1. הכנה
2. קצירת רקמות
מקור: קיי סטיוארט, RVT, RLATG, CMAR; ואלרי א. שרודר, אר.די.ג'י, אר-אל-ג'י. אוניברסיטת נוטרדאם, IN
בשנת 1959 הוצגו ה-3 R's על ידי ו.M ב ראסל ור.ל. ברץ'…
1. הכנה
2. קצירת רקמות
ניסויים רבים דורשים איסוף תאים מהרקמה שנכרתה. במקרים כאלה, חובה לבצע את הליך קצירת הרקמות בצורה סטרילית. השימוש בקווי תאים ותרביות רקמה שמקורם בחיות מחקר מאפשר לערוך ניסויים רבים במבחנה, מה שבתורו מפחית את השימוש בבעלי חיים במחקר.
בסרטון זה, נדון בשיטה האספטית לקצירת איברים שמופקים בדרך כלל מחיות מעבדה. ואחריה תהיה סקירה קצרה של כמה ניסויים לדוגמה המשתמשים בטכניקה סטרילית זו כדי להשיג מטרות מחקר שונות.
נתחיל בשלבי ההכנה הנדרשים כדי להבטיח סטריליות של החלל, המכשירים וכוח האדם במהלך קציר רקמות בעלי חיים.
הליך זה מבוצע במכסה מנוע זרימה למינרית. לפני התהליך, מאוורר מכסה המנוע צריך לפעול לפחות 15 דקות ויש לחטא את האזור ב-70% אלכוהול. לאחר מכן, הניחו כמה מגבות נייר במכסה המנוע והרטיבו אותן ב-70% אתנול. לאחר מכן, טען את הציוד הסטרילי והתארגן לפי סדר השימוש בכל מכשיר, בדרך כלל משמאל לימין. זה מאפשר לזרימת העבודה להתרחש בצורה חד כיוונית, ולמנוע זיהום מקרי מפגר החיה.
מומלץ שיהיה נוכח טכנאי לא סטרילי כדי לסייע לטכנאי הסטרילי. שני המפעילים חייבים ללבוש מסכה ובופנט. על הטכנאי הסטרילי ללבוש חלוק סטרילי ושני זוגות כפפות כירורגיות סטריליות. שימו לב שהחלוק והכפפות חייבים לכסות את פרקי כף היד כדי למנוע שפיכת תאי עור לחלל הגוף הפתוח, צלחות פטרי או מדיה סטרילית.
האדם הלא סטרילי פותח את חבילת המכשירים הסטריליים מבלי לגעת במשטח הפנימי, כך שהאדם הסטרילי יוכל להסיר את הכלי באופן אספטי. לבסוף, הטכנאי הלא סטרילי ממית את החיה, מניח את הפגר על מגבות הנייר ומשרים אותו לחלוטין ב-70% אלכוהול, כך שהאדם הסטרילי יוכל להתחיל בקציר.
ראשית, נסקור את מיצוי איברי הבטן, כולל הטחול, הכבד, הכליות, השחלות והאשכים.
בעזרת סט של מספריים ומלקחיים סטריליים יוצרים חתך אופקי בעור ממש לפני הקדם אצל זכרים ועצם האגן אצל נקבות. הימנע מחיתוך שרירי הבטן. לאחר מכן, הניחו את האגודל מתחת לחתך ותפסו את קצה הגולגולת של החיתוך. בעזרת היד השנייה, החזק היטב את הגפיים האחוריות והזנב, תוך משיכת העור לכיוון הראש. העור ייקרע מהגוף ממש מעל הגפיים האחוריות, וניתן להפוך אותו מבפנים החוצה מעל הראש והרגליים הקדמיות. זה מסיר ביעילות מזהמי שיער שעלולים להפריע לקצירת האיברים הסטריליים. לאחר מכן, יש להשרות את הגוף שוב ב-70% אלכוהול ולהסיר את זוג הכפפות השטחיות, שכבר אינן סטריליות. השליכו גם את כל המכשירים ששימשו על העור.
