כימות מיקרואורגניזמים סביבתיים ווירוסים באמצעות qPCR
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
מחבר מפגין: בראדלי שמיץ
תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), הידועה גם בשם PCR בזמן א…
1. איסוף דוגמאות
- לאסוף אדמה באמצעות אוגר או את חפירה לעומק נחוש. אם אוספים אדמה מהקרניזון, אוספים אדמה רק בתוך 7 מ"מ סביב שורש הצמח, על ידי פגיעה באדמה עודפת מהשורש ושריטת האדמה הרצויה לחבית איסוף.
- מניחים בקבוק נלג'ין סטרילי במקל טבילה. החזק את קצה המקל ולאסוף מים על ידי בקבוק שקוע. מניחים את הבקבוק בצידנית עם קרח.
- העבר דגימות למעבדה.
2. מיצוי חומצות גרעין
- כדי לבודד מיקרואורגניזמים מהדגימות שנאספו ולחלץ מהם דנ"א ו/או רנ"א, אנא עיין בסרטון החינוך המדעי של JoVE על הפקת חומצת גרעין קהילתית.
3. תמלול הפוך
- אם החומר הגנטי שנבחנ הוא RNA, יש להשתמש בו כדי ליצור DNA משלים (cDNA) באמצעות תמלול הפוך לפני שתמשיך ל- PCR. לפרטים, אנא עיינו בסרטון החינוך המדעי של JoVE ב- RT-PCR.
4. הגדרת qPCR
- יש לאחזר ריאגנטים המאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, ולהפשיר אותם על קרח או בטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע הנקי. ריאגנטים המשמשים בדוגמה זו כוללים את תמהיל התגובה של qPCR (התלוי במכונת qPCR המשמשת; מכיל פולימראז DNA), פריימרים קדמיים והופכים, ואת הבדיקה TaqMan. רצפי הפריימר והגשוש מתוכננים עם רצפים ספציפיים לאורגניזם שנמנה. עיין בספרות הנוכחית כדי למצוא רצפים של עניין. בדוגמה זו, Roche אור מחזור 480 בדיקות לערבב מערכת ריאגנט ישמש. נגיף מנומר קל פלפל יומר בדגימת המים. 1,2 ראה טבלה 1 עבור פריימר ורצפי בדיקה.
- הפשרה שחולצה (ג) DNA מדגימות ואת ה- DNA שליטה חיובית (המורכב רצפים ספציפיים לאורגניזם משובטים לתוך plasmids חיידקי) בטמפרטורת החדר.
- הכן תבנית טבלה בת 96 תאים הדומה ללוח qPCR בן 96 הבאר. סמן כל תא בתגובה שתיטען על הצלחת. כלול תגובות עבור כל דגימה ותקן משולש, כמו גם עבור שליטה חיובית ושליטה שלילית, כגון תגובה ללא DNA.
- חשב את כרכים ריאגנט הדרושים עבור תגובה "תערובת מאסטר", הכולל את כל הריאגנטים כי הם קבועים בין התגובות, בהתבסס על הוראות היצרן ואת הספרות. הכן מספיק תערובת מאסטר לתגובות משולשות עבור כל הדגימות בתוספת פקדים, ו-10% נוספים כדי להסביר שגיאת צנרת. למתכון לתערובת ראשית לדוגמה, עיין בטבלה 2.
- עבודה בתוך מכסה המנוע נקי, ברגע שכל הריאגנטים מופשרים לחלוטין, הוסיפו כמות מחושבת של כל ריאגנט לצינור מיקרו-קשירה נמוך של 1.5 מ"ל כדי ליצור תערובת ראשית. מערבולת וקצרה minicentrifuge כל ריאגנט לפני הוספת. שנה את קצה הפיפטה בין כל ריאגנט כדי למנוע זיהום ולהבטיח ריכוזים נכונים. לאחר כל ריאגנטים נוספו, מערבולת וצינור minicentrifuge עם תערובת מאסטר כדי להבטיח הומוגניות.
- Aliquot את הנפח המתאים של תערובת מאסטר לתוך כל באר ייעודית בצלחת PCR 96 טוב.
