מקור: קיי סטיוארט, RVT, RLATG, CMAR; ואלרי א. שרודר, אר.די.ג'י, אר-אל-ג'י. אוניברסיטת נוטרדאם, IN
ניסויים בבעלי חיים רבים מסתמכים על נקודות זמן איסוף…
1. בחינה חיצונית
בדיקה חיצונית גסה של הגוף, הכוללת בדיקה חזותית של הגוף עבור נגעים ומסות, צריכה להתבצע כשלב ראשוני בנקרופסיה. יש לבדוק את מעיל השיער עבור אזורים של נשירת שיער. השיניים והציפורניים מוערכים לצמיחה מוגזמת או ללבוש. יש לציין כל כתמים של הפרווה בפה, nares, עיניים, anal, ופתחים איברי המין יש לציין. בדיקות סרט, גירוד העור ובדיקות פרווה יש לבצע כדי לזהות טפילים חיצוניים (ראה נהלים להלן).
2. בדיקה פנימית ברוטו של חלל הבטן
3. איברי בטן
4. חלל בית החזה
5. ראש
בדיקת נתיחה לאחר המוות של איברים וקצירת רקמות הם מרכיבים אינטגרליים של ניסויי מעבדה רבים, המסתמכים על נקודות הזמן הסופיות של איסוף הנתונים שנאספו מניתוח האיברים שנקצרו. לכן, חשוב ללמוד את טכניקת האבחון הנכונה וקצירת רקמות, שכן ההליך יכול להשפיע באופן משמעותי על איכות הדגימות שנאספו. מצגת זו תסקור את שיטת החיתוך והמיצוי של איברי בטן, רבייה וחזה מחיות מעבדה.
לפני תחילת ההליך, יש לפתוח טופס הכולל היסטוריה מלאה של בעל החיים: מספר זיהוי בעל חיים, מין, תנאי מגורים, תאריך לידה, תאריך פטירה, מספר מחקר/פרוטוקול ושם החוקר הראשי.
לאחר מכן, הכינו את אזור הדיסקציה. הניחו כיסוי ספסל, מגש חיתוך, מכשירים המיועדים לנקרופסיה, הכוללים מספריים, מלקחיים, להב אזמל סטרילי, חותכי עצם, בדיקה קהה, מרית קטנה וחומר תפר שאינו נספג. קצירת איברים ורקמות לבדיקה היסטולוגית מחייבת שימור הרקמות בתמיסה מקבעת. אלא אם צוין אחרת, הקיבוע הנפוץ ביותר הוא 10% פורמלין ניטרלי. שימו לב שדגימות הרקמה צריכות להיות בעובי של 0.5-1 ס"מ כדי לאפשר חדירה מספקת של תמיסת הקיבוע. קיבוע מונע ריקבון, אוטוליזה וריקבון; מפסיק כל תגובה ביוכימית מתמשכת; ועשוי להגביר את החוזק המכני והיציבות של הרקמות המטופלות.
שיטת המתת החסד של בעל החיים יכולה להשפיע גם על איכות הדגימות. שיטת המתת החסד הנפוצה ביותר עבור עכברים וחולדות היא מנת יתר של גז פחמן דו חמצני. בעלי החיים נשארים בכלוב הביתי שלהם, המונח לתוך תא, ו-CO2 מוחדר בהדרגה לתא בקצב תזוזה של 10-30% מנפח התא לדקה. זה גורם לבעלי החיים לאבד את ההכרה לפני תפיסת הכאב הקשורה להפעלת קולטני הכאב על ידי חומצה פחמנית. לאחר מכן הזרימה נשמרת בתא עד שמתרחש דום נשימה והחיה מתה.
לאחר המתת חסד, יש לבצע תחילה בדיקה חיצונית ראשונית על ידי בדיקה ויזואלית של הפגר לאיתור נגעים וגושים, צמיחת שיניים מוגזמת או כל הכתמה של הפרווה בפה, בעורפים, באוזניים, בעיניים ובפתחי פי הטבעת ואיברי המין. במידת הצורך, בצע בדיקת קלטת, גירוד עור ובדיקות פרוות לאיתור טפילים חיצוניים. לאחר השלמת הבדיקה החיצונית, הגיע הזמן להתחיל את הנתיחה, החל מחלל הבטן. שימו לב שלפני הסרת דגימות רקמה כלשהן חשוב להתבונן באיבר באתרו.