כדי לקצור את הטחול, מקם את הגוף בשכיבה רוחבית ימנית. הטחול צריך להיות גלוי דרך שריר הבטן. השתמש במספריים כדי לבצע חתך ישירות מעל הטחול, ולהחזיר בעדינות את האיבר מחלל הגוף. חתוך את כל החיבורים בין הטחול לקיבה ולרקמת הלבלב, אך הימנע מניקוב או קריעת האיבר.
כדי לקצור את כל שאר איברי הבטן, הנח את הגוף בשכיבה גבית. לאחר מכן, הרם וחתך את שריר הבטן והשאיר פתח סגלגל ישירות מעל חלל הבטן. כדי לקצור את הכבד, החזר את האיבר בזנב הרחק מהסרעפת. כעת השתמש במספריים כדי לחתוך בזהירות את כל הממברנות בין שני המבנים. לאחר מכן, בצע חתך בניצב לעמוד השדרה דרך כלי הדם. לאחר מכן הרם את הכבד והחזיר אותו לכיוון הסרעפת כדי לדמיין את החיבורים שמתחתיו. יהיו ממברנות דקות המחברות את אונות הכבד הקטנות יותר לקיבה ולמעי הדק. אחוז בצומת הסיבי במרכז הכבד בצד התחתון והרם את האיבר כדי למצוא את כל הקבצים המצורפים. כעת הפרד את האיבר מהרקמות הבסיסיות. שימו לב שהכבד שביר וניתן לנקב אותו בקלות וכתוצאה מכך שחרור יתר של דם. לכן, יש לטפל בזה בזהירות.
כדי לקצור את הכליות, דחפו את המעיים שמאלה כדי לחשוף את הכליה הימנית או ימינה כדי לחשוף את הכליה השמאלית. כעת השתמש בלהבי המלקחיים כדי לתפוס מתחת לכליה ובעזרת מספריים שנחתכו מתחת למלקחיים, הוציאו את האיבר מהגוף.
כדי לקצור את השחלות, הזיזו את המעיים בגולגולת כדי לדמיין את הרחם. עקוב אחר קרני הרחם השמאלית והימנית אל השחלות. אלה איברים קטנים ואצל בעלי חיים מבוגרים הם עשויים להיות מוטבעים בשומן. החלק את המלקחיים מתחת לשחלה כדי לבודד אותה מהגוף ולחתוך אותה מהשומן והחצוצרה.
אצל גברים, כדי להסיר אשכים, אחזו בעדינות בכרית השומן המפשעתי ומשכו קדימה. זה ימשוך את האשך משק האשכים. ברגע שהם נראים לעין, חתכו את החיבורים לשק האשכים ולכלי הדם כדי לשחרר את המבנים הללו מהגוף.
לאחר מכן, בואו נלמד כיצד לקצור איברי בית החזה, כמו הלב והריאות. הלב והריאות מוסרים בקלות רבה יותר יחד. כדי לפתוח את חלל בית החזה, התחל בהנחת החיה בשכיבה גבית. ראשית, תפוס והרם את תהליך ה-xiphoid. לאחר מכן בצע חתך דרך שריר הבטן רק זנב לצלעות. הרחב את החתך לאורך העקומה התחתונה של כלוב הצלעות משני הצדדים, וחשוף את הסרעפת.
לאחר מכן, נקב את הסרעפת על ידי ביצוע חתך קטן בכלוב הצלעות בנקודה הצדדית ביותר האפשרית מכל צד. לאחר מכן, חתוך את הסרעפת מהצלעות. כעת הרם את הצלעות ב- xiphoid כדי לדמיין את איברי בית החזה. הרחב את החתך הרוחבי לחלק העליון של עצם החזה משני הצדדים כדי לפתוח את החזה. לאחר מכן הניחו את המלקחיים בניצב לקנה הנשימה ותפסו את קנה הנשימה בחוזקה. כעת, בעזרת מספריים, בצע חתך בניצב ממש לפני המלקחיים. זה אמור לחתוך את קנה הנשימה והוושט. מבלי לשחרר את האחיזה בקנה הנשימה, הרם אותו בזנב וחתוך את כל חיבורי הריאות למשטח עמוד השדרה בכלוב הצלעות. המשך עד שתוכל להרים את הלב והריאות ללא חלל החזה.