- הוסף את הנפח המתאים של (ג) דגימת DNA, plasmid שליטה חיובית, ושליטה שלילית (מים כיתה מולקולרית) לתוך בארות ייעודיות.
- לאחר שכל הדגימות והפקדים נוספו, צלחת איטום עם רדיד איטום. השתמש בכלי איטום כדי לדחוף אוויר מתחת רדיד הכסף ולמנוע בועות. תקרעו את קצוות נייר הכסף בזהירות.
- צנטריפוגות צלחת 96 באר אטום בצנטריפוגה עם מחזיק צלחת כדי לאסוף תערובת בתחתית כל באר. הקפד להשתמש בצלחת משקל נגד כדי להבטיח כי הצנטריפוגה תהיה מאוזנת כראוי בעת סיבוב. צנטריפוגה דופק עד 1000 סל"ד, ולאחר מכן לתת צנטריפוגה לאט לעצור ללא בלמים.
5. פעולת qPCR
- מניחים צלחת אטומה 96-באר לתוך מכונת qPCR. ודא שהמחשב מציין שהוא מוכן להפעלה.
- בצע את הוראות מחשב qPCR כדי להזין כראוי את כל המידע הדרוש לתוכנה ולאחר מכן הגדר את מחשב qPCR לפעול.
- לאחר שהמכונה תשלים את ההפעלה, התוכנה תוכל להשתמש בריכוזים הידועים של הפקד החיובי כדי לחשב את כמות cDNA בכל תגובה. לאחר מכן ניתן לחשב את כמות הנגיף במדגם המקורי, בהתבסס על תהליכי הדילול, הסינון, הריכוז, ההגברה ו/או החילוץ המבוצעים כדי להשיג את דגימת ה- DNA.
| מגיב | רצף (5' → 3') | נפח (μL / well) | קונק סופי. |
| פריימר קדמי | GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA | 2.25 | 900 ננומטר |
| פריימר הפוך | TTGTCGGTTGCAATGCAAGT | 2.25 | 900 ננומטר |
| בדיקה | FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1 | 1.0 | 200 ננומטר |
טבלה 1. פריימר מדגם ורצפי בדיקה לאיתור וירוס מנומר קל פלפל.
| מגיב | נפח (μL / well) | מספר וולס | אמצעי אחסון מיקס ראשי (μL) |
| תערובת LC 480 | 12.5 | 26 | 325 |
| מולקולרית H2O | 4.5 | 117 | |
| פריימר קדמי | 2.25 | 58.5 | |
| פריימר הפוך | 2.25 | 58.5 | |
| בדיקה | 1.0 | 26 | |
| סך | 22.5 | 585 |
טבלה 2. כרכים ריאגנט לתגובה אישית ותערובת מאסטר.
הופעתה של תגובת שרשרת פולימראז כמותית, או qPCR, אפשרה לקבוע כמותית את הכמות של כל מיקרואורגניזם בדגימה סביבתית.
בדומה ל-PCR סטנדרטי, qPCR מזהה מיקרואורגניזמים על ידי זיהוי נוכחות או היעדר רצפי DNA ספציפיים לאורגניזמים המעניינים. זה מאפשר זיהוי של חיידקים שלא ניתן לגדל במעבדה, מה שמאפשר לבחון מגוון רחב הרבה יותר של אורגניזמים סביבתיים. בנוסף, qPCR מאפשר להעריך כמותית את כמות ה-DNA. אך במקביל, מתודולוגיות PCR מזהות DNA מכל האורגניזמים המתים או החיים, ומגבילות את היכולת לחפש רק חיידקים הגדלים באופן פעיל בדגימה.
סרטון זה יסקור את החידושים הכימיים המבדילים בין qPCR ל-PCR רגיל, יסביר כיצד ניתן להשתמש ב-qPCR למדידה כמותית של DNA, ידגים פרוטוקול לשימוש ב-qPCR לאיתור נגיף RNA מדגימות קרקע, ולבסוף, יראה כיצד qPCR מיושם במיקרוביולוגיה סביבתית כיום.
