הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS
11 בדצמבר 2008
וידאו זה מתאר פשוטים, חוסך זמן טכניקה ניתוק אוטומטי רקמות באמצעות Dissociator gentleMACS להכין תא בודד השעיות של splenocytes העכבר.
בפרוטוקול וידאו זה, תראו כיצד לבצע דיסוציאציה של טחורי עכבר באמצעות Gentle Max, מכשיר שולחני אוטומטי שיכול לפרק רקמות באופן מכני באמצעות מבחנות מיוחדות כדי להפיק תרחיפי תאים חיוניים. לאחר הדיסוציאציה, הטחורים מסוננים באמצעות מסנני הפרדה מסוג Max Pres, עוברים סנטריפוגה ומוסמקים ליישומים נוספים. שלום, שמי מלאני מלו.
אני מדען ב-Milton Biotech כאן ב-BE Lab Park, גרמניה. היום אראה לכם את הכנת תרחיף תאים בודדים מטחול של עכבר באמצעות GenX dissociation. ה-GenX dissociation מאפשרת הכנה קלה ומהירה מאוד של תרחיף תאים בודדים.
בואו נתחיל. כדי להימנע מדיסוציאציות ידניות מייגעות ולעיתים כואבות, ה-gentle max di associator מאפשר לבצע דיסוציאציה של רקמה ביעילות רבה תחת תנאים נשלטים וניתנים לשחזור. הרקמה עוברת דיסוציאציה עדינה באמצעות מבחנות violet C לת сусפנסיות של תאים בודדים חיוניים.
השפופרת מסוג C כוללת פתח עם ספטום אטום במרכז המכסה, המאפשר להעביר נוזלים באמצעות פיפט מהשפופרת תוך שמירה מתמדת על סטריליות. כדי להשעות את התאים המופרדים, יהיה עליכם להשתמש בתמיסת PBS-BSA-EDTA המתאימה. את התמיסה מכינים על ידי הוספת חלק אחד של תמיסת מקור של BSA ל-20 חלקים של תמיסת AutoMax fencing המכילה EDTA.
באמצעות מסנני ההפרדה Max Pres, דגימות רקמה מופרדות מכל גשמי תאים, דבר המקדם הפרדה מרבית מוצלחת ואנליזה לאחר מכן. כדי להתחיל את הפרוצדורה, אנו ממלאים את מבחנת ה-C בנפח של בופר. בהתאם למסת הטחולים, טחול בריא של עכברה נקבת בגיל שש עד שבעה שבועות שומשה לביופסיה שוקל כ-80 עד 120 milligrams.
עבור כל אחד עד שני טחולים ממסה זו נדרשים שלושה מיליליטרים של בופר. אין לעלות על נפח כולל של 10 מיליליטרים. כעת ניתן להוסיף את הטחול שפורק לשפחור C המכיל שלושה מיליליטרים של בופר. טחולים מבעלי חיים מבוגרים או מבעלי חיים עם זיהומים הם לרוב גדולים יותר ויש לשקול אותם בתוך הבופר.
יש להתאים את נפחי התמיכה בהתאם, אך שוב, הם לא יעלו על נפח כולל של 10 milliliters. כעת, ודאו שפקק צינור C סגור היטב וחברו את צינור C למכשיר הדיסוציאציה. כאשר הפקק פונה כלפי מטה, הפעילו את הדיסוציאציה עבור אחד עד שניים spleens ובחרו בתוכנית Program M spleen oh one. התוכנית תסתיים לאחר 56 שניות; אם מספר ה-spleens גדול יותר, השתמשו בתוכנית program M spleen oh four.
ניתן להשתמש בתוכנית זו עבור עד 720 milligrams של רקמת טחול. לאחר השלמת התוכנית, רקמת הטחול הטבעית מתפרקת לתרחיף תאי PLE, שנראה כך; יש לסובב את הדגימה במערבל מרכז (centrifuge) לזמן קצר כדי לאסוף את הדגימה בתחתית המבחנה. פעולה זו תבטיח שהרוטור והסטטור יהיו נקיים מכל התאים שנאספו בתחתית מבחנת ה-C.
אנו מוציאים את הדגימה דרך הפתח האטום בספטום במכסה של מבחנת ה-C באמצעות פיפט של 1000 µL. כדי להתחיל בשלב הסינון, אנו מעבירים את הרקמה הדיסוציאטית למסנן הפרדה מוקדם או למסננת עם גודל נקבים של 30 micron. המסננת צריכה להתאים למבחנה של 15 mL עבור אחד עד שני טחולים, או למבחנה של 50 mL עבור יותר משני טחולים.
העבירו את תרחיף התאים דרך המסנן, ולאחר מכן שטפו את המסנן על ידי הוספת חמישה מיליליטר של בופר. כעת, סבבו את המבנה עם תרחיף התאים בצנטריפוגה ב-300 Gs בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאסוף את כל התאים למשקע תאי טחול. כעת, כאשר יש לנו משקע של תאים מופרדים, יש לשאוב את העילאי ולהשעות מחדש את משקע התאים בכמות מתאימה של בופר להפרדת טחול.
שימוש ב-gentle max יניב אחוז גבוה של PLE cytes חיוניים, כפי שמוצג בבדיקת flow cytometry באמצעות ה-max quant. תאים מתים נצבעים ב-Propidium iodide, כפי שמוצג בדוגמה. תרשים ה-dot plot של ה-forward side scatter מראה SP cytes שהוכנו. בסדר.