כדי להסיר רק את הלב, הרם את האיבר וחתוך בזהירות את שק קרום הלב. לאחר מכן, החזק את אבי העורקים עם המלקחיים ובצע חתך דיסטלי למלקחיים. לאחר מכן חתכו את הווריד הנבוב הקדמי, עורקי הריאה והוורידים. לאחר מכן, אתה אמור להיות מסוגל להרים את הלב ללא חלל בית החזה.
כעת, בואו נסקור את הליך קצירת המוח בטכניקה אספטית. במקרים שבהם המוח הוא האיבר היחיד שנאסף, שלבי ההכנה זהים.
כדי להתחיל את הקציר, יש להרוות את הגוף באלכוהול, ולהפשיט את העור מהגוף כמו קודם - למעלה ומעל הגולגולת. זה מאפשר לכל דבר להיות סטרילי מנקודה זו והלאה. לאחר מכן, יש להרוות את החיה שוב באלכוהול, להסיר את הכפפות החיצוניות ולהשליך את המכשירים המשמשים על העור. כעת בצע חתך בעורף והאריך אותו לאורך קו האמצע מאזור צוואר הרחם הגבי לקצה האף.
כעת, בעזרת זוג מספריים סטריליים לקצירת מוח, בצע חתך דרך עמוד השדרה בבסיס הגולגולת. כדי לפתוח את הגולגולת, הניחו את חוד המספריים במגנום הנקב וחתכו לאורך קו האמצע. שימו לב שבמהלך הליך קצירת מוח זה, יד אחת נחשבת לא סטרילית מכיוון שהיא תופסת את העור מהגולגולת המשתקפת מתחת לסנטר כדי לייצב את הראש, בעוד שהיד הסטרילית משמשת לחיתוך הגולגולת. לאחר מכן, השתמש בקצה השטוח של להב המספריים כדי למנף את העצמות הקודקודיות הרחק מהמוח. ובאמצעות המרית, שבש בזהירות את חיבורי העצבים בגזע המוח ואת הכיאזמה האופטית מתחת למוח. לבסוף, החלק את המלקחיים הסגורים מלפנים ושבור את החיבורים בנורות הריח. ואז ניתן להפיל את המוח מהגולגולת ישירות לתוך המדיה הסטרילית.
כעת, לאחר שסקרנו את היסודות של קצירת רקמות סטריליות, בואו נדון בכמה מהשימושים הרבים של הליך זה במחקר ביו-רפואי.
חוקרי גזע עצבי משתמשים בטכניקת קציר סטרילית כדי לחלץ רקמה ממוח יילוד של עכבר, כדי לגדל תאים אלה במבחנה. זה מאפשר להם לחקור את תפקידם של תאי גזע עצביים בהתפתחות ובהתקדמות הסרטן.
תחום מחקר פעיל נוסף הכולל קצירת רקמות הוא פרופיל מטבולי, הכולל חקר פיזיולוגיה של רקמות על ידי ניתוח המטבוליטים השונים בדגימה. בדוגמה זו, מדענים, באמצעות טכניקה אספטית, אספו ביופסיות כבד מעכברים מסוג בר וללא חיידקים והשתמשו בספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית, או NMR, כדי להבהיר את ההבדל בפרופיל המטבולי של הכבד של שתי אוכלוסיות בעלי החיים.