העקרונות הבסיסיים מאחורי qPCR זהים ל-PCR רגיל - מחזורים חוזרים ונשנים של חישול פריימר לתבנית, התארכות של תוצר PCR ודנטורציה של מוצר מתבנית, מה שמוביל להגברה אקספוננציאלית של רצף יעד מעניין, המכונה המגבר, ממאגר של חומר מוצא.
החידוש של qPCR הוא בהוספת כימיקלים פלואורסצנטיים לתגובה, המאפשרת להמחיש ישירות את הסינתזה של תוצר PCR בכל מחזור "בזמן אמת" על ידי תרמו-סייקלרים מיוחדים, מה שמאפשר לכמת את כמות רצף התבנית בדגימה המקורית. הכמות נמדדת בדרך כלל במונחים של מחזור הסף, בקיצור Ct, הידוע גם בשם מחזור הכימות או Cq, שהוא מחזור ה-PCR שבו כמות המוצרים הפלואורסצנטיים עולה על רמת הרקע.
כימות יכול להיות יחסי, כאשר ערך ה-Ct של רצף אחד מושווה לזה של תקן או רצף בקרה אחר; הכמות היחסית שווה לשניים בחזקת ההפרש ב-Ct. לחלופין, אם רצים סדרה של DNA בכמות ידועה לצד הדגימות בתגובה, ניתן לייצר עקומה סטנדרטית המשווה את ערך הקרינה לכמות ה-DNA, ומאפשרת לכמת את ה-DNA של הדגימה באופן מוחלט.
ישנם שני סוגים רחבים של מולקולות פלואורסצנטיות המשמשות ב-qPCR. במקרה אחד, צבעים פלואורסצנטיים הנקשרים במיוחד ל-DNA דו-גדילי נכללים בתגובה. הצבע זוהר רק כאשר הוא קשור ל-DNA, ובכך מאפשר לכמת את כמות תוצר ה-DNA הדו-גדילי.
בשיטה השנייה, קטע קצר של DNA, המכונה בדיקה, מתוכנן כנגד רצף מטרה ספציפי של עניין. הגשושית מחוברת כימית לצבע פלואורסצנטי כמו גם למולקולת "מרווה" המדכאת את אות הקרינה מהצבע כאשר היא קרובה. לאנזים הפולימראז, המסנתז את תוצר ה-DNA, יש פעילות מפרקת DNA שתגרום למולקולה הפלואורסצנטית "להשתחרר" מהבדיקה, ובכך להפריד את הצבע מהמרווה ולאפשר לזהות את אות הקרינה.
כעת, כשאתם מבינים את העקרונות מאחורי qPCR, בואו נסתכל על פרוטוקול לשימוש בטכניקה הזו לזיהוי וירוס רנ"א שמדביק צמחים, וירוס הכתמים הקל של הפלפל, מדגימות אדמה.
בהדגמה זו תיאסף דגימה מהריזוספרה, אזור הקרקע כ-7 מ"מ סביב שורשי הצמח המושפע מהשורשים ומהמיקרואורגניזמים הסימביוטיים שלהם.
כדי לאסוף אדמת ריזוספרה, תחילה חלץ בזהירות את הצמח המעניין מהאדמה, ופגע בו כדי להסיר כמה שיותר אדמה בתפזורת. ארוז את הצמח להמשך עיבוד במעבדה.
לאחר החזרת הדגימות למעבדה, השתמש במרית סטרילית כדי לגרד את האדמה הרצויה לתוך כלי איסוף. לאחר מכן, אספו את הנגיף מהאדמה וחלצו את הרנ"א.
לאחר איסוף RNA מהדגימה, המירו אותו ל-DNA משלים או cDNA באמצעות שעתוק הפוך. אנא עיין בסרטון JoVE SciEd בנושא תמלול הפוך-PCR לפרטים על הליך זה.
כאשר מוכנים לבצע את ה-qPCR, יש להפשיר ריאגנטים קפואים בטמפרטורת החדר בתוך מכסה זרימה למינרי ייעודי, ולהניח על קרח לאחר ההפשרה. רכיבי ריאגנטים המכילים את אנזים ה-DNA פולימראז צריכים להישמר תמיד על קרח.
