שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות
3 בנובמבר 2008
חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. זה וידאו המאמר מפרט כיצד ליצור תיקון באמצעות אלקטרודות תיקון bilayer, כמו גם כיצד להשתמש ערוצי gramicidin כמו כתבים של תכונות הממברנה משתנה.
שלום, אני ד"ר Ola Anderson מהמחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה ב-Weill Cornell Medical College בניו יורק. שמי Olson. אני סטודנט למדיצינה חישובית במעבדה של Olive Anderson.
ואני שייל קולניגווד, טכנאי מחקר גם אני ממעבדתו של אנדרסון. היום נראה לכם כיצד ליצור מישור, שכבה ביולוגית, כיצד לבודד ממברנה קטנה באמצעות אלקטרודת חריצה לשכבות ביולוגיות, כיצד להקליט פעילות של תעלה בודדת וכיצד לנתח את התוצאות, ובכך להשתמש בתעלות Gramin כגששים של תכונות השכבה הביולוגית של ליפידים. בסרטון קודם, הראינו לכם כיצד להיערך לניסויים אלו.
הראינו לכם כיצד להכין את התא שבו השתמשנו, והראינו לכם כיצד להכין את אלקטרודת הניקור (punch electrode) לשכבה כפולה שבה אנו משתמשים כדי לבודד את שכבת הממברנה הקטנה שבה אנו מקליטים את פעילות התעלים. לכן, בואו ננקב מספר שכבות כפולות. כדי להתחיל בהכנה לניסויי שכבה כפולה, העבירו 2.5 mL של תמיסת אלקטרוליט שהגיע לטמפרטורת שיווי משקל לכל אחד מהמדורים של התא שציירנו מראש. התמיסה שבה אנו משתמשים בדרך כלל היא sodium chloride בריכוז 1 M בתוספת 10 mM.
יש לשטוף את החלק עם תמיסת בופר ב-pH 7, ולכוון את המיקרוסקופ ואת מקור האור כך שהחור בטפלון יהיה במרכז שדה הראייה ומואר היטב. הכנס את המיקרו-פיפטת זכוכית למחזיק מיקרו-אלקטרודות. חבר מזרק למחזיק באמצעות קטע של צינור טיגון (tigon).
מלאו את הפיפטה בתוך תוכן האלקטרודה באמצעות שאיבה. היזהרו להמנע מבועות, שכן הן עלולות לקטוע את החיבור החשמלי בין גרגיר הכסף בתוכן האלקטרודה לבין קצה הפיפטה. מרחו כמות קטנה של וזלין על הבורג, ולאחר מכן מקמו אותו בתוכן המיקרו-אלקטרודה.
הוזלין מסייע ביצירת אטם הרמטי. חבר את מחזיק האלקטרודה לראש הבמה של ה-patch clamp בתוך כלוב פאראדיי. מקם את קצה המיקרופיפטה במרכז, ממש מאחורי החור במחיצת הטפלון.
הנח את אלקטרודת הכסף המגולגלת לתוך התא הקדמי. קבע אותה במקומה באמצעות פלסטלינה וחבר אותה למעגל בקרת המתח. לבסוף, בצע איזון של האלקטרודות.
דבר זה הוא קריטי מכיוון שלשתי האלקטרודות, זו שבחזית וזו שבמחזיק המיקרו-אלקטרודה, עשויים להיות פוטנציאלי חצי-תא שונים מעט. פוטנציאל חצי-התא הוא ההפרש בין מתכת הכסף לבין האלקטרודה ותמיסת האלקטרוליט הסמוכה לציפוי כסוף הכלוריד. יש לאזן את האלקטרודות על ידי כיוון ההיסט (offset) הידני, כך שהזרם הזורם בין שני התאים יתנודד בין 200- ל-200+ picoamps במכשיר ה-patch clamp.
פוטנציאל ההיסט ישתנה עם הזמן, לכן יש לאזן את האלקטרודות במרווחי זמן קבועים לאורך הניסוי כדי ליצור את ממבנה השכבה הליפידית. נקה פיפטה בעלת קצה מלוט (fire polished) באמצעות תמיסת fch כפי שמתואר בסרטון הנלווה. טבול את הפיפטה הנקייה בתמיסת הליפידים ואפשר לה לעלות כמילימטר אחד לתוך הפיפטה.
מקמו את קצה הפ pipette בדיוק לפני החור במחיצת הטפלון ומרחו בעדינות בועה של תמיסת הליפידים על החור. כאשר הפעולה מצליחה, נוצרת בועה ליפידית צבעונית על פני החור, כאשר מבנה דמוי טורוס או דונט של ליפידים מחבר אותה למחיצת הטפלון. המתינו עד שהממברנה תדקק, פעולה שניתן להקל עליה על ידי החלת פוטנציאל של 100 עד 200 millivolt על פני הממברנה.
