ניהול מתחם III

Compound Administration III

JoVE Science Education
Lab Animal Research

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Lab Animal Research

Compound Administration III

5.7: Compound Administration II

5.14: Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest

32,133 Views

•

12:34 min

•

August 24, 2015

Overview

מקור: קיי סטיוארט, RVT, RLATG, CMAR; ואלרי א. שרודר, אר.די.ג’י, אר-אל-ג’י. אוניברסיטת נוטרדאם, IN

ישנם מסלולים נפוצים רבים לניהול מורכב בעכברים במעבדה וחולדות. עם זאת, פרוטוקולים מסוימים עשויים לדרוש שימוש בנתיבים פחות נפוצים, כולל זריקות תוך-עוריות, תוך גולגולתיות ותוך גולגולתיות. הכשרה מיוחדת חיונית להליכים אלה להתבצע בהצלחה. ייתכן שיהיה צורך בהצדקה למסלולים אלה כדי לקבל אישור של ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC).

Principles

לינג’ים תוך-דרמה מועברים לשכבות החיצוניות של הדרמיס, מתחת לשכבת העור העליונה (האפידרמיס). מסלול הזרקה זה שמור בדרך כלל להערכת דלקת, אבחון זרימת דם עורית, או תגובות אלרגניות לאנטיגן.

למרות המשמש לעתים קרובות עבור משלוח מקומי של חיסונים או תרסיס decongestant, ניהול תוך נאוי יכול לשמש גם עבור משלוח מערכת העצבים המערכתית והמרכזית (CNS). הרירית המיישרת את חלל האף כוללת אספקה עשירה של כלי דם ועצבים המאפשרים ספיגה מערכתית מהירה ומיקוד ישיר למערכת העצבים המרכזית. חומרים המורכבים ממולקולות ליפופיליות קטנות יש שיעור ספיגה הרבה יותר מאשר אלה המכילים מולקולות גדולות יותר. ²

למרות הרדמה אינו נדרש עבור הליך זה, זה יכול להקל על מיקום נכון של המתחם ב nares, הבטחת מנונים מדויקים. הוכח כי בעלי חיים מרדים יש משלוח גדול פי חמישה של תרופה למוח לעומת חיה מודעת. ² חולדות לא מנוטות עמידות מאוד בפני ניהול תוך-אנליסטי. עם זאת, יש מחקר שהפגין טכניקות מסירה יעילות לניהול תוך-נאואלי של חולדות נעות בחופשיות. ³ בנוסף, בעלי חיים התראה עשויים לנסות לנשוך את קצה פיפטה, או מחט, מה שהופך את המסירה של החומר קשה.

היתרונות לניהול תוך-נאואלי הם שטכניקה זו דורשת אימון ומיומנות מינימליים, והיא אינה פולשנית לחיה. עם זאת, בשל האפשרות של אירוסוליזציה, מומלץ להשתמש בארון בטיחות ביולוגית והגנה על העיניים, במיוחד כאשר עובדים עם בעל חיים מודע. יתר על כן, כדי למנוע הטבעת בעלי החיים, המינון הקטן ביותר האפשרי יש להשתמש. אם בכל עת במהלך הליך זה כיחלון, נשימה בפה, או סימנים אחרים של מצוקה נראים בבעלי החיים, ההליך צריך להיות בוטל מיד.

זריקות תוך גולגולתיות בעכברים מבוגרים וחולדות משתמשות בציוד סטריאוטקסי כדי להבטיח את המיקום והעומק הנכונים של ההזרקה. עם זאת, בעכברים 3 עד 28 ימים של גיל, וחולדות עד 14 ימים של גיל, הגולגולת היא רזה מספיק כדי להזריק ישירות דרכו; הוא שביר מכדי לתמוך במכשיר הסטריאוטקסי. העכבר או גורי החולדה צריכים להישאר עם האם עד ההליך, והם צריכים להיות מוחזרים אליה בהקדם האפשרי לאחר השלמת ההליך. טיפול לאחר ההסתה כולל ניטור רציף על מקור חום עד תנועה רגילה והתנהגויות, כולל סיעוד, נצפים. הסיבה העיקרית להשתמש בטכניקה זו היא לספק סוכנים פרמקולוגיים למערכת העצבים המרכזית הדורשים לחצות את מחסום הדם – מוח, או כדי למנוע את ההשפעות הכרוכות במסלול המערכתי. ¹