הפשירו את הדגימה cDNA ו-DNA בקרה חיובי, כגון פיסת DNA עגולה המכונה פלסמיד שיש בה את האמפליקון המעניין משובט לתוכה.
לפני הרכבת התגובות בצלחת qPCR של 96 בארות, הכינו תבנית טבלה של 96 תאים על נייר, ותייגו כל תא עם התגובה שתיטען לצלחת. כלול תגובות עבור כל דגימה ותקן בשלוש עותקים, כמו גם עבור הבקרה החיובית והבקרה השלילית, כגון תגובה ללא DNA.
חשב את נפחי הריאגנטים הדרושים לתגובה "תערובת מאסטר", הכוללת את כל הריאגנטים הקבועים בין התגובות. הכן מספיק תערובת מאסטר לתגובות משולשות עבור כל הדגימות בתוספת בקרות, ו-10% נוספים כדי לקחת בחשבון שגיאת פיפטינג.
לאחר הפשרת הריאגנטים, הרכיבו את תערובת המאסטר בצינור מיקרופוגה בעל ספיחה נמוכה של 1.5 מ"ל. לשם כך, מערבל בקצרה כל מגיב לערבוב יסודי, אסוף כל נוזל בצד הצינורות באמצעות מיני צנטריפוגה, ופיפטה את המגיב לתוך צינור המיקרופוגה. הקפד להשתמש בקצות פיפטה חדשות עבור כל רכיב תגובה. לאחר הוספת כל הריאגנטים, מערבולת לערבוב וצנטריפוגה. לאחר מכן, ציין את הכמות המתאימה של תערובת מאסטר לבארות המיועדות על לוחית ה-PCR.
לאחר מכן, מערבולת וצנטריפוגה כל צינור עם דגימה ובקרת DNA, ופיפטה את הכמות המתאימה לבארות המתאימות על לוחית ה-PCR. לאחר הוספת הדגימות, אטמו את הצלחת בנייר כסף והשתמשו בכלי האיטום כדי לשטח את האיטום במלואו ולדחוף החוצה בועות אוויר. קרע בזהירות את הלשוניות הלא דביקות מקצות האטם.
כדי לאסוף את תערובת התגובה במלואה לתחתית הבארות, הנח את צלחת התגובה לצנטריפוגה עם מחזיק צלחת ואזן כראוי את הרוטור עם צלחת משקל נגד. צנטריפוגה דופק את הצלחת עד 1,000 סל"ד, ואז תן לצנטריפוגה לעצור לאט ללא בלמים.
הנח את לוחית התגובה במכונת ה-qPCR. הגדר את תוכנית ה-PCR בהתאם למפרט היצרן, הגדר את טמפרטורת ההיתוך בהתאם לזוג הפריימר שבו נעשה שימוש. הגדר את תוכנית התגובה לפעול.
לאחר השלמת תוכנית ה-qPCR, התוכנה תוכל להשתמש בריכוזים הידועים של הבקרה החיובית כדי לחשב את כמות ה-cDNA בכל תגובה. לאחר מכן ניתן לחשב את כמות הנגיף בדגימה המקורית.
לאחר השלמת תוכנית ה-qPCR, התוכנה תוכל להשתמש בריכוזים הידועים של הבקרה החיובית כדי לחשב את כמות ה-cDNA בכל תגובה.
עם התוצאות מה-qPCR, הנפח המועבר לבארות, השאיבה מהאדמה והגורם מהשעתוק ההפוך, ניתן לחשב את מספר הנגיפים בדגימת הקרקע הראשונית.
כעת, כשאתם יודעים כיצד מבוצע qPCR, בואו נסתכל כיצד ניתן להשתמש בו לניתוח דגימות סביבתיות שונות.
qPCR יכול לשמש כדי לכמת את כמות הנגיפים שהתאוששו מסוגים רבים ושונים של דגימות. ביישום זה, שני סוגים שונים של אדנו-וירוסים רוכזו מדגימות מים במספר שיטות שונות. לאחר מכן חולץ DNA מהנגיפים ונתון ל-qPCR, כדי להעריך את היעילות היחסית של שיטות הריכוז.
