Name: שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: חקור שיטות מולקולה בודדת לניטור שינויים בתכונות אלסטיות של bilayer באמצעות ערוצי gramicidin. הפרוטוקול מספק כלי אמין לחקר דינמיקת ממברנות ותפקוד חלבוני ממברנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

בקר <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">הפרוטוקולים שפרינגר</a> לקבלת מידע נוסף אודות הכנת bilayers מלאכותית באמצעות ערוצים gramicidin עבור חיטוט גמישות הממברנה.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. תקנה זאת בשל שילוב של שומנים אינטראקציות חלבון ספציפי כלליות יותר bilayer אינטראקציות חלבון שומנים. אינטראקציות אלה חשובות במיוחד במחקר תרופתי, כמו תרופות רבות כיום בשוק יכולים לשנות את bilayer השומנים חומר נכסים, אשר יכול להוביל לתפקוד קרום חלבון שונה. הקמת ערוצי gramicidin תלויים שינויים קונפורמציה יחידות משנה gramicidin אשר בתורו תלוי את המאפיינים של שומנים בדם. לפיכך הנוכחית ערוץ gramicidin הוא כתב של נכסים שונה של bilayer בשל תרכובות מסוימות.

חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. זה וידאו המאמר מפרט כיצד ליצור תיקון באמצעות אלקטרודות תיקון bilayer, כמו גם כיצד להשתמש ערוצי gramicidin כמו כתבים של תכונות הממברנה משתנה.

תפקוד חלבוני ממברנה מוסדר על ידי הרכב הליפידים של ממברנת התא. ויסות זה נובע משילוב של אינטראקציות ספציפיות בין ליפידים לחלבונים...