Procedure

1. ניהול תוך-עורי

רוב זריקות תוך עוריות הן תרכובות מבוססות מימיות. הפתרונות חייבים להיות חוצצים פיזיולוגית כדי לקבל pH נייטרלי, על מנת למנוע נמק רקמה באתר ההזרקה.
טווח גודל המחט הוא 25-30 מד, הקטן ביותר האפשרי.
טווח המינון לכל אתר הזרקה הוא 50-100 μL. הזרקת נפחים מוגזמים עלולה לגרום לנמק באתר ההזרקה או לדליפת המתחם מהאתר עקב לחץ.
עבור מיקום מדויק של המחט לתוך החלל התוך עורי, יש צורך למרדים הן עכברים והן חולדות. הרדמה שאיפה מאפשרת אינדוקציה מהירה והתאוששות; עם זאת, הרדמה להזרקה יש את היתרון של מתן מספיק זמן להכנת האזור וביצוע הזריקה. ¹
הסר את השיער באתר ההזרקה באמצעות קרם depilatory או על ידי גילוח האזור.
יש להסיר ביסודיות כל שאריות של קרם דפילטרי או פסולת שיער.
החל חיטוי אקטואלי, כגון פתרון יוד, פתרון כלורהקסידין, או אלכוהול.
נהלי ניהול
1. מתחו את העור מתוח בין האגודל לאצבע המורה. זה מספק יציבות לעור בעת מיקום המחט.
2. מניחים את המחט משופעת על העור.
3. הכנס בעדינות את המחט לתוך העור בין האפידרמיס והדרמיס. לקדם את המחט ממש מעבר שיכול.
4. הזריקו את החומר לאט. הזרקת המתחם תיצור bleb, או שלפוחית קטנה, בעור.
5. השהה לאחר ההזרקה כדי לאפשר לעור למתוח ולהתאים לפני משיכת המחט.
אמצעי זהירות
1. אין צורך לסגת בבוקעת.
2. אם המחט מוכנסת לחלל התת עורי, לא נוצר bleb. הזרקת עמוק מדי גורמת לזריקה תת עורית.
3. הימנע נפיחות או ניגוב האזור, כמו זה יכול לגרום המתחם לדלוף מאתר ההזרקה.
4. בעת ביצוע זריקות מרובות, רווח אותם כך blebs לא חופפים.

איור 1. הזרקה תוך עורית בעכברים.

2. ניהול תוך-נאואלי

ציוד
1. השתמש בצינור יחידת מיקרו-פיקפיק שניתן לכייל כדי לספק נפח מדויק.
2. יש להשתמש בטיפים חד פעמיים לפיפטה כדי למנוע זיהום צולב. מזרקי שחפת, מחטים קהות וצינורות גמישים יכולים לשמש גם למינום.
3. נפחי הזרקה הכולל עבור חולדות לא יעלה על 40-100 μL, ויש לתת 6-10 טיפות μL. עבור עכברים, הנפח הכולל המרבי הוא 24 μL, נתון 3-4 טיפות μL.
ניהול בבעלי חיים מודעים
1. איפוק ידני בבעלי חיים מודעים דורש כי הראש להיות יחסית חסר תנועה, כך קצה פיפטה או מחט קהה ניתן להציב קרוב מספיק nares כדי לספק את המתחם, אבל לא כל כך קרוב כמו לתקוע או לקרוע את רקמת האף.
2. לרסן את החיה ולהחזיק אותו במצב אנכי.
3. מניחים טיפה קטנה של תרכובת נוזלית בפתח האף. החיה צריכה לשאוף את הטיפה.
4. נהל אמצעי אחסון נוסף, ערך נלווה לסירוגין עד להינתן אמצעי האחסון כולו.
5. בעת מתן כרכים גדולים יותר, חשוב לא לכווץ את החזה במהלך איפוק. דחיסת חזה פוגעת ביכולתו של בעל החיים לנשום נשימות עמוקות מספיק כדי למשוך את הנוזל לתוך הסימפונות והריאות.

איור 2. ניהול תוך-נאוי בעכברים מודעים.

ניהול בבעלי חיים חסרי הכרה
1. שימוש בהרדמה משאיפת אלכוהול מאפשר בעל חיים משותק במהלך הגישה והלידה של המתחם. זה מבטל את האפשרות של החיה לנשוך את ציוד מנון, אובדן המתחם עקב jerking של הראש, ופגיעה ברקמת האף של החיה, עיניים, או עור הפנים. החיה גם פחות סביר להסניף ולרסס את המתחם מן nares על הממשל.
2. מניחים את החיה בתנוחה השופית. מיקום הראש משפיע על מיקום הפתרון ב nares. הוכח כי המיקום האידיאלי עבור משלוח מערכת החולים הוא עם supine בעלי חיים; זה מאפשר ספיגה טובה יותר. ²
3. לנהל מחצית המתחם ישירות לתוך צד אחד של פתח האף, תזמון זה עם שאיפה. ואז, להפוך את החיה מעל.
4. כאמור, נהל את החצי השני של הנפח לתוך פתח האף האחר.

איור 3. ניהול תוך-נאוי בעכברים מחוסרי הכרה.

3. ניהול תוך גולגולתי בעכברים וחולדות יילודים

עכברים או חולדות חייבים להיות מרדים לזריקות תוך גולגולתיות.