כדי להתחיל לכרות את העור, הניחו חתך קטן ממש לפני האגן אצל הנקבות ומעל הקדם אצל הזכרים. לאחר מכן, באמצעות טכניקת דיסקציה קהה, שחרר את העור מהפאשיה והשריר. דיסקציה קהה היא טכניקה בדיסקציה אנטומית שבה רקמות מופרדות ומבנים בסיסיים נחשפים ללא חיתוך. בטכניקה זו משתמשים במספריים לפיזור רקמות ולא לחיתוך שלהן. הקצוות הסגורים נדחפים לרקמה ואז נפתחים לרקמה מפוצלת לאורך מישורים טבעיים. תהליך זה דורש סבלנות ומגע עדין, שכן מתיחת הרקמה עלולה לגרום לפגיעה באיברים ובכלי דם סמוכים. לאחר מכן האריכו את החיתוך עד הסנטר. לאחר מכן, בצע חתכים רוחביים קדמיים לגפיים האחוריות ואחוריים לגפיים הקדמיות, והשתמש בדיסקציה קהה כדי לחשוף את אזור צוואר הרחם והחזה. יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע קרע בכלי הצוואר והצוואר בצוואר.
אצל נקבות, עם כריתת העור, התבונן ברקמת החלב מהחלק העליון של עצם החזה במנובריום ועד לפתח איברי המין על פני הגחון; משתרע לרוחב משני הצדדים. לנקבות מניקות או בהריון יהיה נפח רקמת חלב מוגבר וחלב עשוי להיות נוכח. כדי לכרות את בלוטות החלב, אחוז בקצה הרקמה בעזרת מלקחיים והשתמש בדיסקציה קהה כדי לשחרר את החיבורים לעור. לאחר הפרדת הבלוטה, ניתן למקם אותה בתמיסה מקבעת לניתוח היסטולוגי שלאחר מכן.
בשלב זה, ניתן לצפות בבלוטות רוק תת-לסתיות, המזווגות וממוקמות בלסת התחתונה - המשתרעות לאורך הצוואר עד עצם החזה של המנובריום. הסרת בלוטות אלו דורשת דיסקציה קהה וזהירות נוספת בעבודה באזור צוואר הרחם כדי למנוע קרע של כלי הדם. לאחר השחרור מהשרירים הבסיסיים, הרם את הבלוטות ונתק את כל החיבורים הנותרים. הבלוטות דורשות לפחות חתך אחד כדי לאפשר חדירת הקיבוע.
בנוסף, ניתן לראות את קנה הנשימה, המשתרע מהאפיגלוטיס ועד להתפצלות הסמפונות. זהו צינור סחוסי מרוכס וגמיש. למרות שבדרך כלל ברור, המתת חסד עם CO2 עלולה לגרום להצטברות נוזלים בריאות ובקנה הנשימה שנראית כמו נוזל צלול מוקצף. שומן תת עורי יהיה נוכח גם באזור זה. הערך אותו לכמות ולתצהיר. לחיה שמנה עשויה להיות כמות גדולה של שומן עם תחושה של סמיכות בעור.
לפני פתיחת חלל הגוף, יש להתבונן בשרירי הצוואר הבטניים, הבין-צלעיים והחשופים, ובגפיים לאיתור כל עיבוי, גוש או שינוי צבע. כדי לפתוח את חלל הגוף, בצע תחילה חתך רוחבי קטן בנקודה הזנבית ביותר של שריר הבטן החשוף. לאחר מכן הרם את השריר הרחק מהאיברים, וחתך לאורך הלינאה אלבה עד לקסיפואיד. לאחר מכן, נתח את השרירים לרוחב מקו האמצע ועד ממש מעל הגפיים האחוריות משני הצדדים. לבסוף, חותכים לאורך עיקול הצלעות משני הצדדים. לאחר פתיחת חלל הגוף, העריכו את כמות והצטברות השומן הבטני. לחיה בריאה יהיו רפידות שומן בטני ומעט שומן לאורך פני השטח הגביים בחלל. שימו לב לצבע הרקמה הזו ושימו לב לכל חריגה.
כעת אנו מוכנים להתחיל בקציר איברי הבטן. התחל באיתור הטחול, שהוא אדום כהה וממוקם לאורך העקמומיות התחתונה של הקיבה. זה צריך להיות רגיל בצורתו ועם משטח מעט מט. כדי להסיר את הטחול, הרם את האיבר וחתוך את החיבורים לקיבה.