שלום, אני ד"ר Ola Anderson מהמחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה ב-Weill Cornell Medical College בניו יורק. שמי Olson. אני סטודנט למדיצינה חישובית במעבדה של Olive Anderson.ואני שייל קולניגווד, טכנאי מחקר גם אני ממעבדתו של אנדרסון. היום נראה לכם כיצד ליצור מישור, שכבה ביולוגית, כיצד לבודד ממברנה קטנה באמצעות אלקטרודת חריצה לשכבות ביולוגיות, כיצד להקליט פעילות של תעלה בודדת וכיצד לנתח את התוצאות, ובכך להשתמש בתעלות Gramin כגששים של תכונות השכבה הביולוגית של ליפידים. בסרטון קודם, הראינו לכם כיצד להיערך לניסויים אלו.הראינו לכם כיצד להכין את התא שבו השתמשנו, והראינו לכם כיצד להכין את אלקטרודת הניקור (punch electrode) לשכבה כפולה שבה אנו משתמשים כדי לבודד את שכבת הממברנה הקטנה שבה אנו מקליטים את פעילות התעלים. לכן, בואו ננקב מספר שכבות כפולות. כדי להתחיל בהכנה לניסויי שכבה כפולה, העבירו 2.5 mL של תמיסת אלקטרוליט שהגיע לטמפרטורת שיווי משקל לכל אחד מהמדורים של התא שציירנו מראש. התמיסה שבה אנו משתמשים בדרך כלל היא sodium chloride בריכוז 1 M בתוספת 10 mM.יש לשטוף את החלק עם תמיסת בופר ב-pH 7, ולכוון את המיקרוסקופ ואת מקור האור כך שהחור בטפלון יהיה במרכז שדה הראייה ומואר היטב. הכנס את המיקרו-פיפטת זכוכית למחזיק מיקרו-אלקטרודות. חבר מזרק למחזיק באמצעות קטע של צינור טיגון (tigon).מלאו את הפיפטה בתוך תוכן האלקטרודה באמצעות שאיבה. היזהרו להמנע מבועות, שכן הן עלולות לקטוע את החיבור החשמלי בין גרגיר הכסף בתוכן האלקטרודה לבין קצה הפיפטה. מרחו כמות קטנה של וזלין על הבורג, ולאחר מכן מקמו אותו בתוכן המיקרו-אלקטרודה.הוזלין מסייע ביצירת אטם הרמטי. חבר את מחזיק האלקטרודה לראש הבמה של ה-patch clamp בתוך כלוב פאראדיי. מקם את קצה המיקרופיפטה במרכז, ממש מאחורי החור במחיצת הטפלון.הנח את אלקטרודת הכסף המגולגלת לתוך התא הקדמי. קבע אותה במקומה באמצעות פלסטלינה וחבר אותה למעגל בקרת המתח. לבסוף, בצע איזון של האלקטרודות.דבר זה הוא קריטי מכיוון שלשתי האלקטרודות, זו שבחזית וזו שבמחזיק המיקרו-אלקטרודה, עשויים להיות פוטנציאלי חצי-תא שונים מעט. פוטנציאל חצי-התא הוא ההפרש בין מתכת הכסף לבין האלקטרודה ותמיסת האלקטרוליט הסמוכה לציפוי כסוף הכלוריד. יש לאזן את האלקטרודות על ידי כיוון ההיסט (offset) הידני, כך שהזרם הזורם בין שני התאים יתנודד בין 200- ל-200+ picoamps במכשיר ה-patch clamp.פוטנציאל ההיסט ישתנה עם הזמן, לכן יש לאזן את האלקטרודות במרווחי זמן קבועים לאורך הניסוי כדי ליצור את ממבנה השכבה הליפידית. נקה פיפטה בעלת קצה מלוט (fire polished) באמצעות תמיסת fch כפי שמתואר בסרטון הנלווה. טבול את הפיפטה הנקייה בתמיסת הליפידים ואפשר לה לעלות כמילימטר אחד לתוך הפיפטה.מקמו את קצה הפ pipette בדיוק לפני החור במחיצת הטפלון ומרחו בעדינות בועה של תמיסת הליפידים על החור. כאשר הפעולה מצליחה, נוצרת בועה ליפידית צבעונית על פני החור, כאשר מבנה דמוי טורוס או דונט של ליפידים מחבר אותה למחיצת הטפלון. המתינו עד שהממברנה תדקק, פעולה שניתן להקל עליה על ידי החלת פוטנציאל של 100 עד 200 millivolt על פני הממברנה.הניחו את קצה מיקרו-פיפטת הזכוכית בתוך ה-Taurus והמתינו מספר דקות כדי להבטיח אטימה טובה יותר בין הפיפטה לשכבה הכפולה. בנקודה זו, ניתן לבודד פיסות ממברנה (membrane patch) באמצעות מיקרו-פיפטת זכוכית. כעת, בצעו דופינג (dope) לממברנה באמצעות גרמין (gramin).תמיסת גרמין זו הוכנה מתוך תמיסת מלאי בריכוז 1 µM שדוללה לריכוזים של 1 עד 10 nM. ב-dimethyl sulf oxide, בדרך כלל מוסיפים 1 עד 10 µL מהדילול לכל צד של הממברנה, כך שהריכוז הסופי יהיה בטווח ה-picoMolar. השתמשו במגנטים למערבולת כדי לערבב את התמיסה למשך כשתי דקות והמתינו 10 דקות נוספות לפני יצירת ממברנה קטנה חדשה להקלטת פעילות של תעלה בודדת.זמן המתנה זה מאפשר לגרמין (gramin) להשתלב בממברנה. בדוק את פעילות התעלות על ידי הפעלת מתח. בדרך כלל, אנו שואפים לכ-אירוע תעלה אחד לשנייה.התעלים נראים כשינויים נפרדים כלפי מעלה וכלפי מטה בזרם הממברנה. כעת ניתן להתחיל בניסוי בפועל. ראשית, הקליטו את עקומות זרם הבקרה.אזנו את האלקטרודה כפי שהודגם קודם לכן, וצור ממברנה או טלאי (patch) קטן כפי שמתואר בסרטון הנלווה. החל 200 millivolts חיוביים והקלט את פעילות הערוץ הבודד. עליך לאסוף בין 100 ל-200 מעברים של זרם בערוץ בודד.חזור על שלב זה עם 200- מיליוולט. שבור את ה-patch על ידי פליטת אלקטרוליט דרך קצה הפיפטה. בעזרת בורג הניילון, איזן מחדש את האלקטרודות, החזר את הפיפטה לתא האחורי, פלוט את השומן העודף וצור patch חדש.