עכבר		חולדה
גיל (ימים)	מד מחט (גרם)	גיל (ימים)	מד מחט (גרם)
0-7	29-30	0-5	27-29
7-14	27	5-10	25-27
14-28	25	10-14	25
גיל (ימים)	אורך המחט (מ”מ)	גיל (ימים)	אורך המחט (מ”מ)
0-7	2	0-4	2-3
7-14	3	4-7	3
14-21	4	7-10	4
21-28	5	10-14	5
גיל (ימים)	אמצעי אחסון (μL)	גיל (ימים)	אמצעי אחסון (μL)
0-5	<20	1-3	<20
6-20	<60	4-10	<60
20-28	<100	11-14	<100

טבלה 1. מד מחט, אורך מחט ונפח מרבי של ניהול תוך גולגולתי לפי גיל העכברים והחולדות. ⁴

ציוד
1. קבע את מד המחט הנכון ואת נפח הניהול המרבי לפי טבלה 1.
2. הכן שומר מחט לפני שהוא מרדים את החיה.
  הערה: עומק ההזרקה של המחט נשלט באמצעות שומר שנוצר עם מכסה המחט.
  1. כדי ליצור את השומר, מחט נמדדת כנגד מכסה המחט, וסימן ממוקם על הכובע כדי לציין היכן לחתוך. החתך צריך להיעשות כך 2 עד 5 מ”מ של המחט חשופים כאשר המכסה מוחלף על המחט.
  2. אורך המחט החשופה חייב להיות ארוך מספיק כדי לחדור את העור והגולגולת, ולהגיע לעומק הרצוי במוח.
  3. אורכי המחט הדרושים לעכברים וחולדות מפורטים בטבלה 1.
3. מקור חימום נדרש כדי למנוע היפותרמיה אצל הגורים. ישנם מספר סוגים: כרית חימום חשמלית על נמוך, שמיכת מים במחזור, או כיס חום תגובה כימית רב שימוש חוזר.
איפוק
1. עכבר וגורי חולדה 10 ימים ומטה אינם דורשים הרדמה עבור הליך זה. לרסן אותם באופן ידני על ידי החזקתם ממש מאחורי הראש ומשיכת העור בקהילות כדי להפעיל לחץ קל על הכתפיים.
2. גורים מרדים מעל גיל 10 ימים עם שאיפת איזופלוראן. חברו תא אינדוקציה לאידוי מדויק או לצנצנת פעמון עם כדור כותנה ספוג באיזופלוראן. ברגע שהגור משותק, ההרדמה יעילה למשך כ -40 שניות, מה שמספק מספיק זמן להזרקה.
טכניקת הזרקה
1. צייר את החומר לתוך המזרק ומניחים את מדריך הכובע / המחט מעל המחט.
2. נפח ההזרקה המומלץ כמו נפח המרבי לכל עכבר יילודים או חולדה הוא 100 μL, וכי עבור גגמול או עכברים מבוגרים הוא עד 300 μL.
3. כדי להזריק לתוך קליפת המוח של יילודים, להכניס את המחט 5 מ”מ מאחורי העין, כ 3 מ”מ את קו האמצע של הגולגולת.
4. אתר הזרקת העכבר הגומלי נמצא בערך באמצע הדרך בין העין לאוזן, ממש ליד קו האמצע.

איור 4. ניהול תוך גולגולתי בגור עכבר.

לעתים, גישות ניסיוניות שונות מחייבות שימוש בנתיבים פחות נפוצים של ניהול מורכב במכרסמים. תוך-עורית, תוך-גולגולתית ותוך גולגולתית הן שלושה מהמסלולים החלופיים שבהם משתמשים כיום החוקרים הביו-רפואיים במעבדות.

כפי ששמם מרמז, תוך-עורי הוא אספקת תרכובות לתוך השכבות החיצוניות של הדרמיס. Intranasal הוא הצבת הפתרון ב nares של החיה. ואינטרה גולגולתי כרוך בהחדרת המחט ישירות למוחו של המכרסם.

הכשרה מיוחדת חיונית לביצוע הליכים אלה בהצלחה. כאן, נמחיש תחילה את השיקולים של כל אחת מהשיטות הללו ולאחר מכן נדגים את הטכניקות שיעזרו לכם ללמוד את הנהלים תוך הבטחת בטיחות החיה והצלחת הניסוי.

בואו נתחיל עם הדיון מתי מסלולים אלה משמשים בדרך כלל ודברים שיש לזכור לפני שמתחילים לבצע את טכניקות הניהול המיוחדות האלה.