הראיתי לכם כיצד לבצע דיסוציאציה של רקמת הטחול באמצעות שימוש ב-Gentle X dissociation עדינה זו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להתאים את כמות התמיכה (buffer) לגודל הדגימה ולבחור את תוכנית ה-Gentle X המתאימה. אוקיי, זה הכל.
בהצלחה בניסוי שלך.
סקירה כללית
פרוטוקול וידאו זה מדגים טכניקה יעילה לפירוק רקמה אוטומטי של טחול עכברים באמצעות ה-gentleMACS Dissociator. השיטה מייצרת תרחיפי תאים בודדים חיים המתאימים ליישומים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- פירוק רקמות הוא קריטי להשגת תרחיפי תאים בודדים.
- פירוק ידני עלול להיות מייגע ולא יעיל.
- מכשיר ה-gentleMACS Dissociator מספק שיטה עקבית ונשלטת.
- תרחיפי תאים חיוניים הם הכרחיים ליישומים המשכיים.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקה לחיסכון בזמן לפירוק רקמות.
- להכנת תרחיפים של תאים בודדיםהטחלים של עכברים.
- לשיפור היעילות של הכנת תאים למחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במכשיר gentleMACS Dissociator עם מבחנות ייעודיות.
- הכנה של תמיסת בופר עבור תרחיף רקמה.
- סינון של רקמה מפורקת באמצעות מסנני הפרדה מסדרת Max Pres.
- צנטריפוגציה לאיסוף משקעי תאים חיוניים.
תוצאות עיקריות
- דיסוציאציה יעילה של טחכמי עכבר לתרחיפים של תאים בודדים.
- אחוז גבוה של תאים חיוניים כפי שהוכח באמצעות ציטומטריה זורמת.
- הסרה מוצלחת של צבירי תאים לצורך ניתוח מדויק.
- שחזוריות של התוצאות על פני גדלי דגימה שונים.
מסקנות
- ה-gentleMACS Dissociator מפשט באופן משמעותי את דיסוציאציית הרקמה.
- הכנה נכונה של התמיסות (buffer) היא קריטית להשגת תוצאות מוצלחות.
- ניתן להחיל שיטה זו על סוגי רקמות שונים לצורך אנליזה של תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הכנה אוטומטית של תרחיפי תאים בודדים מטחול של עכבר באמצעות ה-gentleMACS Dissociator פותרת צוואר בקבוק קריטי בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם ואימונולוגיה. דיסוציאציה סטנדרטית וניתנת לשחזור מאפשרת הפרדה, ניתוח ותרבית אמינים של תאים בשלבים הבאים, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בתיקוף מטרות ובסינון. יכולת זו מפחיתה שונות ידנית ומאיצה את המעבר מרקמה לנתוני תאים בודדים שמישים בפורטפוליו של מחקרי גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר יצירה מהירה של תרחיפי תאים בודדים חיים עבור אימונופנוטיפ (immunophenotyping) ובדיקות תפקודיות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת חומר קלט עקבי לחקירת מסלולים ומטרות.
- מקל על הכנה הדירה של דגימות, ובכך מפחית משתנים מבלבלים במחקרי תיקוף של מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק תרחיפי תאים סטנדרטיים עבור פיתוח בדיקות ופלטפורמות לסריקה בסביקת תפוקה גבוהה.
- משפר את הדיוק של הבדיקה (reproducibility) על ידי מזעור השונות הנובעת מדיסוציאציה ידנית.
- מכין דגימות התואמות לציטומטריית זרימה למיון תאים, המאפשרות תוצרים כמותיים מהימנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק תרחיפי תאים בעלי חיוניות גבוהה למחקרי סממנים ביולוגיים תרגומיים ולאפיון חיסוני פרה-קליני.
- מבטיח רציפות משלב איסוף הרקמה ועד לניתוחים פונקציונליים ופנוטיפיים המשכיים.
- מפחית את הסיכון לאובדן דגימות או להתדרדרותן, ובכך תומך בקבלת החלטות פרה-קליניות מהימנה.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת בממשק שבין איסוף רקמות לבין בדיקות מבוססות תאים במצב מתקדם, ובכך היא מגשרת בין תהליכי גילוי מוקדם, סריקה ומחקר תרגומי.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובמחקרים מכניסטיים באמצעות אספקת תשומות איכותיות של תאים בודדים.
- סריקה: מספק תרחיפי תאים הניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב, לצורך מוכנות לבדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר הערכה כמותית של חיוניות ופנוטיפ באמצעות ציטומטריה של זרימה ומדדים קשורים.
- מחקר תרגומי: תואם לצרכים של אפיון סמנים ביולוגיים ותאי מערכת החיסון במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת דיסוציאציה סטנדרטית וניתנת לאוטומציה, הניתנת להתאמה לסוגי רקמות ומחקרים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים מבוססי תאים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות, הסטנדרטיזציה והתפוקה בהכנת דגימות.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומפחית בזבוז משאבים כתוצאה מהכנות כושלות או לא עקביות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי הבטחת חומרי קלט אמינים עבור תוכניות מרובות.
שיקולים ביישום
- נדרשת היכרות עם פרוטוקולים של פירוק רקמה אוטומטי והכנת תמיסות באפר.
- נדרשת גישה למכשיר gentleMACS Dissociator, למבחנות C ולציוד סינון וצנטריפוגה תואם.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים של כמות הדגימה ונפחי התמיסות להבטחת שחזוריות.
- ניתן להתאמה לגדלי טחול משתנים ופוטנציאלית לסוגי רקמות אחרים באמצעות התאמות בפרוטוקול.
- יש להתאים את נפח התמיסה ואת בחירת התוכנית למסת הדגימה כדי להבטיח פירוק אופטימלי.
