כרומטוגרפיה של עמודה
מקור: המעבדה של ד"ר ג'ימי פרנקו - מכללת מרימק
כרומטוגרפיה של עמודה היא אחת הטכניקות השימושיות ביותר לטיהור תרכובות. טכניקה זו משתמשת בשלב נייח, אשר אר…
1. סיליקה ג'ל סלברי
- יוצקים את ג'ל הסיליקה לבקבוק ארלנמייר. המשקל של חומר האריזה צריך להיות בערך 50x מזה של המדגם המופרד. אם התרכובות המופרדות יש ערכי Rf דומים מאוד, אז זה עשוי לדרוש באמצעות כמות גדולה יותר של סיליקה לכל מדגם, שהוא המקרה בדוגמה זו.
- מניחים 10 גרם של סיליקה בבקבוק ארלנמאייר, שכן 50 מ"ג של מדגם (45 מ"ג פלואורנון ו 5 מ"ג של טטרפנילפורפירין) מבודדים.
- הוסף את מערכת הממס (hexane /dichloromethane, 70%: 30%) לבקבוק ארלנמאייר המכיל את ג'ל סיליקה. הוסף מספיק ממס כדי להבטיח כי כל ג'ל סיליקה הוא מפוף היטב. הסיליקה לא תתמוסס, אבל התערובת תהיה מורגשת חזותית כאשר פתיר. לאחר הממס נוספה מערבולת את בקבוק Erlenmeyer כדי להבטיח כי כל סיליקה הוא פתיר היטב.
2. הכנת הטור
- בחר את העמודה בגודל המתאים. בדרך כלל יש למלא את העמודה בערך באמצע הדרך עם רפת ג'ל סיליקה. ככל שהדגימה מטוהרת גדולה יותר, כך העמודה הנדרשת גדולה יותר.
- חבר את החלק התחתון של העמודה עם חתיכת צמר זכוכית. בעזרת מוט ארוך, ודאו שהצמר תקוע היטב בתחתית העמוד ממש מעל הסטופקוק.
- ברגע שהצמר נמצא במקומו, יש למרוח שכבה דקה של חול על צמר הזכוכית.
הערה: אם העמודה מצוידת בפריט זכוכית מעל הסטופקוק, יש להשמיט שלב זה. - מהדק את העמודה במיקום האנכי למעמד טבעת.
- בעזרת משפך, יוצקים בעדינות את הבוץ המוכן של ג'ל סיליקה לתוך העמוד. ייתכן שיהיה עליך להוסיף ממס נוסף כדי להעביר את העגמה מבקבוק Erlenmeyer לעמודה. באמצעות פיפטה, לשטוף את כל ג'ל סיליקה שנדבק לצדי העמוד.
- כאשר ג'ל הסיליקה מתיישב בעמודה, הקש בעדינות על צידי העמוד כדי להבטיח שג'ל סיליקה ייארז בחוזקה ולא יכלול בועות אוויר.
- פתח את stopcock ולאפשר ממס לנקז לתוך בקבוק Erlenmeyer נקי עד ממש לפני ג'ל סיליקה ואת חזית ממס נפגשים. ג'ל סיליקה לא צריך להתייבש עד ההליך הושלם.
- מניחים שכבה דקה של חול על גבי ג'ל הסיליקה(איור 1). באמצעות פיפטה, לשטוף כל חול שאולי נדבק לצדי העמוד.
- מסננים כל ממס נוסף עד שהחול יבש, אך לא לשכבת ג'ל הסיליקה.
איור 1. ההגדרה המתאימה לניסוי כרומטוגרפיה של עמודה לפני הוספת המדגם.
3. הוספת הדוגמה לעמודה
- להמיס את המדגם בכמות הקטנה ביותר של ממס אפשרי (באמצעות אותו ממס ששימש כדי להפוך את סיליקה ג'ל slurry).
- בעזרת פיפטה, הוסיפו בעדינות את הדגימה לראש העמודה.
- לאחר המדגם הוחל על החלק העליון של העמודה, לפתוח את stopcock ולאפשר ממס לנקז דרך שכבת החול אבל לא שכבת ג'ל סיליקה. השתמש בכמות קטנה מאוד של ממס לשטוף כל מדגם שאולי נצמד לצדי העמודה. לנקז ממס נוסף זה דרך שכבת החול גם כן.
4. ללוטן את המדגם דרך העמודה
- באמצעות פיפטה, בעדינות רבה להוסיף 4-5 מ"ל של ממס באופן כזה שאינו מפריע שכבת החול.
- מניחים משפך בחלק העליון של העמודה וממלאים לאט ובעדינות את שארית העמודה בממס.
- פתח את stopcock ולאפשר לממס לנקז דרך העמודה.
- התחל לאסוף את השלב הנייד כפי שהוא מתנקז מהעמוד לתוך מבחנות.
- מבחנות צריכות להיות ממוקמות בארון מבחנה באופן רציף.
- הוסף ממס נוסף לראש העמודה לפי הצורך עד שכל התרכובות הרצויות יתבהרו מהעמודה.