הזריקות תוך עוריות משמשות כדי לספק מאמר לתוך החלל בין האפידרמיס ואת הדרמיס מסלול זה שמור בדרך כלל להערכה של דלקת, אבחון זרימת דם עורית, או תגובות אלרגניות אנטיגן. בדומה לנתיבים אחרים, הפתרון התוך עורי צריך להיות מוכן גם באמצעות הטכניקה סטרילית. וזה חייב להיות חוצץ פיזיולוגית יש pH נייטרלי על מנת למנוע נמק רקמה באתר ההזרקה. מערכת ללא רכזת עם מחט 25-30 מד משמש לעתים קרובות עבור זריקה זו. מערכת זו מסייעת בשמירה על נפח הניהול, הנמצא בטווח של 50-100 מיקרוליטרים לכל אתר הזרקה. הזרקת עודף יכול לגרום נמק או דליפה תרכובת לא רצויה עקב לחץ.

מסלול תוך-נטלי נבחר לעתים קרובות לאספקה מקומית של חיסונים או תרסיס נוגד גודש, כמו גם משלוח מערכתי ומערכת הפעלה. הרירית המיישרת את חלל האף כוללת אספקה עשירה של כלי דם ועצבים המאפשרים ספיגה מערכתית מהירה ומיקוד ישיר למערכת העצבים המרכזית. זוהי שיטה לא פולשנית הדורשת הכשרה מינימלית ומיומנות, וציוד פשוט – מיקרופיט מכויל וכמה טיפים חד פעמיים. נפחי הממשל לחולדות לא יעלה על 40-100 מיקרוליטרים שניתנו ב-6-10 טיפות מיקרוליטר. ולעכברים, הנפח הכולל המרבי הוא 24 מיקרוליטרים שניתנו בטיפות מיקרוליטרים של 3-4.

למרות הרדמה אינו נדרש עבור הליך זה, יש לו כמה יתרונות על פני ניהול תוך נאוי בבעלי חיים מודעים 1) זה מאפשר מיקום נכון של המתחם ב nares, הבטחת מנונים מדויקים 2) מבטל את האפשרות של החיה נושכת את ציוד המינון 3) מבטיח כי אין פגיעה ברקמת האף של החיה, עיניים, או עור הפנים עקב אידיוט של הראש, ו 4) בעלי חיים נוטים פחות להסניף ולרסס את המתחם מן nares עם הממשל.

זריקות תוך גולגולתיות בעכברים מבוגרים וחולדות משתמשות בציוד סטריאוטקסי, המתואר בסרטון באוסף “יסודות מדעי המוח”. הציוד מבטיח מיקום נכון ועומק נכון של הזרקה. כאן, נתמקד במשלוח תוך גולגולתי בעכברים וחולדות בילודים שבהם הגולגולת דקה מספיק כדי להזריק ישירות דרכה, ועשויה להיות שברירית מכדי לתמוך במכשיר הסטריאוטקסי. המטרות העיקריות של טכניקה זו הן לספק סוכנים פרמקולוגיים של מערכת העצבים המרכזית ישירות למערכת העצבים המרכזית, ולהימנע מההשפעות שנתקלו בהן בכל מסלול מערכתי. מד המחט, אורך ונפח הניהול נקבעים על סמך המין וגיל הגורים. שים לב שכות שגיל החיה עולה, מספר המד יורד, אורך המחט הנדרש גדל, ונפח הניהול המרבי המומלץ גדל גם הוא.

עם מידע רקע זה בחשבון, בואו להתעמק בהליכים של שיטות הזרקה אלה. הראשון הוא טכניקת הניהול התוך עורית. הליך זה צריך להתבצע בבעלי חיים מרדים. סקור וידאו אחר באוסף זה כדי להבין את ההליכים עבור אינדוקציה הרדמה ותחזוקה.

לאחר החיה הוא מרדים, לגלח את אתר ההזרקה באמצעות סכין גילוח חשמלי או קרם depilatory. עם גזה שקועה במים, הסירו ביסודיות את השיער המתמשך מהאתר. לאחר מכן, עם כרית גזה אחרת, להחיל פתרון חיטוי אקטואלי לאזור מגולח. עבור הממשל, תחילה לייצב את העור באתר ההזרקה על ידי מתיחתו בין האגודל לאצבע המורה.

עכשיו מניחים את המחט משופעת על העור ומכניסים אותה בעדינות ממש מעבר למעטפת כך שהפתח הוא בין האפידרמיס לשכבות הדרמיס. ואז להזריק לאט ולשים לב שזה יוצר bleb בעור. אם המחט מוכנסת עמוק מדי אז לא ייווצר bleb. לאחר הזרקה, להשהות כדי לאפשר לעור למתוח ולהתאים, ולאחר מכן למשוך את המחט לאט. אל תמשוך בחזרה על הבוכנה בכל עת, כפי שהיית לצייר את הרקמה ולגרום טראומה באתר ההזרקה. כמו כן, לא לנגב או כתם את אתר ההזרקה, כמו זה עלול לגרום לחומר מוזרק לדלוף. בעת ביצוע זריקות מרובות, הקפד לרווח אותם רחב מספיק, כך blebs לא חופפים אחד עם השני.

