Question 1

במה שונה qPCR מ-PCR סטנדרטי במדידת מיקרואורגניזמים?

Accepted Answer

בשיטת qPCR מתווספים חומרים פלואורסצנטיים לתגובה, המאפשרים ויזואליזציה בזמן אמת של סינתזת תוצרי ה-PCR בכל מחזור. דבר זה מאפשר כימות של רצף ה-DNA המטרה בדגימה המקורית על ידי מדידת מחזור הסף (Ct), שהוא המחזור שבו תוצרי הפלואורסצנציה עולים על רמת הרקע. PCR סטנדרטי מזהה רק נוכחות או היעדר של DNA, בעוד ש-qPCR מספק מדידה כמותית.

Question 2

מהו מחזור הסף (threshold cycle) ומדוע הוא חשוב בניתוח qPCR?

Accepted Answer

מחזור הסף (Ct), המכונה גם מחזור הכימות (Cq), הוא מחזור ה-PCR שבו אות המוצר הפלואורסצנטי עולה על רעשי הרקע. ערך זה חשוב מכיוון שהוא נמצא במתאם ישיר לכמות ה-DNA של מטרה בדגימה המקורית. ערכי Ct נמוכים יותר מעידים על כמות גדולה יותר של תבנית התחלתית, ובכך הם מאפשרים לחוקרים לכמת ריכוזי מיקרואורגניזמים על ידי השוואת ערכי Ct בין דגימות לבין תקנים ידועים.

Question 3

מהם שני הסוגים העיקריים של מולקולות פלואורסצנטיות המשמשים ב-qPCR?

Accepted Answer

הסוג הראשון משתמש בצבעים פלואורסצנטיים הנקשרים באופן ספציפי ל-DNA דו-גדילי ופולטים פלואורסצנציה רק כאשר הם קשורים. הסוג השני משתמש בגשושית (probe) – רצף DNA קצר שתוכנן כנגד מטרה ספציפית – המחוברת כימית הן לצבע פלואורסצנטי והן למולקולת מעכב (quencher). כאשר הפולימראז מפרק את הגשושית במהלך הסינתזה, הצבע נפרד מהמעכב, מה שמאפשר גילוי של הפלואורסצנציה.

Question 4

מדוע qPCR יכול לזהות מיקרואורגניזמים ששיטות מבוסות תרבית אינן יכולות לזהות?

Accepted Answer

qPCR מזהה מיקרואורגניזמים באמצעות גילוי רצפי DNA ספציפיים, ובכך אינו דורש תרביות חיות. מכיוון שרק 1 עד 10 אחוזים מהמיקרואורגניזמים הסביבתיים ניתנים לתרבית באמצעות טכניקות קלאסיות, qPCR מאפשר זיהוי של מינים שאינם ניתנים לתרבית. עם זאת, qPCR מזהה DNA הן מאורגניזמים חיים והן ממתים, דבר המגביל את יכולתו להבחין בין מיקרובים הגדלים באופן פעיל לבין אוכלוסיות לא פעילות.

Question 5

כיצד נאספת אדמת ריזוספירה לצורך גילוי נגיפים באמצעות qPCR?

Accepted Answer

קרקע הריזוספירה היא האזור שסביב שורשי הצמחים, בטווח של כ-7 מילימטרים, המושפע מהשורשים וממיקרואורגניזמים סימביוטיים. כדי לאסוף אותה, יש להוציא בזהירות את הצמח מהקרקע ולהסיר את עודפי האדמה על ידי נקישה. יש לארוז את הצמח לצורך עיבוד במעבדה, ולאחר מכן להשתמש בשפכטל סטרילי כדי לגרד את הקרקע הרצויה אל תוך כלי איסוף לצורך הפקת נגיף ואנליזת RNA.

Question 6

מהו התפקיד של propidium monoazide בהבחנה בין מיקרואורגניזמים חיים למתים?

Accepted Answer

פרופידיום מונואזיד (PMA) הוא חומר כימי החודר לתאים מתים בלבד, שם הוא נקשר ל-DNA ומעכב תגובות אנזימטיות עוקבות כגון PCR. על ידי הוספת PMA לפני ביצוע qPCR, חוקרים יכולים למנוע באופן סלקטיבי הגברה של מיקרואורגניזמים מתים, ובכך לאפשר הבחנה בין אוכלוסיות חיות לאוכלוסיות שאינן חיות. פתרון זה מעניק מענה למגבלה מרכזית של מתודולוגיית qPCR סטנדרטית.

Question 7

כיצד יכולה שיטת qPCR לכמת קהילות חיידקים כוללות בדגימות סביבתיות?

Accepted Answer

במקום להתמקד במיני חיידקים בודדים, מדענים מתכננים פריימרים ל-qPCR כנגד גנים שמורים מאוד הנמצאים בכל החיידקים. גישה זו מאפשרת לכמת את כלל קהילת החיידקים הנוכחת בדגימות כגון מזון, דגימות חקלאיות או דגימות צואה. על ידי מדידת ה-DNA המשולב מכל החיידקים, חוקרים מקבלים הערכה כללית של התוכן החיידקי ללא זיהוי של מינים ספציפיים.

כימות מיקרואורגניזמים סביבתיים ווירוסים באמצעות qPCR - חידון הערכה