הניחו את קצה מיקרו-פיפטת הזכוכית בתוך ה-Taurus והמתינו מספר דקות כדי להבטיח אטימה טובה יותר בין הפיפטה לשכבה הכפולה. בנקודה זו, ניתן לבודד פיסות ממברנה (membrane patch) באמצעות מיקרו-פיפטת זכוכית. כעת, בצעו דופינג (dope) לממברנה באמצעות גרמין (gramin).
תמיסת גרמין זו הוכנה מתוך תמיסת מלאי בריכוז 1 µM שדוללה לריכוזים של 1 עד 10 nM. ב-dimethyl sulf oxide, בדרך כלל מוסיפים 1 עד 10 µL מהדילול לכל צד של הממברנה, כך שהריכוז הסופי יהיה בטווח ה-picoMolar. השתמשו במגנטים למערבולת כדי לערבב את התמיסה למשך כשתי דקות והמתינו 10 דקות נוספות לפני יצירת ממברנה קטנה חדשה להקלטת פעילות של תעלה בודדת.
זמן המתנה זה מאפשר לגרמין (gramin) להשתלב בממברנה. בדוק את פעילות התעלות על ידי הפעלת מתח. בדרך כלל, אנו שואפים לכ-אירוע תעלה אחד לשנייה.
התעלים נראים כשינויים נפרדים כלפי מעלה וכלפי מטה בזרם הממברנה. כעת ניתן להתחיל בניסוי בפועל. ראשית, הקליטו את עקומות זרם הבקרה.
אזנו את האלקטרודה כפי שהודגם קודם לכן, וצור ממברנה או טלאי (patch) קטן כפי שמתואר בסרטון הנלווה. החל 200 millivolts חיוביים והקלט את פעילות הערוץ הבודד. עליך לאסוף בין 100 ל-200 מעברים של זרם בערוץ בודד.
חזור על שלב זה עם 200- מיליוולט. שבור את ה-patch על ידי פליטת אלקטרוליט דרך קצה הפיפטה. בעזרת בורג הניילון, איזן מחדש את האלקטרודות, החזר את הפיפטה לתא האחורי, פלוט את השומן העודף וצור patch חדש.
ניתן לחזור על שלבים אלו כדי לדרוש הקלטות בפוטנציאלים אחרים. כעת אתם מוכנים להקליט את עקומות הזרם הניסיוניות בנוכחות המודיפיקטור של השכבה הכפולה. במקרה זה, הנוגד דיכאון fluoxetine לשני צדי הממברנה.
יש לדלל את תמיסת המלאי של ה-fluoxetine לריכוז של 25 millimolar ב-DMSO. הוסף חמישה µL מתמיסה זו כדי להגיע לריכוז של 50 micromolar בתא. DMSO עלול להשפיע על תכונות השכבה הכפולה. לכן, חשוב להגביל את כמות ה-DMSO בתמיסה ל-25 µL, 1% או 150 millimolar.
ערבבו במשך חמש דקות והמתינו 10 דקות כדי לאפשר למודיפייר להגיע לשיווי משקל בין התמיסה המימית לממברנה. כעת, רשמו את פעילות התעלה כפי שתואר קודם לכן בנוכחות המודיפייר. חזרו על שלבים אלה כדי לרשום את פעילות התעלה בריכוזים עולים של המודיפייר.
אנו לומדים רבות על שינויים בשכבה הכפולה באמצעות כימות זמני החיים של התעלות וקצבי ההופעה שלהן. כדי לבצע ניתוח כזה, עלינו לזהות את היווצרותם והיעלמותם של התעלות. כאן אנו משתמשים באלגוריתם המבוסס על מעברים, שבו המחשב מחשב את הנגזרת הראשונה כדי לקבוע שינויים מהירים בזרם ומסמן אותם כאירועי תעלה.
האירועים נשמרים כסדרה של זמנים כדי לסייע בקביעת זמני החיים של הערוץ לפני ואחרי המעבר. רמות הזרם נשמרות גם הן ומסייעות בקביעת אמפליטודות הערוץ תוך כדי התקדמות הניסוי. המחשב בונה היסטוגרמה של אמפליטודת מעבר הזרם, המאפשרת לעקוב אחר רכישת מעברי הזרם.
הדבר מאפשר לכם להעריך את איכות הניסוי. אם אמפליטודות המעבר הנוכחיות מפוזרות בטווח רחב, קיימות בעיות. אם ההיסטוגרמה מרוכזת, אתם פועלים בצורה נכונה.