5. השבת הבוחרים
- אם התרכובות צבועות, אז הם יכולים להיות מזוהים חזותית. עם זאת, אם התרכובות חסרות צבע, יהיה יהיה לזהות אותם באמצעות אור ulta-גלוי (UV) (אם התרכובות מכילות הטיות) או עם הכתם המתאים. טוהר התרכובות ניתן לאמת באמצעות כרומטוגרפיה שכבה דקה.
- זהה את המבחנות המכילות את התרכובות הרצויות.
- מזג את כל השברים המכילים את התרכובות המבודדות הרצויות לבקבוקון עגול (RB) ששוקל מראש. עשה זאת עבור כל מתחם מבודד.
- לאדות את הממס על ידי הצבת בקבוקון RB על המאייד הסיבובי.
- לאחר כל הממס הוסר, לשקול את RB עם המוצר היבש ולהפחית את המשקל הראשוני של RB כדי להשיג תשואה.
כרומטוגרפיה של עמודים היא שיטת טיהור רב-תכליתית המשמשת להפרדת תרכובות בתמיסה. תערובת תמיסה נישאת על ידי ממס דרך עמודה המכילה מוצק סופח, הנקרא השלב הנייח. תערובת הממס והדגימה המשולבת נקראת השלב הנייד.
מולקולות בפאזה הניידת עוברות דרך העמודה בקצבים שונים בהתבסס על תכונותיהן הכימיות וזיקתן לפאזה הנייחת. לפיכך, כל תרכובת יוצאת מהעמודה בזמן אחר. לאחר שהתרכובות הופרדו וטוהרו - ניתן לעבד אותן עוד - או מוכנות להפצה. סרטון זה יציג את היסודות של כרומטוגרפיית עמודות, ולאחר מכן ידגים את הטכניקה עם טיהור תרכובות אורגניות.
בכרומטוגרפיה של עמודות, מולקולות סופגות באופן הפיך לשלב הנייח כשהן זורמות דרך העמודה, ובכך מאטות את התקדמותן. תרכובות המקיימות אינטראקציה חלשה עם הפאזה הנייחת מהר יותר לצאת מהעמודה, או לשחרר. תרכובות המקיימות אינטראקציה חזקה עם השלב הנייח איטיות יותר לפליטה. השלב הנייח הוא אבקה או ג'ל סופח כגון סיליקה ג'ל או אלומינה. סיליקה ג'ל ואלומינה הם קוטביים מאוד, ולכן הם מקיימים אינטראקציה חזקה עם תרכובות קוטביות וממיסים, ובאופן חלש עם מולקולות לא קוטביות. השלב הנייח נטען לתוך העמוד כתרחיץ עם הממס ולאחר מכן נארז על ידי ממס זורם דרך השלב הנייח. כאשר הוא ארוז כהלכה, השלב הנייח הומוגני מלמעלה למטה ואינו מכיל בועות אוויר או כתמים יבשים, מכיוון שזרימה לא אחידה הנגרמת על ידי אי סדרים אלה מפריעה להפרדת התרכובות. הממס, או חומר הנוזל, הוא בדרך כלל ממס אורגני המסופק ממאגר. באופן כללי, ממיסים לא קוטביים פולטים רק תרכובות לא קוטביות, בעוד שממיסים קוטביים פולטים תרכובות קוטביות ולא קוטביות כאחד. אם תערובת מכילה תרכובות בעלות קוטביות שונה באופן משמעותי, ניתן להשתמש בסדרה של ממיסים קוטביים יותר ויותר כדי לנטרל את כל התרכובות המעניינות. קצב זרימת הפאזה הנייד נשלט בדרך כלל על ידי תא עצירה בתחתית העמוד. הפסקות בזרימה נשמרות למינימום כדי למנוע דיפוזיה של התרכובות. השלב הנייד היוצא מהעמודה, הנקרא האלואט, נאסף בשברים כדי לשמר את הפרדת התרכובות. כעת, לאחר שהבנתם את העקרונות של כרומטוגרפיה של עמודות, בואו נעבור הליך לטיהור תערובת של תרכובות אורגניות.
כדי להתחיל בהליך, השג את הציוד כפי שמצוין בטקסט. שקלו בקבוק עם תחתית עגולה כדי לבודד כל תרכובת ותעדו את המסה. לאחר מכן, שקלו את הדגימה והמיסו אותה בנפח הממס המינימלי הדרוש. יש לקבוע מראש את הממס המתאים באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה. ערך ה-Rf צריך להיות בין 0.2×0.3. לאחר מכן, קבע את כמות הסיליקה ג'ל הנדרשת לשלב הנייח על סמך המשקל היבש של הדגימה וההבדל במרחק הנדידה של התרכובות המעניינות על סמך הסינון המקדים של TLC. יוצקים את הכמות המתאימה של סיליקה ג'ל לבקבוק Erlenmeyer. הוסף את הממס לסיליקה ג'ל עד שהשפלה שקופה ונעה בחופשיות כאשר הבקבוק מסתחרר. לאחר מכן, בחר עמודה גדולה מספיק כדי שג'ל הסיליקה ימלא אותה באמצע הדרך. אם לעמודה אין פריט זכוכית, הניחו צמר זכוכית בעמוד ולחצו אותו בחוזקה לתחתית בעזרת מוט ארוך. מכסים את צמר הזכוכית בכ -2 ס"מ חול כדי למנוע מעבר סיליקה דרך צמר הזכוכית. במכסה אדים?מהדקים את העמוד למעמד טבעת, ומאפשרים מספיק מקום למטה כדי להכיל את המבחנות.
