כימות מיקרואורגניזמים סביבתיים ווירוסים באמצעות qPCR

1. איסוף דוגמאות

1. לאסוף אדמה באמצעות אוגר או את חפירה לעומק נחוש. אם אוספים אדמה מהקרניזון, אוספים אדמה רק בתוך 7 מ"מ סביב שורש הצמח, על ידי פגיעה באדמה עודפת מהשורש ושריטת האדמה הרצויה לחבית איסוף.
2. מניחים בקבוק נלג'ין סטרילי במקל טבילה. החזק את קצה המקל ולאסוף מים על ידי בקבוק שקוע. מניחים את הבקבוק בצידנית עם קרח.
3. העבר דגימות למעבדה.

2. מיצוי חומצות גרעין

1. כדי לבודד מיקרואורגניזמים מהדגימות שנאספו ולחלץ מהם דנ"א ו/או רנ"א, אנא עיין בסרטון החינוך המדעי של JoVE על הפקת חומצת גרעין קהילתית.

3. תמלול הפוך

1. אם החומר הגנטי שנבחנ הוא RNA, יש להשתמש בו כדי ליצור DNA משלים (cDNA) באמצעות תמלול הפוך לפני שתמשיך ל- PCR. לפרטים, אנא עיינו בסרטון החינוך המדעי של JoVE ב- RT-PCR.

4. הגדרת qPCR

1. יש לאחזר ריאגנטים המאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, ולהפשיר אותם על קרח או בטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע הנקי. ריאגנטים המשמשים בדוגמה זו כוללים את תמהיל התגובה של qPCR (התלוי במכונת qPCR המשמשת; מכיל פולימראז DNA), פריימרים קדמיים והופכים, ואת הבדיקה TaqMan. רצפי הפריימר והגשוש מתוכננים עם רצפים ספציפיים לאורגניזם שנמנה. עיין בספרות הנוכחית כדי למצוא רצפים של עניין. בדוגמה זו, Roche אור מחזור 480 בדיקות לערבב מערכת ריאגנט ישמש. נגיף מנומר קל פלפל יומר בדגימת המים. ^1,2 ראה טבלה 1 עבור פריימר ורצפי בדיקה.
2. הפשרה שחולצה (ג) DNA מדגימות ואת ה- DNA שליטה חיובית (המורכב רצפים ספציפיים לאורגניזם משובטים לתוך plasmids חיידקי) בטמפרטורת החדר.
3. הכן תבנית טבלה בת 96 תאים הדומה ללוח qPCR בן 96 הבאר. סמן כל תא בתגובה שתיטען על הצלחת. כלול תגובות עבור כל דגימה ותקן משולש, כמו גם עבור שליטה חיובית ושליטה שלילית, כגון תגובה ללא DNA.
4. חשב את כרכים ריאגנט הדרושים עבור תגובה "תערובת מאסטר", הכולל את כל הריאגנטים כי הם קבועים בין התגובות, בהתבסס על הוראות היצרן ואת הספרות. הכן מספיק תערובת מאסטר לתגובות משולשות עבור כל הדגימות בתוספת פקדים, ו-10% נוספים כדי להסביר שגיאת צנרת. למתכון לתערובת ראשית לדוגמה, עיין בטבלה 2.
5. עבודה בתוך מכסה המנוע נקי, ברגע שכל הריאגנטים מופשרים לחלוטין, הוסיפו כמות מחושבת של כל ריאגנט לצינור מיקרו-קשירה נמוך של 1.5 מ"ל כדי ליצור תערובת ראשית. מערבולת וקצרה minicentrifuge כל ריאגנט לפני הוספת. שנה את קצה הפיפטה בין כל ריאגנט כדי למנוע זיהום ולהבטיח ריכוזים נכונים. לאחר כל ריאגנטים נוספו, מערבולת וצינור minicentrifuge עם תערובת מאסטר כדי להבטיח הומוגניות.
6. Aliquot את הנפח המתאים של תערובת מאסטר לתוך כל באר ייעודית בצלחת PCR 96 טוב.
7. הוסף את הנפח המתאים של (ג) דגימת DNA, plasmid שליטה חיובית, ושליטה שלילית (מים כיתה מולקולרית) לתוך בארות ייעודיות.
8. לאחר שכל הדגימות והפקדים נוספו, צלחת איטום עם רדיד איטום. השתמש בכלי איטום כדי לדחוף אוויר מתחת רדיד הכסף ולמנוע בועות. תקרעו את קצוות נייר הכסף בזהירות.
9. צנטריפוגות צלחת 96 באר אטום בצנטריפוגה עם מחזיק צלחת כדי לאסוף תערובת בתחתית כל באר. הקפד להשתמש בצלחת משקל נגד כדי להבטיח כי הצנטריפוגה תהיה מאוזנת כראוי בעת סיבוב. צנטריפוגה דופק עד 1000 סל"ד, ולאחר מכן לתת צנטריפוגה לאט לעצור ללא בלמים.

5. פעולת qPCR

1. מניחים צלחת אטומה 96-באר לתוך מכונת qPCR. ודא שהמחשב מציין שהוא מוכן להפעלה.
2. בצע את הוראות מחשב qPCR כדי להזין כראוי את כל המידע הדרוש לתוכנה ולאחר מכן הגדר את מחשב qPCR לפעול.
3. לאחר שהמכונה תשלים את ההפעלה, התוכנה תוכל להשתמש בריכוזים הידועים של הפקד החיובי כדי לחשב את כמות cDNA בכל תגובה. לאחר מכן ניתן לחשב את כמות הנגיף במדגם המקורי, בהתבסס על תהליכי הדילול, הסינון, הריכוז, ההגברה ו/או החילוץ המבוצעים כדי להשיג את דגימת ה- DNA.

מגיב	רצף (5' → 3')	נפח (μL / well)	קונק סופי.
פריימר קדמי	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 ננומטר
פריימר הפוך	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 ננומטר
בדיקה	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 ננומטר

טבלה 1. פריימר מדגם ורצפי בדיקה לאיתור וירוס מנומר קל פלפל.

מגיב	נפח (μL / well)	מספר וולס	אמצעי אחסון מיקס ראשי (μL)
תערובת LC 480	12.5	26	325
מולקולרית H2O	4.5		117
פריימר קדמי	2.25		58.5
פריימר הפוך	2.25		58.5
בדיקה	1.0		26
סך	22.5		585

טבלה 2. כרכים ריאגנט לתגובה אישית ותערובת מאסטר.