לאחר מכן, בואו ללמוד את הליך הניהול התוך הרדמה בבעלי חיים מודעים ומורטמים.

עבור בעלי חיים ערים, לרסן אותם על ידי שרבוט העור בעורף הצוואר ולאחר מכן להחזיק את החיה במצב אנכי עם ראשו משותק. היזהר לא לכווץ את החזה כמו זה עלול לעכב את היכולת של החיה לקחת נשימות עמוקות מספיק כדי למשוך את הנוזל לתוך הריאות. באמצעות micropipette, לנהל חלק מהפתרון על ידי הצבת טיפה קטנה של נוזל בפתח האף. החיה תשאף את הטיפה. חזור על תהליך זה, לסירוגין בין שני פתחי האף עד שכל אמצעי האחסון שינוהל ניתן. זוכר – הנפח הכולל של הממשל לא יעלה על 24 μl ו 100 μl בעכברים וחולדות, בהתאמה.

עבור עכברים וחולדות מרדים, הנח את החיה בתנוחת חזרה הגב. עמדה זו אידיאלית עבור משלוח מערכת מכונה כפי שהוא מאפשר ספיגה טובה יותר של המתחם. לסובב את הראש של החיה ולנהל מחצית המתחם ישירות לתוך צד אחד של פתח האף, תזמון זה עם שאיפה. לאחר מכן, סובב את ראש החיה לעמדה עבור הממשל הבא. לאחר 2 נשימות בערך, לנהל את הנפח הנותר לתוך פתח האף השני. לאחר ניהול מלא, להחזיר את החיה בחזרה לכלוב שלה.

לאחר מכן, בואו לסקור את הליך ניהול תוך גולגולתי עבור עכברים יילודים וחולדות. לפני תחילת ההליך, מניחים את הכלוב עם הגורים והסכר על כרית חימום חשמלית מוגדר נמוך. ודא שחלק מהכלוב נמצא מחוץ למשטח החימום. זאת כדי למנוע היפותרמיה, ובאותו הזמן, לאפשר לסכר להתרחק מהחום אם היא רוצה. לאחר מכן, בחר מד מחט המתאים לגיל החיה. זוכר, מד המחט; אורך המחט, המשמש לשליטה בעומק המחט במהלך ההזרקה תוך גולגולתית; ונפח הניהול… כולם משתנים בהתאם לגילם ולמיניו של בעל החיים.

האורך מותאם באמצעות שומר. כדי להכין את השומר הזה, למדוד את המחט הנכונה נגד הכובע שלה ולהטביע חותם. לאחר מכן, הנח סימן שני על המכסה כדי לציין היכן הוא ייחתך. המרחק בין שני הסימנים הוא אורך המחט הרצוי. לאחר מכן, לחתוך את הכובע עם סכין גילוח. אין להשתמש במספריים מכיוון שהם ימחצו את המכסה ולא ייצרו חתך ברמה נקייה. זה “שומר המחטים”. להיפטר המחט המשמשת ליצירת השומר, כפי שהוא כבר לא סטרילי, ובמקום להכניס מחט חדשה לתוך השומר ולוודא כי האורך הנכון חשוף. לאחר מכן, באמצעות מחט אחרת המחוברת למזרק המתאים, לצייר את חומר ההזרקה. מחט אחרת משמשת לעשות זאת, כי מיקום לתוך פקק יהיה משעמם באופן משמעותי מחטים מד עדין אלה, אשר אינו אידיאלי עבור ניהול תוך גולגולתי. לאחר מכן, מניחים את המזרק המלא על המחט עם השומר. עכשיו המערכת מוכנה להזרקה.

עבור גורים מעל גיל 10 ימים, לנהל הרדמה שאיפה. גורים מתחת לגיל 10 ימים לא צריכים להיות מרדים. כדי לבצע את ההזרקה, ראשית לאתר את האתר, שהוא 5 מ”מ מאחורי העין כ 3 מ”מ את קו האמצע של הגולגולת. לאחר מכן, הכנס את המחט לעומק המותר על ידי שומר המחט. לאחר מכן, להזריק באופן איטי יציב כדי למנוע טראומה למוח. הסר את המחט מיד בזהירות רבה כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח. לבסוף, להחזיר את החיה עם הסכר כדי לאפשר החלמה נאותה.

עכשיו בואו נסקור כמה ניסויים שנערכו במעבדות היום שמשתמשים בנתיבי הניהול הלא נדירים האלה.

הזרקה תוך עורית משמשת לעתים קרובות לחקר תגובה דלקתית בעור. בניסוי זה, החוקרים השתמשו בשיטה זו כדי להזריק אלרגן לאוזן אחת וחומר נייטרלי לאוזן הנגדית של עכבר רגיש מראש. לאחר מכן, הם העבירו צבע כחול למערכת הדם של החיה כדי לבחון את השינויים בחדירה לכלי הדם עקב הזרקת אלרגנים.