הנח משפך לתוך העמוד וודא שתא העצירה סגור. שופכים את התרחיץ לתוך העמוד, מקישים בעדינות על הצדדים כשהתרחיץ מתייצב כדי לא לכלול בועות אוויר. שוטפים את המשפך, הבקבוק וקירות העמוד בממס כדי להעביר את כל הג'ל לעמוד.
הניחו בקבוק ארלנמאייר מתחת לעמוד. פתח את תא העצירה ואפשר לממס להתנקז לתוך הבקבוק עד שמפלס הממס יהיה ממש מעל ג'ל הסיליקה, ולאחר מכן סגור את תא העצירה. שופכים כ -2 ס"מ חול על הג'ל. יש לשטוף בעדינות את כל החול שנדבק לצידי העמוד בעזרת ממס. מסננים את הממס לפי הצורך כך שהחול יבש ברובו, אך הסיליקה נשארת מכוסה לחלוטין.
כדי להתחיל את ההפרדה, הוסף את הדגימה לעמודה מבלי להפריע לחול. השתמש במנות קטנות של ממס כדי לשטוף כל דגימה שנדבקת לדפנות העמודים ולשטוף את מיכל הדגימה. מסננים בזהירות את הממס עד שהמפלס נמצא ממש מעל הסיליקה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, הוסיפו בעדינות 4×5 מ"ל ממס מבלי להפריע לשכבת החול. מניחים משפך בעמוד וממלאים לאט בממס. הסר את הבקבוק והחלף במבחנה מסומנת. כשהמבחנה הראשונה במקומה, פתח את תא העצירה ואסוף את הפליטה עד שהמבחנה כמעט מלאה.
המשיכו לאסוף שברים עד שכל התרכובות הרצויות הוסרו, והמשיכו ברצף דרך המבחנות המסומנות בסיום, סגור את תא העצירה.
עבור כל תרכובת מבודדת, שלב את השברים הטהורים בבקבוק עם תחתית עגולה שנשקלה מראש. הסר את הממס מהבקבוק על מאייד סיבובי ואז שקול את הבקבוק בעל התחתית העגולה המכיל את התרכובת היבשה. למידע נוסף, ראה את הסרטון של אוסף זה על אידוי סיבובי.
דגימה זו הכילה תערובת של טטרפנילפורפירין, או TPP, ופלואורנון. ה-TPP האדמדם-סגול הכהה נפלט ראשון, ואחריו הפלואורנון הצהוב. הטוהר של כל תרכובת מבודדת אושר על ידי ספקטרוסקופיה של NMR.
כרומטוגרפיה של עמודות משמשת לטיהור וניתוח במגוון תחומים מדעיים.
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, או HPLC, היא סוג של כרומטוגרפיה של עמודות המספקת הפרדה מצוינת בין תרכובות ויכולה לשלב גלאים מיוחדים כגון גלאי קרינה למולקולות עם תוויות רדיו. באמצעות HPLC, ניתן לבודד בקלות פוספוליפיד עם תווית רדיו מתערובת של רבים אחרים גם אם הוא מהווה אחוז קטן מהתערובת. מידע זה יכול לעזור להבהיר את הייצור, הוויסות והתפקודים של ביומולקולות חשובות רבות.
כרומטוגרפיית פלאש היא גרסה של כרומטוגרפיה של עמודים שבה השלב הנייד נע דרך העמודה בלחץ אוויר או גז ולא על ידי זרימת הכבידה בלבד.
זה יוצר קצב זרימה מהיר יותר, וממזער את הדיפוזיה להפרדה טובה יותר. התרכובת הרצויה נאספת בכמה שברים טהורים ומרוכזים, כפי שמוצג בכרומטוגרפיה של שכבה דקה, וכתוצאה מכך תשואה וטוהר מצוינים לאחר הטיהור.
מנגנון העמודים הרגיל אינו מתאים להפרדת נפחים קטנים, אך תערובות מסוימות אינן תואמות לטכניקות מיוחדות כגון HPLC. טיהור בקנה מידה קטן מתבצע עם עמודי פיפטה מזכוכית, עם נורת פיפטה המשמשת לכרומטוגרפיית הבזק בקנה מידה קטן. זה שימושי במיוחד בעת הכנת דגימה לטכניקות טיהור מיוחדות או כשלב אחרון לאחר טיהור בקנה מידה גדול.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לכרומטוגרפיה של עמודות. כעת עליך להכיר את העקרונות של כרומטוגרפיה של עמודות, הליך לכרומטוגרפיה של עמוד סיליקה ג'ל וכמה יישומים של הטכניקה.
תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.