בידוד חיידקים צואתיים מדגימות מים על ידי סינון

1. איסוף ועיבוד דוגמאות מים

1. לאסוף כמה דגימות מים 1-L ממקור המים הבדיקה (למשל מזרקות מים, בריכות שחייה, מאגרים, מערכות חלוקת מים, שפכים גולמיים או מטופלים), והובלה על קרח למעבדה לניתוח מיקרוביאלי.
2. לחטא או לחטא את ההרכבה סעפת סינון הממברנה לפני השימוש על ידי autoclaving, חשיפה לקרינת UV (2 דקות), או הצתת להבת אתנול.
3. עם קירור כל החלקים, חברו כראוי את הסעפת למשאבת ואקום ולבקבוקון פסולת סינון ואקום המכיל אקונומיקה.
4. להבת אתנול מחטאת זוג מלקחיים ואיתם מסירים מסנן ממברנה סטרילי ומרושת מאריזה. ממברנות בקוטר 47 מ"מ עם גודל נקבובית 0.45-מיקרומטר משמשים בדרך כלל. עם זאת, ניתן להשתמש בקטרים חלופיים ובגודלי נקבוביות בתנאי שגודל הנקבבובית יכול ללכוד במידה מספקת את המיקרואורגניזמים של היעד, ולפחות 70% משטח המסנן מורכב משטח נקבוביות.
5. מניחים את המסנן על מרכז אזור סינון הממברנה של הסעפת, ומחילים משפך מסנן סטרילי על היחידה ומאבטחים אותו במקומו.
6. מדוד את הנפח הרצוי של מי בדיקה(למשל 100 מ"ל) והוסף אותו למשפך (סימן קו 100 מ"ל גלוי על המשפך).
7. החל ואקום חלקי [הפרש לחץ של 34 עד 51 kPa (קילוPascals)] על מנת לצייר את דגימת הבדיקה דרך המסנן. סה"כ חומר מוצק מושעה, כולל חיידקים וחומר אורגני מתפורר, גדול יותר מאשר גודל הנקבבובית הממוצע מסנן של 0.45 מיקרומטר לכודים על המסנן. חלקיקים קטנים יותר כולל וירוסים ומוצקים מומסים כגון כמויות קטנות של חומר אורגני ומלחים, יעברו דרך הממברנה לתוך בקבוק ואקום מיכל הפסולת המכיל אקונומיקה.
8. לאחר מעבר מלא של המדגם דרך המסנן, לשטוף את הפנים של המשפך עם שניים עד שלושה 20-30 מ"ל כמויות של מים סטריליים.
9. לכבות את הוואקום ולהסיר את המשפך מן הסעפת עם סגירת השטיפה הסופית.
10. עם מלקחיים מעוקרים להבת אתנול, הסר מיד את מסנן הממברנה מהיחידה והנח אותו מיד על מדיום הצמיחה המתאים למיקרואורגניזם היעד (טבלה 1 מפרטת את אמצעי הצמיחה ותנאי הדגירה המומלצים לכל אחד מהם).
11. החל את מסנן הממברנה על משטח אגרוז עם תנועה מסוג גליל כדי להבטיח מגע מלא של הממברנה עם מדיום הצמיחה, כדי למנוע את מלכוד של בועות אוויר.
12. החלף את משפך הסינון המשומש ביחידה סטרילית בין העיבוד של כל דגימה, וחטא אתל סעפת נירוסטה כדי למנוע זיהום צולב.