הקיבה ממוקמת בקצה הדיסטלי של הוושט. נראה שהוא דו-גוני, ומבדיל בין החלקים השריריים והבלוטות. הרגישו את זה בנוכחות של מזון. יש לציין בטן ריקה, מכיוון שהיא יכולה להעיד על מחלה. אין לחתוך את הקיבה, מכיוון שהתוכן יזהם את האיברים בחלל הבטן.
המעי הדק מחובר דיסטלי ונחות מהקיבה. ישנם שלושה חלקים נפרדים של המעי הדק. הראשון הוא התריסריון - קטע קצר יותר מסוגר הקיבה האחורי לתחילת הג'ג'ונום. צינור המרה נכנס לכאן ורקמת הלבלב מחוברת חזק יותר לחלק זה של המעי הדק. הג'ג'ונום הוא החלק המרכזי. ניתן להבחין במדבקות פייר, שהן אזורים סגלגלים קטנים המורכבים מרקמת לימפה, על פני הג'ג'ונום והאילאום. האילאום הוא החלק הארוך ביותר של המעי הדק שמסתיים בצקום - ממוקם בצומת המעי הדק והגס. הצקום נראה בצבע ירקרק ורך מאוד.
המעי הגס ממשיך מהצקום לפי הטבעת. ניתן לזהות אותו בקלות מכיוון שניתן לדמיין כדורי צואה בתוך לומן של מבנה זה. המעי הדק והגס מעוגנים לגוף על ידי המזנטריה, קרום המכיל כלי דם, שומן ובלוטות לימפה. יש לבחון זאת עבור בלוטות לימפה מוגדלות וכל גוש לפני הסרת מערכת העיכול. הלבלב הוא איבר מפוזר הממוקם מאחורי הקיבה. זהו צבע שזוף בהיר עד אפור ומורכב ממספר אונות קטנות עם קצוות לא סדירים. כדי לקצור את הלבלב, אחוז באיבר והקניט אותו בעדינות מהרקמה המזנטרית שמסביב. יש לעשות זאת לפני הסרת מערכת העיכול.
כדי להסיר את כל הדרכה כמקשה אחת שמתחילה בקיבה ונמשכת עד פי הטבעת, הנח תחילה קשירה בפי הטבעת ולאחר מכן בצע חתך דרך המעי הגס ממש לפני פי הטבעת. לאחר מכן, הניחו קשירה בצומת הוושט והקיבה, ולאחר מכן ניתן להרים את כל מערכת המעי ולנתק את כל החיבורים הקרומיים. לאחר מכן ניתן להפריד את כל העניין מהמזנטריה, לחתוך אותו לחלקים ולתקן אותו.
הכליות הן איברים זוגיים הממוקמים כנגד שרירי הגב. הם צריכים להיות בגודל ובצבע של שעועית כהה ובעלי משטח חלק. מיד לפני הכליה נמצאת בלוטת יותרת הכליה המופיעה כגוש ורוד בהיר קטן.
כדי להסיר כליה, יש לבודד אותה באמצעות מלקחיים ולחתוך בין האיבר לשופכן. לאחר מכן ניתן לקלף את השכבה החיצונית הקשוחה כדי לבחון את פני השטח. חותכים כליה אחת לשניים לאורך הציר הארוך ואת השנייה לרוחב. כל חצץ בפנים עשוי להצביע על נוכחות של גבישים או משקעי מינרלים. לבסוף, הסר את הכבד, שצבעו אדום כהה ושוליו צריכים להיות חלקים עם קצה פריך. יש לנקוט בזהירות בעת הטיפול בכבד, מכיוון שמדובר ברקמה פריכה. כל הפרעה לשלמות האיבר תגרום לדליפת דם לחלל הגוף ולטשטש איברים אחרים.
כדי להסיר את הכבד, ראשית יש להחזיר בעדינות את האונות הרחק מהסרעפת ולבצע חתך דרך כלי הדם הקדמיים למבנה. לאחר מכן, החזירו את הכבד לכיוון הסרעפת ותפסו את הצומת הסיבי המחבר את כל האונות במרכז. לבסוף, הרם את האיבר תוך ניתוק כל החיבורים לדרכי המעי והקיבה.
מערכת הרבייה הנשית מורכבת מהרחם והשחלות. הרחם הוא מבנה קצר בצורת Y עם קרניים המשתרעות לשני הכיוונים. הקרניים מסתיימות בחצוצרות ובשחלות - הממוקמות ממש מתחת לכליות. השחלות יהיו בעלות משטח מחוספס עקב שלבי התבגרות שונים של הזקיקים.