ניתן לחזור על שלבים אלו כדי לדרוש הקלטות בפוטנציאלים אחרים. כעת אתם מוכנים להקליט את עקומות הזרם הניסיוניות בנוכחות המודיפיקטור של השכבה הכפולה. במקרה זה, הנוגד דיכאון fluoxetine לשני צדי הממברנה.יש לדלל את תמיסת המלאי של ה-fluoxetine לריכוז של 25 millimolar ב-DMSO. הוסף חמישה µL מתמיסה זו כדי להגיע לריכוז של 50 micromolar בתא. DMSO עלול להשפיע על תכונות השכבה הכפולה. לכן, חשוב להגביל את כמות ה-DMSO בתמיסה ל-25 µL, 1% או 150 millimolar.ערבבו במשך חמש דקות והמתינו 10 דקות כדי לאפשר למודיפייר להגיע לשיווי משקל בין התמיסה המימית לממברנה. כעת, רשמו את פעילות התעלה כפי שתואר קודם לכן בנוכחות המודיפייר. חזרו על שלבים אלה כדי לרשום את פעילות התעלה בריכוזים עולים של המודיפייר.אנו לומדים רבות על שינויים בשכבה הכפולה באמצעות כימות זמני החיים של התעלות וקצבי ההופעה שלהן. כדי לבצע ניתוח כזה, עלינו לזהות את היווצרותם והיעלמותם של התעלות. כאן אנו משתמשים באלגוריתם המבוסס על מעברים, שבו המחשב מחשב את הנגזרת הראשונה כדי לקבוע שינויים מהירים בזרם ומסמן אותם כאירועי תעלה.האירועים נשמרים כסדרה של זמנים כדי לסייע בקביעת זמני החיים של הערוץ לפני ואחרי המעבר. רמות הזרם נשמרות גם הן ומסייעות בקביעת אמפליטודות הערוץ תוך כדי התקדמות הניסוי. המחשב בונה היסטוגרמה של אמפליטודת מעבר הזרם, המאפשרת לעקוב אחר רכישת מעברי הזרם.הדבר מאפשר לכם להעריך את איכות הניסוי. אם אמפליטודות המעבר הנוכחיות מפוזרות בטווח רחב, קיימות בעיות. אם ההיסטוגרמה מרוכזת, אתם פועלים בצורה נכונה.לאחר שצברת יותר מ-200 אירועי מעבר, חשב את הזרם הממוצע ואת סטיית התקן עבור המעברים בשיא המרכזי. ניתן להעריך את קצב הופעת הערוצים פשוט על ידי חלוקת מספר המעברים בהיסטוגרמת אמפליטודת המעבר הנוכחית בזמן התצפית. זכור לחלק גם בשניים, מכיוון שערוץ נספר פעמיים בהיסטוגרמה – פעם אחת כאשר הוא מופיע ופעם אחת כאשר הוא נעלם.נתחו את סדרת הזמנים של אירועי המעבר כדי לקבל את התפלגיות זמני החיים של התעלה. קביעת זמני החיים היא פשוטה בעקומות זרם שבהן אין יותר מתעלה מוליכה אחת בכל רגע נתון. במקרה זה, המחשב מזהה אם כל מעבר הוא הופעה של תעלה או היעלמות שלה, ואירוע היעלמות יכול להשתייך רק לאירוע ההופעה שקדם לו.הזמן בין שתי המעברים הוא אורך חיי הערוץ. במקרים שבהם המעברים בערוץ מתרחשים קרוב מדי מכדי שניתן יהיה להבחין ביניהם, יש להקצות ידנית את המופעים וההיעלויות. ההקצאה מורכבת יותר במקרה שבו קיימים שני ערוצים או יותר הפועלים בו-זמנית, כיוון שבמצב זה לא ניתן לדעת לאיזה מופע של ערוץ שייכת היעלות של ערוץ מסוים.מסיבה זו, עדיף שתהיה פעילות ערוצים נמוכה. ניתן לפתור את בעיית ההקצאה באמצעות מחולל מספרים אקראיים כדי להקצות הופעות להיעלמויות. באופן זה, מתקבלת סדרה של זמני חיים של ערוצים.נתון זה מומר להיסטוגרמה של זמני חיים, אשר מומרת בתורה לגרף הישרדות; קבע את זמן החיים הממוצע על ידי התאמת התפלגות מעריכית בודדת לגרף ההישרדות באמצעות התאמת עקומה של ריבועים פחותים לא-לינאריים ובניסויים שבהם הממברנה הגדולה אינה נשברת. כאשר מוסיפים את המשנה של השכבה הכפולה, ניתן להשוות את ההשפעה על קצבי הופעת התעלות. השוואה כזו אינה מוצדקת אם הממברנה הגדולה נשברת; תפקוד חלבון הממברנה מווסת על ידי הרכב הליפידים של ממברנת התא.ויסות זה נובע משילוב של אינטראקציות ספציפיות בין ליפידים לחלבונים ואינטראקציות כלליות יותר בין השכבה הליפידית הד双ית לבין חלבוני הממברנה. אינטראקציות אלו חשובות במיוחד במחקר פרמקולוגי, מכיוון שתרופות רבות הנמצאות כיום בשוק הן אמפיפיליות ויכולות לשנות את תכונות השכבה הליפידית הד双ית, דבר שעלול להוביל בתורו לשינוי בתפקוד חלבוני הממברנה.ניתן להשתמש בערוצי גרמין (Gramin) כממירים של כוח מולקולרי כדי לבחון אם אמפיפילים יכולים לשנות את תכונות השכבה הליפידית הכפולה. שרטוט השינויים בחיי המדידה ובקצב ההופעה כפונקציה של ריכוז החומר המשנה מספק תובנה לגבי שינויים בתכונות השכבה הכפולה.תדירות מוגברת פירושה שהשכבה הכפולה ניתנת לעיוות בקלות רבה יותר כדי להכיל את אתר ה-Gram ודימריזציה. זמן חיים מוגבר פירושו שהעיוות של השכבה הכפולה הקשור להיווצרות התעלה אינו דורש השקעה אנרגטית רבה כל כך. מווסת עשוי להעלות את התדירות ואת זמן החיים על ידי הגברת אלסטיות הממברנה או השפעה על העקמומיות.הדגמנו כעת כיצד להשתמש בערוצים כרומטיים כדי לבדוק אם מולקולות קטנות משנות את תכונות השכבה הכפולה האלסטית. וזהו. תודה שצפיתם.בהצלחה בניסויים שלכם.

