנותרים בבקבוקונים נפחיים של 50 מ"ל.

4. בדיקת ההגדרות הראשוניות של מערכת HPLC

1. ודא כי קו הפסולת נמצא במיכל פסולת ואינו מיחזור בחזרה לשלב הנייד.
2. ודא שקצב הזרימה של השלב הנייד מוגדר ל- 0.5 מ"ל/דקה. זה גבוה מספיק כדי לאפשר לכל הפסגות לחמוק תוך 5 דקות ואיטי מספיק כדי לאפשר רזולוציה נחמדה.
3. ודא כי הלחץ המינימלי והמקסימלי וקצב הזרימה מוגדרים לערכים הנכונים בלוח הקדמי של מערכת המסירה הממסית (המשאבה).
   1. הגדרת לחץ מינימלית: 250 פסאיי (זה כדי לכבות את המשאבה, אם מתרחשת דליפה).
   2. הגדרת לחץ מקסימלית: 4,000 פסאיי (זאת כדי להגן על המשאבה מפני שבירה, אם נוצר סתימה).
4. לחץ על "אפס" בלוח הקדמי של הגלאי כדי להגדיר את הריק (הריק הוא השלב הנייד הטהור).
5. לשטוף מזרק 100-μL עם מים deionized, ולאחר מכן עם כמה כרכים של אחד תקני העבודה שיש לנתח, ולמלא את המזרק עם פתרון זה. התחל עם 3 דגימות של רכיב יחיד, המאפשר לזהות את השיא של כל רכיב עניין.

5. הזרקה ידנית של המדגם ואיסוף הנתונים

1. עם ידית מזרק במצב עומס, לאט להזריק 100 μL של פתרון דרך יציאת המחיצה.
2. ודא שתוכנית איסוף הנתונים מוגדרת לאיסוף נתונים עבור 300 s, מה שמאפשר מספיק זמן לכל 3 הפסגות לחמוק דרך הגלאי.
3. כאשר אתה מוכן להתחיל את הניסוי, לסובב את ידית המזרק למיקום ההזרקה (אשר מזריק את המדגם לתוך השלב הנייד) ולחץ על "התחל ניסיון" על תוכנית איסוף נתוני המחשב מיד. בתקנים 1-3, רק אחת משלוש הפסגות הרצופות מופיעה על המסך במהלך הריצה(איור 1).
4. לאחר ש- 300 s חלפו, איסוף הנתונים שולח בקשה לשמירת קובץ הנתונים. שמור את הנתונים תחת שם קובץ מתאים(למשל,STD #1).
5. שים לב לזמן בשניות עבור השיא של כל גירסת ניסיון, המשמשת לזיהוי רכיב זה.
6. הסר את המזרק מן המחיצה ולחזור על התהליך עבור כל אחד תקני העבודה הנותרים, באמצעות באותו זמן לכל כרומטוגרמה כפי שנקבע מההפעלה הראשונה.

איור 1. הכרומטוגרמה של 3 הרכיבים. משמאל לימין, הם קפאין, אספרטיים, ובנזואט.

6. הדגימות של דיאט סודה

דיאט קולה, דיאט פפסי וקולה זירו הם ה"לא ידועים". הם הושארו בחוץ במיכלים פתוחים בן לילה כדי להיפטר מהפחמימה, שכן בועות אינן טובות למערכת HPLC. זה מספיק נפטר מכל גזים בדגימות.

1. צייר סביב 2 מ"ל של סודה דיאטה לתוך מזרק פלסטיק.
2. חבר את קצה המסנן למזרק דרך Luer-Lok על ידי סיבובו במקום.
3. דוחפים את הנוזל במזרק דרך המסנן לתוך בקבוקון זכוכית קטן. זה נפטר מחלקיקים לא רצויים שעלולים לסתום את עמודת ההפרדה.
4. לדלל כל מדגם עם כמות שווה של מים DI, כך שהם ב 50% טוהר.
5. הזרק 100 μL של המדגם לתוך לולאת המדגם, ולהפעיל ניסויים עם אותם פרמטרים כמו עבור הסטנדרטים.

7. חישובים

1. מהריכוזים של פתרונות הרכיבים, לחשב את הריכוז של כל הרכיבים בתקנים, בהתבסס על דילול שנעשו עבור 7 דגימות.
2. קבע אזורי שיא בכרומטוגרמה עבור כל תקן ואת הדגימות הלא ידועות בשיטה המשולשת, השווה לגובה שיא כפול הרוחב בגובה 1/2 (איור 2). לאחר קביעת הפסגה המתאימה לכל רכיב בהתבסס על הזמן שלוקח לכל רכיב להציג את השיא המתאים לו, הזן אזורי שיא אלה בגיליון אלקטרוני של המחשב.
3. צור עקומות כיול של אזור שיא לעומת ריכוז (mg/L) בתקנים עבור כל שלושת הרכיבים.
4. קבעו את הריבועים הפחות מתאימים לכל עקומת כיול.
5. חשב את הריכוז של כל רכיב במשקאות מוגזים דיאט מאזורי השיא המוצגים בניסויי HPLC עבור הדגימות. זכור כי סודה דיאטה היה מדולל על ידי גורם של 2 לפני הזרקה לתוך מערכת HPLC.
6. לחשב את הסכום, mg /L, של כל רכיב משקאות מוגזים דיאטה.
7. בהתבסס על התוצאות, לחשב את המיליגרם של כל רכיב שנמצא פחית 12 אונקיות של סודה. נניח 12 אונקיות = 354.9 מ"ל.

איור 2. דוגמה בסיסית לגובה ולרוחב השיא של העקומה, שיש להכפיל (גובה שיא כפול רוחב בגובה 1/2).