כדי להסיר את השחלות, יש לחתוך את חיבורי העורקים מלפנים ואת החצוצרה מאחור. כדי להסיר את הרחם, אחזו בעדינות וחתכו מתחת לצוואר הרחם. לאחר החיתוך, הרם את הגוף ואת קרני הרחם ושבר את כל החיבורים בחלל הגוף.
אצל זכרים, אתה יכול גם לצפות בבלוטות הקדם-פוטיאליות הממוקמות ממש לפני הקדם. הם נראים גדולים והם בצבע אפור עד צהבהב עם מראה מוקצף. הסרה וקיבוע של בלוטות אלו דומה לבלוטות תת-לסתיות. בנוסף, מערכת הרבייה הגברית מורכבת משלפוחיות זרע, בלוטת הערמונית והאשכים. שלפוחיות הזרע הן מבנים לבנים, "בצורת קרן איל" הממוקמים בקדמת שלפוחית השתן ומחוברים לקו האמצע בבלוטת הערמונית.
בלוטת הערמונית - בדרך כלל בצבע שזוף בהיר - ממוקמת סביב שלפוחית השתן בבסיס. כדי לדמיין את האשכים, אחוז ברפידות השומן הבטני הממוקמות בבטן התחתונה ומשוך אותן קדימה. זה ימשוך את האשכים משק האשכים כדי לאפשר בדיקה. המשטח צריך להיות חלק עם כלי דם עדינים הניכרים על פני השטח.
האפידידימיס נמצא לאורך השוליים התחתונים של האשך ומתחדד לכיוון החלק העליון. כלי הדם מחוברים לקצה האפידידימיס ומובילים חזרה לערמונית. כדי להסיר את האשכים, חותכים את החיבור בשק האשכים וחותכים את כלי הדם. כדי להסיר את הערמונית ושלפוחיות הזרע, אחוז בבסיס שלפוחית השתן והרם תוך ניתוק החיבורים מתחת לערמונית.
עוברים לאיברים בתוך חלל בית החזה. כדי לחשוף את המבנים החיוניים, הסר את הסרעפת מהחיבור לצלעות. לאחר מכן, חתוך את כלוב הצלעות לרוחב משני הצדדים עד לחלק העליון של עצם החזה של המנובריום, ולאחר מכן שקף את העצמות בגולגולת כדי לדמיין את איברי בית החזה.
הריאות הן בדרך כלל בצבע ורוד בהיר, במרקם ספוגי עם משטח חלק. עם זאת, המתת חסד עם CO2 עלולה לגרום לדימומים ריאתיים, וכתוצאה מכך לכתמים אדומים כהים שיכולים לכסות את כל משטחי הריאות.
הלב אדום כהה והחדרים שריריים, שמרגישים יציבים למגע. הפרוזדורים בצבע אדום כהה יותר ויושבים בחלק העליון של החדרים. הם הרבה פחות שריריים ונראים רפויים. קרום שקוף דק הנקרא שק קרום הלב מקיף את הלב.
בלוטת התימוס ממוקמת קדמית ללב ויושבת מעל קנה הנשימה. זה צריך להיות חלק במרקם. אתה יכול לראות את קנה הנשימה כפי שתואר קודם, והוושט הוא צינור דק מאוד שנמצא ישירות מאחורי קנה הנשימה ומאחורי הלב ועובר דרך הסרעפת לקיבה.
כדי להסיר את האיברים בחלל בית החזה, התחל באחיזת קנה הנשימה ממש מעל התימוס ובצע חתך מאונך ממש לפני המלקחיים. תוך שמירה על האחיזה, הרם את קנה הנשימה כלפי מעלה בזנב וחתוך את כל החיבורים של הריאות למשטח עמוד השדרה בכלוב הצלעות. ייתכן שיהיה צורך לחתוך את הוושט כדי להיות מסוגל להרים את הלב והריאות מחלל החזה
לאחר הסרת הלב לגוף, שטפו אותו במי מלח כדי להסיר שאריות דם וקרישי דם, או מלאו אותו בקיבוע דרך אבי העורקים. לאחר כריתת הריאות, הניחו קשירה רופפת סביב קנה הנשימה. לאחר מכן, השחילו מחט המחוברת למזרק המכיל את הקיבוע ללומן קנה הנשימה, והדקו את הקשירה. לאחר מכן הזריק את הקיבוע עד שהריאות מנופחות. לבסוף, הסר את המחט והדק את הקשירה עוד יותר כדי למנוע דליפה.