יישום נוסף לספירה מיקרוביאלית מבוססת qPCR הוא לכמת את תכולת החיידקים בדגימות מזון וחקלאות - בדוגמה זו, דגימות צואה ופסולת מחוות תרנגולות. במקום להתמקד במינים בודדים, המדענים ביצעו qPCR באמצעות פריימרים כנגד גן שמור מאוד שנמצא בכל החיידקים וכימתו את קהילת החיידקים הכוללת שנמצאה בדגימות.
לבסוף, כפי שהוזכר קודם לכן, חיסרון אחד של מתודולוגיית qPCR מסורתית הוא שלא ניתן להבחין בין חיידקים חיים ומתים. עם זאת, על ידי הוספת כימיקל המכונה פרופידיום מונואזיד, או PMA, שיכול להיכנס רק לתאים מתים שבהם הוא נקשר ל-DNA כדי לעכב תגובות אנזימטיות עוקבות כמו PCR, החוקרים כאן הצליחו להבחין בין תרביות חיות ומתות של E. coli O157:H7, זן פתוגני נפוץ שנמצא במזון ובמים מזוהמים.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לכימות מיקרואורגניזמים ווירוסים סביבתיים באמצעות qPCR. כעת עליכם להבין כיצד qPCR עובד, כיצד להשתמש ב-qPCR כדי למדוד את כמות המיקרוב בדגימה סביבתית, וכמה יישומים של טכניקה זו. תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does qPCR differ from standard PCR in measuring microorganisms?
qPCR adds fluorescent chemicals to the reaction, allowing real-time visualization of PCR product synthesis at each cycle. This enables quantification of the target DNA sequence in the original sample by measuring the threshold cycle (Ct), the cycle where fluorescent products exceed background. Standard PCR only detects presence or absence of DNA, while qPCR provides quantitative measurement.
Q2: What is the threshold cycle and why is it important in qPCR analysis?
The threshold cycle (Ct), also called the quantification cycle (Cq), is the PCR cycle at which fluorescent product signal exceeds background noise. It is important because it directly correlates to the amount of target DNA in the original sample. Lower Ct values indicate more starting template, allowing researchers to quantify microorganism concentrations by comparing Ct values between samples and known standards.
Q3: What are the two main types of fluorescent molecules used in qPCR?
The first type uses fluorescent dyes that bind specifically to double-stranded DNA and only fluoresce when bound. The second uses a probe—a short DNA sequence designed against a specific target—chemically attached to both a fluorescent dye and a quencher molecule. When the polymerase degrades the probe during synthesis, the dye separates from the quencher, allowing fluorescence detection.
Q4: Why can qPCR detect microorganisms that culture-based methods cannot?
qPCR identifies microorganisms by detecting specific DNA sequences rather than requiring live cultures. Since only 1 to 10 percent of environmental microorganisms are culturable using classical techniques, qPCR enables detection of non-culturable species. However, qPCR detects DNA from both living and dead organisms, limiting its ability to distinguish actively growing microbes from inactive populations.
Q5: How is rhizosphere soil collected for qPCR virus detection?
Rhizosphere soil is the zone approximately 7 millimeters around plant roots influenced by roots and their symbiotic microorganisms. To collect it, carefully extract the plant from the ground and remove excess bulk soil by striking it. Package the plant for lab processing, then use a sterile spatula to scrape the desired soil into a collection vessel for virus extraction and RNA analysis.
Q6: What role does propidium monoazide play in distinguishing live from dead microorganisms?
Propidium monoazide (PMA) is a chemical that enters only dead cells, where it binds to DNA and inhibits subsequent enzymatic reactions like PCR. By adding PMA before qPCR, researchers can selectively prevent amplification from dead microorganisms, allowing differentiation between viable and non-viable populations. This overcomes a major limitation of standard qPCR methodology.
Q7: How can qPCR quantify total bacterial communities in environmental samples?
Rather than targeting individual bacterial species, scientists design qPCR primers against highly conserved genes found in all bacteria. This approach quantifies the total bacterial community present in samples such as food, agricultural, or fecal samples. By measuring the combined DNA from all bacteria, researchers obtain an overall assessment of bacterial content without identifying specific species.