לבסוף, אימונולוגים מבצעים לעתים קרובות קצירת רקמות סטריליות כדי לחקור את התפשטות הזיהום. בניסוי הספציפי הזה, החוקרים ביצעו הזרקה תוך קנה הנשימה של חיידק Pseudomonas aeruginosa כדי לגרום לזיהום ריאות כרוני. לאחר מכן, בעלי חיים הומתו והריאות חולצו בטכניקה אספטית כדי לקבוע את העומס החיידקי ב-3, 7, 14 ו-28 ימים לאחר ההדבקה.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על קצירת רקמות מחיות מעבדה בטכניקה אספטית. כעת עליך להבין טוב יותר את הצעדים שעליך לנקוט כדי להבטיח שהסטריליות תישמר לאורך כל הקציר. ואתה אמור להיות מסוגל לחלץ את איברי הבטן ובית החזה, ואת המוח מבעלי חיים אלה מבלי לגרום נזק לרקמה. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is sterile tissue harvest important in laboratory animal research?
Sterile tissue harvest prevents contamination of cells and organs collected from research animals, which is essential for cell and tissue cultures, protein and RNA analysis, and metabolic profiling. Using harvested tissues for in vitro experiments reduces overall animal usage in research, supporting the replacement principle of the 3 R's framework for humane research practices.
Q2: What equipment and preparation are needed before starting a sterile tissue harvest?
The procedure requires a laminar flow hood running for at least 15 minutes before use. Disinfect the hood with 70% alcohol and place wet paper towels inside. Arrange sterile instruments in order of use from left to right to maintain unidirectional workflow. The sterile technician must wear a sterile gown and two pairs of sterile surgical gloves covering the wrists to prevent skin cell contamination.
Q3: How are abdominal organs like the liver and spleen removed during sterile harvest?
For the spleen, position the animal in right lateral recumbency and cut directly over the organ, gently retracting it while avoiding punctures. For the liver, place the animal in dorsal recumbency, reflect it away from the diaphragm, and carefully sever membranes and blood vessels. The liver is fragile and easily punctured, so handle it carefully to prevent excessive blood release that could compromise tissue quality.
Q4: What is the proper technique for harvesting the heart and lungs together?
Place the animal in dorsal recumbency and open the thoracic cavity by cutting through the abdominal muscle and diaphragm. Puncture the diaphragm at the lateral rib cage and extend cuts to the sternum. Grasp the trachea with forceps and sever it with scissors, then lift and remove lung attachments from the spinal surface until the heart and lungs can be lifted free from the chest cavity.
Q5: How is the brain harvested using aseptic technique?
Strip the skin from the body and over the skull, then saturate with alcohol and remove outer gloves. Make a cut along the midline from the cervical area to the nose. Using dedicated sterile scissors, cut through the spine at the skull base and along the midline through the foramen magnum. Lever the parietal bones away, disrupt nerve attachments with a spatula, and break olfactory bulb attachments with forceps before dropping the brain into sterile media.
Q6: What research applications use sterile tissue harvest techniques?
Neural stem researchers extract tissue from mouse neonatal brains to study stem cell development and cancer progression in vitro. Metabolic profiling studies analyze tissue metabolites using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Immunologists harvest lungs aseptically to measure bacterial load in infection models, collecting samples at multiple time points to track disease progression.
Q7: What roles do sterile and non-sterile technicians play during tissue harvest?
Both technicians wear masks and bouffants. The non-sterile technician euthanizes the animal, places the carcass on paper towels, soaks it with 70% alcohol, and opens sterile instrument packages without touching inner surfaces. The sterile technician wears a sterile gown and two pairs of gloves, removes instruments aseptically, and performs the actual organ extraction to maintain sterility throughout the procedure.
פרקים בסרטון זה
0:00
Overview
1:06
Prepping for Sterility: Space, Instruments, and Personnel
3:04
Harvesting Abdominal Organs
7:08
Harvesting Thoracic Organs
9:12
Harvesting Brain
11:00
Applications
12:02
Summary