עם משב הרוח הזה של ידע לגבי נתיחת המכרסמים וקצירת הרקמות, בואו נסתכל על כמה מניסויי המעבדה הנוכחיים הכוללים את ההליכים האלה.
נתיחה אבחנתית היא נקודת קצה נפוצה בניסויי גרורות סרטניות. בדוגמה זו, החוקרים הזריקו תאים סרטניים לטחול של המכרסם ואז, שלושים עד שישים יום לאחר מכן, הם ביצעו נקרופסיה, שגילתה גרורות משמעותיות בכבד.
מיצוי רקמות מלווה לרוב בניתוח היסטולוגי, המסייע בחקר האנטומיה המיקרוסקופית של הדגימה. על ידי ביצוע פרוטוקול הקיבוע, ההטמעה, החיתוך והצביעה של רקמות, החוקרים מסוגלים לחקור את המבנים המיקרוסקופיים באיברים אלה, ולחשוף את ההשפעה של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות ברמה האטומית.
לפעמים חוקרים מסירים רקמות כדי לחקור תהליכים פיזיולוגיים, כמו אנגיוגנזה. כאן, הנסיינים החצינו את הרקמה המזנטרית של חולדה כדי לעורר את צמיחת כלי הדם. לאחר מכן, הם אספו כמה חלקים, וטיפלו בהם בסמנים שמכתימים את התאים של כל כלי דם, כדי לחקור את הדינמיקה התאית המעורבת בצמיחת רשת כלי הדם.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE המפרט את השלבים של נתיחה אבחנתית וקצירת רקמות בחיות מעבדה. חשוב להשתמש בטכניקות מתאימות להסרת איברים ושימורם, כך שלהליך המיצוי לא תהיה השפעה על פרשנות הנתונים שנאספו. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is necropsy necessary when alternative research methods are available?
Necropsy is essential when new approach methodologies like organ-on-chip systems, organoids, and in silico models cannot capture whole-body effects such as metastasis, long-term toxicity, or causes of unexpected death. These alternatives lack the complexity to replicate systemic interactions, making necropsy critical for comprehensive postmortem analysis and understanding disease progression in living organisms.
Q2: What is the purpose of using 10% neutral buffered formalin in tissue preservation?
Neutral buffered formalin is the standard fixative used to preserve collected tissues for histological examination. It prevents tissue decay, autolysis, and putrefaction while stopping ongoing biochemical reactions and increasing mechanical strength and stability. Proper fixation is critical because tissue samples must be approximately 0.5-1 cm thick to allow sufficient penetration of the fixative solution.
Q3: How does the euthanasia method impact tissue quality in necropsy procedures?
The euthanasia method significantly affects sample quality. Carbon dioxide is commonly used because it causes animals to lose consciousness before pain perception, minimizing distress. However, CO2 euthanasia can cause fluid accumulation in lungs and trachea, appearing as frothy clear fluid, and may result in pulmonary hemorrhages visible as dark red splotches on lung surfaces, affecting histological interpretation.
Q4: What is blunt dissection and why is it important during necropsy?
Blunt dissection is a technique where scissors are used to spread tissues rather than cut them, with closed tips pushed into tissue and then opened to split along natural planes. This method requires patience and a delicate touch because it separates structures without cutting, preventing damage to adjacent organs and blood vessels that could compromise sample integrity and obscure pathological findings.
Q5: What organs should be examined in the abdominal cavity during necropsy?
Key abdominal organs include the spleen, stomach, small intestines (duodenum, jejunum, ileum), large intestine, cecum, pancreas, kidneys, and liver. Each organ requires careful observation for abnormalities in size, color, texture, or contents. The mesentery anchoring intestines should be examined for enlarged lymph nodes and masses. Changes in these organs may indicate inflammation, obstruction, infection, or other pathology affecting study results.
Q6: How are reproductive organs harvested differently in male and female rodents?
In females, the Y-shaped uterus with extending horns and ovaries located below kidneys are removed by cutting arterial attachments and the fallopian tube. In males, the seminal vesicles, prostate gland, and testes are harvested by grasping abdominal fat pads to expose testes, then cutting scrotal attachments and the vas deferens. Both require careful examination for changes in size, symmetry, color, or texture indicating disease.
Q7: What special technique is required when removing and preserving lungs during necropsy?
After lung excision, a loose ligature is placed around the trachea. A needle attached to a syringe containing fixative is threaded into the trachea lumen, the ligature is tightened, and fixative is slowly injected until lungs are gently inflated without overdistension. This crucial step prevents alveolar collapse and allows accurate histological assessment of lung tissue structure and pathology.