לאחר שצברת יותר מ-200 אירועי מעבר, חשב את הזרם הממוצע ואת סטיית התקן עבור המעברים בשיא המרכזי. ניתן להעריך את קצב הופעת הערוצים פשוט על ידי חלוקת מספר המעברים בהיסטוגרמת אמפליטודת המעבר הנוכחית בזמן התצפית. זכור לחלק גם בשניים, מכיוון שערוץ נספר פעמיים בהיסטוגרמה – פעם אחת כאשר הוא מופיע ופעם אחת כאשר הוא נעלם.
נתחו את סדרת הזמנים של אירועי המעבר כדי לקבל את התפלגיות זמני החיים של התעלה. קביעת זמני החיים היא פשוטה בעקומות זרם שבהן אין יותר מתעלה מוליכה אחת בכל רגע נתון. במקרה זה, המחשב מזהה אם כל מעבר הוא הופעה של תעלה או היעלמות שלה, ואירוע היעלמות יכול להשתייך רק לאירוע ההופעה שקדם לו.
הזמן בין שתי המעברים הוא אורך חיי הערוץ. במקרים שבהם המעברים בערוץ מתרחשים קרוב מדי מכדי שניתן יהיה להבחין ביניהם, יש להקצות ידנית את המופעים וההיעלויות. ההקצאה מורכבת יותר במקרה שבו קיימים שני ערוצים או יותר הפועלים בו-זמנית, כיוון שבמצב זה לא ניתן לדעת לאיזה מופע של ערוץ שייכת היעלות של ערוץ מסוים.
מסיבה זו, עדיף שתהיה פעילות ערוצים נמוכה. ניתן לפתור את בעיית ההקצאה באמצעות מחולל מספרים אקראיים כדי להקצות הופעות להיעלמויות. באופן זה, מתקבלת סדרה של זמני חיים של ערוצים.
נתון זה מומר להיסטוגרמה של זמני חיים, אשר מומרת בתורה לגרף הישרדות; קבע את זמן החיים הממוצע על ידי התאמת התפלגות מעריכית בודדת לגרף ההישרדות באמצעות התאמת עקומה של ריבועים פחותים לא-לינאריים ובניסויים שבהם הממברנה הגדולה אינה נשברת. כאשר מוסיפים את המשנה של השכבה הכפולה, ניתן להשוות את ההשפעה על קצבי הופעת התעלות. השוואה כזו אינה מוצדקת אם הממברנה הגדולה נשברת; תפקוד חלבון הממברנה מווסת על ידי הרכב הליפידים של ממברנת התא.
ויסות זה נובע משילוב של אינטראקציות ספציפיות בין ליפידים לחלבונים ואינטראקציות כלליות יותר בין השכבה הליפידית הד双ית לבין חלבוני הממברנה. אינטראקציות אלו חשובות במיוחד במחקר פרמקולוגי, מכיוון שתרופות רבות הנמצאות כיום בשוק הן אמפיפיליות ויכולות לשנות את תכונות השכבה הליפידית הד双ית, דבר שעלול להוביל בתורו לשינוי בתפקוד חלבוני הממברנה.
ניתן להשתמש בערוצי גרמין (Gramin) כממירים של כוח מולקולרי כדי לבחון אם אמפיפילים יכולים לשנות את תכונות השכבה הליפידית הכפולה. שרטוט השינויים בחיי המדידה ובקצב ההופעה כפונקציה של ריכוז החומר המשנה מספק תובנה לגבי שינויים בתכונות השכבה הכפולה.
תדירות מוגברת פירושה שהשכבה הכפולה ניתנת לעיוות בקלות רבה יותר כדי להכיל את אתר ה-Gram ודימריזציה. זמן חיים מוגבר פירושו שהעיוות של השכבה הכפולה הקשור להיווצרות התעלה אינו דורש השקעה אנרגטית רבה כל כך. מווסת עשוי להעלות את התדירות ואת זמן החיים על ידי הגברת אלסטיות הממברנה או השפעה על העקמומיות.
הדגמנו כעת כיצד להשתמש בערוצים כרומטיים כדי לבדוק אם מולקולות קטנות משנות את תכונות השכבה הכפולה האלסטית. וזהו. תודה שצפיתם.
בהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מאמר-וידאו זה מדגים את יצירתם של קרומי דו-שכבת ליפידים באמצעות אלקטרודות patch bilayer ושימוש בתעלות גרמיצידין (gramicidin) להערכת תכונות הממברנה. הוא מספק מדריך שלב-אחר-שלב לבידוד נטעי ממברנה (membrane patches) ולהקלטת פעילות של תעלה בודדת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של ממברנות
רקע
- תפקודם של חלבוני ממбраנה מושפע מהרכב הליפידים.
- תעלות גרמיצידין משמשות כחיווי לשינויים בתכונות הממбраנה.
- הבנת הדינמיקה של השכבה הליפידית הכפולה חיונית למחקרים ביופיזיקליים.
- טכניקות Patch clamp חיוניות לחקר פעילות של תעלה בודדת.
