הפקת דנ"א קהילתי ממושבות חיידקים

1. הפקת דנ"א של קהילת החיידקים

1. כדי להתחיל את ההליך, לשקול 100 גרם של אדמה מסונת. הוסף את זה לכלי פוליפרופילן, ולהוסיף 100 מ"ל של חיץ החילוץ המורכב חיץ טריס מתוקן עם EDTA כדי לקדם את שחרור החיידקים מטריצת הקרקע, ולאחר מכן ללחוץ ביד.
2. לאחר מכן, לשקול 100 גרם של חרוזי זכוכית, ולהוסיף אלה לכלי ערבוב. להסעיר את המדגם במשך 5 דקות באמצעות מכשיר להכות חרוזים או שייקר פעולה פרק כף היד מכני במשך 15 דקות. מוסיפים 10 מ"ל 20% נתרן דודסיל סולפט, או SDS, לתערובת, ולאחר מכן להתסיס במשך דקה נוספת. דגירה בטמפרטורה גבוהה של 60 - 65 °C (60 °F) במשך 60 דקות.
3. באותה מידה לחלק את המדגם בין צינורות נפרדים 50 מ"ל, וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 6,000 x g. מעבירים את הסופר-נט מהצינורות למיכל סטרילי אחד. לאחר מכן, חזור על החילוץ על גלולה הקרקע כפי שתואר בעבר, באמצעות נפח טרי של חיץ החילוץ.
4. לאחר מכן, הוסף את הנפח הכולל של supernatant מעובד, כ 200 מ"ל, צינור 50 מ"ל נקי מלא לחצי נפח עם פתרון של 30% פוליאתילן גליקול ו 1.6 M נתרן כלורי. הפוך את הבקבוקים מספר פעמים ביד לערבב, ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות. דגימות צנטריפוגות ב 10,000 x g במשך 20 דקות כדי גלולה את ה- DNA.
5. הסר את supernatant בזהירות מן צינור צנטריפוגה, משאיר מאחור את גלולה חומצת גרעין מטוהר חלקית. הוסף 20 מ"ל של מאגר TE ו- 1.5 מ"ל של פתרון אצטט אשלגן 7.5 M כדי תוסיף מחדש את הכדור ולאחר מכן מערבולת. מניחים את ההשעיה על הקרח למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (55 °F) כדי לזרז חלבונים ופוליסכרידים.
6. לאחר מכן, מוסיפים RNAse ו- proteinase K לדגימה, מערבבים בעדינות ביד, ותנו לשבת לרגע. הוסף נפח שווה ערך של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל (תערובת יחס של 25:24:1) להשעיה שיש לחלץ, ומערבבים בעדינות ביד. צנטריפוגה ההכנה במשך 10 דקות ב 13,000 x g. הסר בזהירות את הכלי מן הצנטריפוגה, ולשים לב לשתי השכבות.
7. השכבה התחתונה והכבדה יותר מורכבת מהפנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל ופסולת שחולצה, והשכבה העליונה היא מימית ומכילה את ה- DNA. מניחים את השלב מימי לתוך כלי סטרילי, מוסיפים נפח שווה ערך של איזופרופנול, ולהפוך בעדינות כדי ליזום משקעים DNA. לדגור על המתלים בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. פלט את הדנ"א המטוהר על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 30 דקות. הסר בזהירות את supernatant כמו DNA גלולה עשוי או לא יכול להיות גלוי בתחתית הכלי, ולאחר מכן resuspend ב 1 מ"ל של מאגר TE.
8. באמצעות ספקטרופוטומטר או פלורימטר כימות DNA/ RNA, למדוד את רמת ה- DNA שחולץ מהדגימה. כמות הדנ"א מוערכת מקריאת 260 ננומטר. קריאת ספיגה של 1.0 שקולה ל-50 מיקרוגרם דנ"א למ"ל של פתרון. אם הריכוז גבוה מדי לקריאות מדויקות, לדלל את ההשעיה 1 עד 10, או 1 עד 100 באמצעות מים מולקולריים.
9. טוהר הדנ"א מוערך מהיחס בין הקריאה ב-260 ננומטר לזה ב-280 ננומטר. ערך > 1.7 מצביע על דנ"א טהור יחסית. הערך התיאורטי המרבי הוא 2.0.