single-molecule-methods-for-monitoring-changes-bilayer-elastic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

כאן, אנו מציגים טיפול נסיוני זה יכול להיות מועסק כדי לקבוע את הזיקות מחייב ואת מצב של האינטראקציה של פוספוליפיד מחייב חלבון ללא תווית annexin A2 עם קיבוע הנתמכות על-ידי מוצק bilayers (סאט גלובל) על ידי מדידת בו זמנית ספיגת המוני, המאפיינים viscoelastic של החלבון annexin A2.

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים להכנת מדגם, הפחתת נתונים וניתוח נתונים במחקרי הד ספין נויטרונים (NSE) של ממברנות השומנים. תיוג דיטריום נבון של שומנים מאפשר גישה לדינמיקה שונה של ממברנה על קשקשי אורך וזמן מזוסקופיים, שעליהם מתרחשים תהליכים ביולוגיים חיוניים.

ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים כגשוש ייחודי לדינמיקה של קרום השומנים ואינטראקציות בין חלבון ממברנה

הפרוטוקול מציג זרימת עבודה מלאה לניסויים בננו-אינדנציה של חומרים רכים, כולל הידרוג'לים ותאים. ראשית, מפורטים הצעדים הניסיוניים לרכישת נתוני ספקטרוסקופיית כוח; לאחר מכן, הניתוח של נתונים כאלה מפורט באמצעות תוכנת Python קוד פתוח שפותחה לאחרונה, אשר ניתן להוריד בחינם מ- GitHub.

זרימת עבודה ניסיונית וניתוח נתונים עבור ננו-אינדנציה של חומר רך

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

שחזור ללא תאים היה כלי מרכזי להבנת הרכבת השלד של הציטוסקלטון, והעבודה בעשור האחרון ביססה גישות לחקר דינמיקת ספטין במערכות מינימליות. מוצגות כאן שלוש שיטות משלימות לצפייה בהרכבת ספטין בהקשרים שונים של ממברנות: דו-תאיים מישוריים, תומכים כדוריים ותמיכות מוטות.

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

כאן פותחה מערכת דו-שכבתית של שומנים הנתמכת על ידי ננו-ברים כדי לספק קרום סינתטי עם עקמומיות מוגדרת המאפשרת אפיון של חלבונים בעלי יכולת חישת עקמומיות במבחנה.

מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה

מוצגת כאן שיטה לפנוטיפ מכני של תאים בודדים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה הנקראת חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS). פלטפורמה זו שומרת על תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה תוך מדידת התכונות הביופיזיות האלסטיות והצמיגיות של התאים.

חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

חקור שיטות מולקולה בודדת לניטור שינויים בתכונות אלסטיות של bilayer באמצעות ערוצי gramicidin. הפרוטוקול מספק כלי אמין לחקר דינמיקת ממברנות ותפקוד חלבוני ממברנה.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

גלה סרטונים נוספים