כאמור, אחד היישומים של ניהול תוך נאוי הוא מתן חיסונים. כאן, מדענים השתמשו במסלול זה כדי לספק חיסון נגד שפעת מהונדס גנטית, לחיות מוחלש לתוך סוג הבר ועכברים מהונדסים וחקר חסינות רירית באמצעות ייצור של סוג מסוים של תאי T.

לבסוף, מחקרים ביו-רפואיים אלה השתמשו בניהול תוך גולגולתי להשתלת תאים סרטניים בעכברים אימונו-תימוניים, כדי ליצור מודל גידול במוח אנושי. היעילות של ההזרקה נותחה לאחר מכן באמצעות מערכת הדמיה in vivo.

יש לך jus צפה בסרטון של JoVE על כמה מהשיטות המיוחדות של ניהול מורכב בעכברים במעבדה וחולדות. כעת עליך להבין מתי נהלים אלה מועילים, את השיקולים שעליך לזכור לפני ובעודך לבצע טכניקות אלה, ואת הצעדים הפרוצדורליים החיוניים כדי להבטיח כי לממשל תהיה השפעה מינימלית על בריאות החיה ועל הנתונים הניסיוניים שיש לאסוף. כמו תמיד, תודה שצפית!

Applications and Summary

ניהול תרכובות לבעלי חיים יכול להיות בעל השפעה משמעותית הן על רווחת החיה והן על התוצאה של הנתונים הניסיוניים והערך המדעי. שיטת המסירה הנכונה חיונית להצלחת הניסוי. גורמים רבים חייבים להיחשב כדי לקבוע את המסלול הטוב ביותר, כולל המטרה המדעית של המחקר, ה- pH של החומר, נפח המינון הנדרש, צמיגות החומר, ואת הרווחה של בעלי החיים. מומחיות טכנית היא גם דרישה לכל שיטות ההזרקה.

Transcript

לעיתים, גישות ניסיוניות שונות מחייבות שימוש בדרכים פחות נפוצות של מתן תרכובות במכרסמים. תוך עורי, תוך-אף ותוך גולגולת הם שלושה מסלולים חלופיים כאלה שבהם משתמשים החוקרים הביו-רפואיים במעבדות כיום.

כפי ששמם מרמז, תוך-עורי מעביר תרכובות לשכבות החיצוניות של הדרמיס. תוך-אף מניח את התמיסה בעורפי החיה. ותוך גולגולת כרוכה בהחדרת המחט ישירות למוח המכרסם.

הכשרה מיוחדת חיונית לביצוע הליכים אלה בהצלחה. כאן, נדגים תחילה את השיקולים עבור כל אחת מהשיטות הללו ולאחר מכן נדגים את הטכניקות שיעזרו לך ללמוד את הנהלים תוך הבטחת בטיחות החיה והצלחת הניסוי.

נתחיל בדיון מתי משתמשים בדרך כלל בדרכים אלה ודברים שצריך לזכור לפני שמתחילים לבצע את טכניקות הניהול המיוחדות הללו.

ההזרקות התוך-עוריות משמשות להעברת חפץ לחלל שבין האפידרמיס לדרמיס מסלול זה שמור בדרך כלל להערכת דלקת, אבחון זרימת דם עורית או תגובות אלרגניות לאנטיגן. בדומה למסלולים אחרים, יש להכין גם את הפתרון התוך-עורי בטכניקה הסטרילית. וזה חייב להיות חוצץ פיזיולוגית כדי שיהיה לו pH ניטרלי על מנת למנוע נמק רקמות באתר ההזרקה. מערכת ללא רכזת עם מחט בגודל 25-30 משמשת לעתים קרובות להזרקה זו. מערכת זו מסייעת בשמירה על נפח הניהול, הנמצא בטווח של 50-100 מיקרוליטר לאתר הזרקה. הזרקת עודף עלולה לגרום לנמק או לדליפה לא רצויה של תרכובות עקב לחץ.

נתיב תוך-אף נבחר לעתים קרובות לאספקה מקומית של חיסונים או תרסיס נוגד גודש וכן להעברה מערכתית ומערכת העצבים המרכזית. הרירית המצפה את חלל האף היא בעלת אספקה עשירה של כלי דם ועצבים המאפשרים ספיגה מערכתית מהירה ומיקוד ישיר למערכת העצבים המרכזית. מדובר בשיטה לא פולשנית הדורשת הכשרה ומיומנות מינימלית, וציוד פשוט – מיקרופיפטה מכוילת וכמה טיפים חד פעמיים. נפחי הניהול לחולדות לא יעלו על 40-100 מיקרוליטר הניתנים בטיפות של 6-10 מיקרוליטר. ועבור עכברים, הנפח הכולל המרבי הוא 24 מיקרוליטר הניתן ב-3-4 טיפות מיקרוליטר.