מטרת המחקר
- להדגמת יצירת דו-שכבות ליפידיות עבור מחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
- להמחשת השימוש ב-gramicidin כגשש לתכונות ממברנה.
- לספק פרוטוקול להקלטת פעילות של תעלה בודדת בדו-שכבות ליפידיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות אלקטרוליטים והגדרת התא.
- בידוד חלקים קטנים של ממברנה באמצעות אלקטרודות patch bilayer.
- החלת גרמיצידין על הממברנה לצורך ניתוח פעילות התעלים.
- הקלטת עקומות זרם תחת תנאי מתח משתנים.
תוצאים עיקריים
- הושגה יצירה מוצלחת של ממברנות שכבה ליפידית כפולה.
- תעלות גרמיצידין שולבו ביעילות בשכבה הכפולה.
- פעילות של תעלה בודדת תועדה, ובכך נחשפה הדינמיקה של הממברנה.
- משכי חיים של התעלות וקצבי הופעתן כוונתו למדידה לצורך ניתוח.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר תכונות של שכבה ליפידית כפולה.
- תעלות גראמיצידין (Gramicidin) שימושיות לבדיקת דינמיקה של ממברנות.
- טכניקות אלקטרופיזיולוגיות יכולות לספק תובנות לגבי תפקוד חלבוני ממברנה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של התכונות האלסטיות של השכבה הכפולה היא קריטית להפחתת סיכונים במטרות תרופתיות של חלבוני ממברנה, שכן תרופות רבות משפיעות על המכניקה של הממברנה ובכך משנות את תפקוד החלבון. ניטור של מולקולה בודדת באמצעות תעלות גרמיצידין מספק קריאה ישירה ובחדות גבוהה של שינויים בתכונות השכבה הכפולה כמענה למולקולות קטנות. יכולת זו תומכת בביטחון ניבוי בשלבים מוקדמים של הערכת תרכובות ומסייעת בסינון תיקי פיתוח של תרופות הפועלות על ממברנות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של האופן שבו תרכובות מועמדות משנות את מכניקת הממברנה הרלוונטית לתפקוד המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין השפעות התרכובת על השכבה הדו-שכבתית לבין אינטראקציות ספציפיות לחלבון.
- מספק תיקוף תפקודי של חלבוני ממברנה מטרים תחת תנאי שכבה דו-שכבתית רלוונטיים פיזיולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מבסס בדיקה כמותית הניתנת לשחזור לצורך זיהוי של מודולציה בתכונות השכבה הכפולה על ידי מולקולות קטנות.
- מסייע בסטנדרטיזציה של סריקת תרכובות הפעילות בממברנה באמצעות מדידות זרם של תעלה בודדת.
- מספק תוצאות חסונות וניתנות להרחבה, כגון שיעורי הופעת תעלות וזמני חיים, לצורך ניתוח השוואתי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם את השפעות התרכובות על תכונות השכבה הכפולה עם השפעה פרמקולוגית פוטנציאלית in vivo על חלבוני ממברנה.
- תומך ברצף תרגומי על ידי קישור שינויים ביופיזיקליים בממברנה לוויסות תפקודי של חלבונים.
- מאפשר קבלת החלטות מותאמות סיכון להמשך פיתוח של מועמדים לתרופות המכוונות לממברנה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות ראשוני של המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית של תרכובות הפעילות בממברנה.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת בדיקה כמותית של השערת האפס לשינויים בשכבה הכפולה המושרים על ידי תרכובות, באמצעות קריאות של תעלות גרמיצידין.
- סריקה: מספקת מדידות זרם של תעלה בודדת, סטנדרטיות וניתנות לשחזור, לצורך מיון של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת התפלגויות של אורך חיי התעלה וקצב הופעתה להשוואה סטטיסטית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינויים בתכונות השכבה הכפולה in vitro לבין אפשרות לוויסות של חלבוני ממברנה in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לצורך הערכה שוטפת של חומרים פעילים בממברנה לאורך תוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות של חלבוני ממברנה ובמחקרי מנגנון פעולה של תרכובות.
- ערך תפעולי: מספק מדידות סטנדרטיות, ניתנות להרחבה ולשחזור של מולקולה בודדת עבור זרימות עבודה בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת החלטות ה-go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים עבור פורטפוליו המכוון לממברנות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על ראיות ביופיזיקליות ישירות למעורבות בממברנה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה ובניתוח ערוץ בודד.
- דורש מכשור ייעודי, כגון מערכות patch clamp ותאי bilayer.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאית של פרוטוקולים ואלגוריתמי ניתוח נתונים בין צוותים.
- עשוי לדרוש התאמה להרכבי ליפידים שונים או למערכות חלבונים ממברנליים שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בפעילות ערוצים נמוכה כדי להבטיח שיוך וניתוח מדויקים של האירועים.
