Question 1

כיצד מפרידה שיטת HPLC רכיבים בתערובת נוזלית?

Accepted Answer

HPLC מפרידה רכיבים על בסיס האינטראקציות השונות שלהם עם פאזה נייחת. פאזה ניידת נוזלית נדחפת באמצעות משאבה דרך עמודה הממולאת בחרוזי פאזה נייחת קטנים. הרכיבים מגיבים באופן שונה עם חרוזים אלו ונעים דרך העמודה בקצבים שונים, דבר הגורם להפרדה. הזמן שכל רכיב דורש כדי לצאת מהעמודה, המכונה זמן השהיה (retention time), מאפשר לזהות את הרכיב.

Question 2

מהו ההבדל בין HPLC אנליטי ל-HPLC פרפרטיבי?

Accepted Answer

HPLC אנליטי מזהה רכיבים בנפח דגימה קטן, אשר נשלח לאחר מכן לפסולת. HPLC פרפרטיבי מטהר תערובת ואוסף כמות רצויה של כל רכיב בפרקציות לשימוש מאוחר יותר. שתי השיטות משתמשות באותו עיקרון הפרדה, אך הן נבדלות במטרתן ובאופן הטיפול בדגימה לאחר הניתוח.

Question 3

מדוע ניקוי גזים (degassing) מהפאזה הניידת הוא חשוב ב-HPLC?

Accepted Answer

ניקוי גזים (Degassing) מסיר גזים מומסים מהפאזה הניידת לפני כניסתה לעמודה. בועות בפאזה הניידת עלולות ליצור חללים בפאזה הנייחת או להגיע לתא הגילוי, דבר הגורם לחוסר יציבות במדידה. סינון הפאזה הניידת דרך מסנן ממברנה תחת ואקום מסיר ביעילות גזים וחלקיקים מוצקים שעלולים לסתום את העמודה.

Question 4

מה מספר לכם הכרומטוגרם על הרכיבים המופרדים?

Accepted Answer

כרומטוגרמה מציגה גרף של זמן התגENTION (זמן שהייה) אל מול עוצמת האות. זמן ההתגENTION מזהה כל רכיב, בעוד ששטח הפסגא מכמת את כמות התרכובת בתמיסה המקורית. באמצעות התאמה של שטחי הפסגאות לריכוזים ידועים, תוך שימוש בעקרונות וביישומים של עקומות כיול, ניתן לקבוע ריכוזים של דגימות לא ידועות.

Question 5

מהי כרומטוגרפיה במצב הפוך ומתי משתמשים בה?

Accepted Answer

כרומטוגרפיה במצב הפוך (Reversed-phase chromatography) משתמשת בפאזה נייחת הידרופובית, בדרך כלל חלקיקי סיליקה עם שרשראות C18 הקשורות לפני השטח, בשילוב עם פאזה ניידת פולרית המורכבת ממים ומממס אורגני כגון אצטוניטריל. הרכיבים נסחפים (elute) לפי סדר של פולריות פוחתת. זהו מצב ה-HPLC הנפוץ ביותר והוא יעיל עבור דגימות מסיסות במים.

Question 6

כיצד אלוציה מדורגת (gradient elution) משפרת את ההפרדה ב-HPLC?

Accepted Answer

אלוציה בגרדיאנט (gradient elution) משנה את יחס הפאזה הניידת באופן ליניארי או מדורג במהלך ההפרדה, ובכך מגבירה את ריכוז הממס האורגני עם הזמן. פעולה זו מונעת הרחבה של פסגות (peak broadening) של רכיבים פחות פולריים, תופעה המתרחשת בתנאים איזוקרטיים קבועים, ובכך משפרת את איכות ההפרדה ומקצרת את זמן האלוציה עבור תערובות מורכבות.

Question 7

מדוע נעשה שימוש בחרוזי פאזה ניימדת קטנים יותר ב-HPLC בהשוואה לכרומטוגרפיית עמודה?

Accepted Answer

HPLC פועלת בקצבי זרימה ובלחצים גבוהים יותר מאשר כרומטוגרפיית עמודה קלאסית, מה שמאפשר שימוש בחרוזי פאזה נייחת קטנים יותר. לחרוזים במיקרו-קנה מידה אלו יש יחס שטח פנים לנפח גדול יותר, אשר מגביר משמעותית את האינטראקציה בין הפאזה הנייחת למרכיבי הדגימה, ובכך משפר את יעילות ההפרדה ואת הרזולוציה.

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) - חידון הערכה