למרות שהרדמה אינה נדרשת להליך זה, יש לה כמה יתרונות על פני מתן תוך-אף בבעלי חיים בהכרה 1) היא מקלה על מיקום נכון של התרכובת בעורפים, ומבטיחה מינון מדויק 2) מבטלת את האפשרות שהחיה תנשוך את ציוד המינון 3) מבטיחה שאין פגיעה ברקמת האף של החיה, בעיניים, או עור פנים עקב טלטול של הראש, ו-4) בעל חיים נוטה פחות לנחור ולרסס את התרכובת מהנארס בעת מתן התרופה.

זריקות תוך גולגולתיות בעכברים וחולדות בוגרים משתמשות בציוד סטריאוטקסי, המתואר בסרטון באוסף “יסודות מדעי המוח”. הציוד מבטיח מיקום נכון ועומק הזרקה נכון. כאן, נתמקד בלידה תוך גולגולתית בעכברים וחולדות יילודים שהגולגולת בהם דקה מספיק כדי להזריק ישירות דרכה, ועשויה להיות שבירה מכדי לתמוך במכשיר הסטריאוטקסי. המטרות העיקריות של טכניקה זו הן להעביר חומרים פרמקולוגיים של מערכת העצבים המרכזית ישירות למערכת העצבים המרכזית, ולהימנע מההשפעות שנתקלים בהן בכל דרך מערכתית. מד המחט, אורך ונפח המתן נקבעים על סמך המין וגיל הגורים. שימו לב שככל שגיל החיה עולה, מספר המד יורד, אורך המחט הנדרש גדל, ונפח המתן המרבי המומלץ גדל גם הוא.

עם מידע רקע זה בחשבון, בואו נתעמק בהליכים של שיטות הזרקה אלה. ראשית היא טכניקת הניהול התוך-עורי. הליך זה צריך להתבצע בבעלי חיים מורדמים. עיין בסרטון נוסף באוסף זה כדי להבין את ההליכים לאינדוקציה ותחזוקה של הרדמה.

לאחר הרדמת החיה יש לגלח את מקום ההזרקה באמצעות סכין גילוח חשמלי או קרם אפילציה. בעזרת גזה לחה במים, הסר היטב את השיער המתמשך מהאתר. לאחר מכן, בעזרת כרית גזה נוספת, מרחו תמיסת חיטוי מקומית על האזור המגולח. לצורך מתן יש לייצב תחילה את העור במקום ההזרקה על ידי מתיחתו בין האגודל לאצבע המורה.

כעת הניחו את שיפוע המחט על העור והכניסו אותה בעדינות ממש מעבר לשיפוע כך שהפתח יהיה בין האפידרמיס לשכבות הדרמיס. לאחר מכן יש להזריק לאט ולשים לב שזה יוצר כתם בעור. אם המחט מוחדרת עמוק מדי אז לא ייווצר בלב. לאחר ההזרקה, עצור כדי לאפשר לעור להימתח ולהסתגל, ולאחר מכן משוך את המחט לאט. אל תמשוך לאחור את הבוכנה בכל עת, מכיוון שהיית מושך את הרקמה וגורם לטראומה במקום ההזרקה. כמו כן, אין לנגב או למחוק את מקום ההזרקה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לדליפת החומר המוזרק. בעת ביצוע זריקות מרובות, הקפד לרווח אותם זה מזה מספיק כדי שהבלבים לא יחפפו זה לזה.

לאחר מכן, בואו נלמד את הליך המתן התוך-אף בבעלי חיים מודעים ומורדמים.

עבור בעלי חיים ערים, רסנו אותם על ידי קשקוש העור בעורף ואז החזיקו את החיה במצב אנכי כשראשה משותק. היזהר לא לכווץ את החזה מכיוון שהדבר עלול לפגוע ביכולתו של בעל החיים לנשום נשימות עמוקות מספיק כדי לשאוב את הנוזל לריאות. בעזרת מיקרופיפטה, יש לתת חלק מהתמיסה על ידי הנחת טיפה קטנה של נוזל בפתח האף. החיה תשאף את הטיפה. חזור על תהליך זה, לסירוגין בין שני פתחי האף עד לקבלת כל הנפח שיש לתת. זכור – נפח המתן הכולל לא יעלה על 24 ליטר ו-100 ליטר בעכברים וחולדות, בהתאמה.

עבור עכברים וחולדות מורדמים, הנח את החיה בתנוחת שכיבה גבית. עמדה זו אידיאלית להעברת מערכת העצבים המרכזית מכיוון שהיא מאפשרת ספיגה טובה יותר של התרכובת. סובבו את ראש החיה והעבירו מחצית מהתרכובת ישירות לצד אחד של פתח האף, ותזמנו אותה בשאיפה. לאחר מכן, סובב את ראש החיה למקומו למתן הבא. לאחר 2 נשימות בערך, יש להעביר את הנפח הנותר לפתח האף השני. לאחר מתן מלא, החזירו את החיה לכלוב שלה.

