זיהוי בקטריופאג'ים בדגימות סביבתיות

1. להשיג מדגם של ביוב או מים המכילים קוליפייג '.
2. לדלל את המדגם 1: 10 ו 1: 100 באמצעות מאגר טריס. עשה זאת על-ידי העברת 1.0 מ"ל של תרבות ל- 9 מ"ל של חיץ טריס, ולאחר מכן ביצוע דילול כפול שני.
3. ממיסים שלושה צינורות של אגר רך (0.7% אגר או אגר סויה טריפטיאז לכל צינור 3 מ"ל) על ידי הצבתם באמבט אדים או אוטוקלבה.
4. מניחים את אגר באמבט מים ב 45-48 °C (55 °F) במשך 15 דקות כדי לאפשר את הטמפרטורה של אגר כדי להתאים ל 45 °C (5 °F).
5. לצינור הראשון, להוסיף 1 מ"ל של תרבות מרק שלב בול עץ של E. coli¹ ו 1 מ"ל של מדגם לא מדולל.
6. מוציאים את הצינור מאמבט המים ומנענעים בעדינות בין הידיים כדי לערבב את המתלים במשך 2-3 s.
7. לנגב את המים מן הצינור עם מגבת נייר ויוצקים את אגר על צלחת פטרי שהוכן בעבר המכיל אגר תחתון (אגר מיזים רגיל או אגר סויה טריפטיאז).
8. סובב במהירות את הצלחת כדי לפזר את אגר העליון. תוודא שהאג מכסה את כל פני השטח.
9. חזור על שלבים 5-8 עם שני הצינורות האחרים של אגר רך, באמצעות 1 מ"ל של חיידקים ו 1 מ"ל של כל דילול מדגם(איור 2).
10. לאחר שהאג מתמצק, הפוך את מנות הפטרי ודגר ב 37 °C (48 שעות). תורידו כל לחות מהמכסה של צלחת הפטרי. אם טיפת לחות נופלת על לוח זה יגרום הנגיף להתפשט על פני אגר.
11. לאחר הדגירה, ספרו את מספר הלוחות על כל דילול(איור 3)וחשבו את ריכוז הפאג' במדגם המקורי. תיעדו הבדלים משמעותיים בגודל או במראה של הלוחות.

איור 2. הליך להכנת מדשאה חיידקית באמצעות אגר עליון לספירת קוליפייג'.

איור 3. לוחות פאג' על מדשאה חיידקית.

¹E. זן קולי ATCC 15597 בדרך כלל יפיק את המספר הגדול ביותר של לוחות מדגימות ביוב. זה צריך להיות גדל לילה בקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל המכיל 100 מ"ל של מרק סויה מיז'ן או טריפטיאז ודגרה בתנאים רועדים ב 35 °C .3 שעות לפני חיטוי phage לחסן mL אחד של תרבות זו לתוך בקבוקון טרי המכיל 100 מ"ל של מרק סויה מיז'ן או טריפטיאז ומניחים באמבט מים רועד ב 35-37 °C (35°F). זה יבטיח שהחיידקים נמצאים בשלב היומן של הצמיחה.