2. הספירה למושבה

1. לאחר תקופת הדגירה, להסיר את לוחות הצמיחה מן האינקובטור לספירה.
2. באופן אידיאלי, בצע את ספירת המושבה תחת הגדלה של צריכת חשמל נמוכה באמצעות מקור אור לבן וקריר.
3. סה"כ קוליפורמים
   1. מושבות קוליפורם הכוללות הן בדרך כלל ורודות עד אדומות כהות בצבע עם ביהק משטח מתכתי. ההבהמה עצמה עשויה לכסות חלקית או מלאה את המושבה. מורפולוגיות מושבה קוליפורמיות לא טיפוסיות עשויות להיות אדומות כהות, ריריות או מגושמת ללא ברק.
   2. מושבות ורודות, כחולות, לבנות או חסרות צבע בהיעדר ביהר נחשבות ללא קוליפורמים.
4. קוליפורמים צואתיים
   1. מושבות קוליפורם צואתיות מופיעות כגוונים שונים של כחול.
   2. מושבות קוליפורם לא דביקות אפורות לקרם בצבע.
5. צואה אנת'קוקוצ'י
   1. מושבות צואה אנתרוקוצ'י נעות בין ורוד לאדום כהה בצבע.

3. אימות מושבה

1. סה"כ קוליפורמים
   1. לאימות נוכחות-היעדרות, ספוגית הממברנה כולה באמצעות לולאת חנק סטרילית. עבור מושבות, עדיף לאמת לפחות חמש כל אחת מהמורפולוגיות האופייניות והבלתי טיפוסיות.
   2. מעבירים את המושבה שנבחרה לכלי זכוכית המכיל ציר טריפטוז לאוריל עם צינור דורהאם. לדגור על הצינורות המחוסנים ב 35±0.5 °C (5 °F) עבור 48 שעות. נוכחות של עכוז המציין צמיחה בשילוב עם הפקת גז מאמתת את המושבה כקולפורם.
2. קוליפורמים צואתיים
   1. העבר מושבות כחולות בצבע באופן הפוך לכלי זכוכית המכילים מדיום EC סטרילי עם צינור דורהאם. לדגור על הצינורות המחוסנים ב 44.5 ± 0.2 °C (24 °F). נוכחות של עכוז המציין צמיחה בשילוב עם הפקת גז מאמתת את המושבה כקולפורם צואתי.
3. צואה אנת'קוקוצ'י
   1. מושבות שביתה המאפות את המורפולוגיה של אנתרוקוצ'י צואה לבידוד באופן אסטפטי על אגר עירוי המוח-לב (BHIA), ודגרה ב 35 ± 0.5 °C (5 °F) עבור 24 עד 48 שעות.
   2. העבר צמיחה ממושבה מבודדת על BHIA על שתי שקופיות זכוכית מנוקה מראש.
   3. הוסף שתיים עד שלוש טיפות של 3% מי חמצן כדי להכין מריחות על השקופיות. המראה המהיר של בועות מצביע על תוצאה "קטלס חיובית", ואת לבודד אינו חיידק סטרפטוקוקוס צואה.
   4. בצע כתם גרם לבדיקות מבודדות כ"קטלס שלילי " (לא נצפו בועות). צואה enterococci הם גרם חיובי, ביצות, ומופיע בעיקר בזוגות או שרשראות קצרות.

מחוון חיידקי צואתי	מדיה מומלצת (טמפרטורת הדגירה, זמן) 1
סה"כ קוליפורמים	LES אנדו אגר (35 ± 5 °C (5 °F), 24 שעות) M-Endo בינוני (35 ± 5 °C (5 °C), 24 שעות)
קוליפורמים צואתיים	בינוני m-FC (44.5 ± 0.2 °C (5 °F), 24 שעות)
צואה אנת'קוקוצ'י	m אנטרוקוקוס אגר (35 ± 0.5 °C (5 °F), 48 שעות)

טבלה 1. מדיה צמיחת תרבית נפוצה לאיתור אינדיקטורים חיידקיים צואתיים בדגימות סביבתיות
¹ כפי שהומלץ על ידי השיטות הסטנדרטיות לבחינת מים ושפכים (איגוד בריאות הציבור האמריקאי והאגודה האמריקאית לעבודות מים, מהדורה^22, 2012)