לאחר מכן, בואו נסקור את הליך המתן התוך גולגולתי עבור עכברים וחולדות יילודים. לפני תחילת ההליך, הנח את הכלוב עם הגורים והסכר על כרית חימום חשמלית המכוונת לנמוכה. ודא שחלק מהכלוב נמצא מחוץ לכרית החימום. זאת כדי למנוע היפותרמיה ובמקביל לאפשר לסכר להתרחק מהחום אם היא רוצה. לאחר מכן, בחר מד מחט המתאים לגיל החיה. כזכור, מד המחט; אורך המחט, המשמש לשליטה בעומק המחט במהלך ההזרקה התוך גולגולתית; והיקף האדמיניסטרציה… כולם משתנים בהתאם לגיל ולמין של בעל החיים.

האורך מותאם באמצעות שומר. כדי להכין את המגן הזה, מדוד את המחט הנכונה כנגד הכובע שלה ועשה סימן. לאחר מכן, הניחו סימן שני על הכובע כדי לציין היכן הוא ייחתך. המרחק בין שני הסימנים הוא אורך המחט הרצוי. לאחר מכן, חותכים את הכובע בעזרת סכין גילוח. אל תשתמש במספריים מכיוון שהם ימעכו את הכובע ולא ייצרו חתך ברמה נקייה. זהו “מגן המחט”. השלך את המחט המשמשת ליצירת המגן, מכיוון שהיא כבר לא סטרילית, ובמקום זאת הכנס מחט חדשה לתוך המגן וודא שהאורך הנכון חשוף. לאחר מכן, בעזרת מחט אחרת המחוברת למזרק המתאים, צייר את חומר ההזרקה. לשם כך משתמשים במחט אחרת, מכיוון שמיקום בפקק יקהה משמעותית את מחטי המד העדינות הללו, שאינן אידיאליות למתן תוך גולגולתי. לאחר מכן, הנח את המזרק המלא על המחט עם המגן. כעת המערכת מוכנה להזרקה.

לגורים מעל גיל 10 ימים, יש לתת הרדמה באינהלציה. גורים מתחת לגיל 10 ימים אינם צריכים להיות מורדמים. כדי לבצע את ההזרקה, יש לאתר תחילה את המקום, שנמצא 5 מ”מ מאחורי העין וכ-3 מ”מ מקו האמצע של הגולגולת. לאחר מכן, הכנס את המחט לעומק המותר על ידי מגן המחט. לאחר מכן, הזריק בצורה איטית ויציבה כדי למנוע טראומה למוח. הסר את המחט מיד ובזהירות רבה כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח. לבסוף, החזירו את החיה לסכר כדי לאפשר התאוששות נאותה.

עכשיו בואו נסקור כמה ניסויים שנערכים במעבדות כיום המשתמשים בדרכי המתן הלא שגרתיות הללו.

זריקה תוך עורית משמשת לעתים קרובות לחקר תגובה דלקתית בעור. בניסוי זה, החוקרים השתמשו בשיטה זו כדי להזריק אלרגן לאוזן אחת וחומר ניטרלי לאוזן הנגדית של עכבר רגיש מראש. לאחר מכן, הם העבירו צבע כחול למערכת הדם של החיה כדי לבחון את השינויים בחדירות כלי הדם עקב הזרקת אלרגנים.

כפי שהוזכר קודם לכן, אחד היישומים של מתן תוך-אף הוא מתן חיסונים. כאן, מדענים השתמשו בנתיב זה כדי להעביר חיסון שפעת חי מוחלש מהונדס גנטית לעכברים מהונדסים ועכברים מהונדסים וחקרו חסינות רירית באמצעות ייצור סוג מסוים של תאי T.

לבסוף, מחקרים ביו-רפואיים אלה השתמשו במתן תוך גולגולתי כדי להשתיל תאים סרטניים בעכברים מדוכאי חיסון, על מנת ליצור מודל גידול מוח אנושי. לאחר מכן נותחה יעילות ההזרקה באמצעות מערכת הדמיה in vivo.

צפיתם בסרטון של JoVE על כמה מהשיטות המיוחדות למתן תרכובות בעכברי מעבדה וחולדות. כעת עליך להבין מתי נהלים אלה מועילים, את השיקולים שעליך לזכור לפני ובזמן ביצוע טכניקות אלה, ואת הצעדים הפרוצדורליים החיוניים כדי להבטיח שלמתן תהיה השפעה מינימלית על בריאות בעל החיים ועל נתוני הניסוי שייאספו. כמו תמיד, תודה שצפית!

Tags

ערך ריק בעיה