Name: הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למדו הכנת ממברנות ליפידיות דו-שכבתיות לניסויים באלקטרופיזיולוגיה. הפרוטוקול מפרט את שלבי הכנת תא המדידה והאלקטרודות לרישום ערוצי יונים בודדים במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

בקר <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">הפרוטוקולים שפרינגר</a> לקבלת מידע נוסף אודות הכנת bilayers מלאכותית באמצעות ערוצים gramicidin עבור חיטוט גמישות הממברנה.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

הכנת bilayers מלאכותית לניסויים electrophysiology

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Bilayers השומנים מישורי, הנקרא גם bilayers השומנים מלאכותית, מאפשרים לך ללמוד ניצוח יון ערוצי בסביבה מוגדרת היטב. Bilayers אלה יכולים לשמש למחקרים שונים, כגון אפיון של קרום פעיל פפטידים, את הכינון מחדש של תעלות יונים או חקירות על כמה שינויים במאפייני bilayer השומנים לשנות את הפונקציה של bilayer-פורש ערוצים. כאן, אנו מראים כיצד ליצור bilayer מישוריים ואיך לבודד טלאים קטנים bilayer, וב וידאו שנייה גם להדגים נוהל באמצעות ערוצים gramicidin לקבוע שינויים במאפייני bilayer השומנים אלסטי. אנחנו גם מדגימים את השלבים הפרט צריך להכין את החדר bilayer, האלקטרודות וכיצד הבדיקה bilayer מתאים ערוץ בודד במדידות.

Bilayers השומנים מישורי, הנקרא גם bilayers השומנים מלאכותית, מאפשרים לך ללמוד ניצוח יון ערוצי בסביבה מוגדרת היטב. הנה, אנחנו מדגימים את השלבים הפרט צריך להכין את החדר bilayer, האלקטרודות וכיצד הבדיקה bilayer מתאים ערוץ בודד במדידות.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

שכבות ליפידים מישוריות, הנקראות גם שכבות ליפידים מלאכותיות, מאפשרות לחקור תעלים להולכת יונים בסביבה מוגדרת היטב. שכבות אלו יכולות...

שלום, אני ד"ר Olaf Anderson מהמחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה ב-Weill Cornell Medical College בניו יורק. שלום, אני Ruchi Kaur, סטודנטית למסלול MD PhD במעבדתו של ד"ר Olaf Anderson. שלום, שמי John Kim.אני טכנאי מחקר. היום נראה לכם כיצד להתכונן לניסויי ערוץ בודד בשכבות ליפידיות כפולות פשוטות. נראה לכם כיצד להכין את התא ונראה לכם כיצד להכין את אלקטרודות ה-Bilayer Punch.ביצענו בידוד של אזורי ממברנה קטנים שבהם אנו עורכים את המדידות. אם כן, נתחיל. מערך האלקטרופיזיולוגיה שלנו מורכב מהמרכיבים הבאים: שולחן אנטי-ויברציה תלוי אוויר לצמצום רעידות מכניות, כלוב פראדיי להגנה מפני רעשים חשמליים, קול ורעידות, ומעמד.עבור תא השכבה הכפולה, אנו משתמשים במעטפת מים במחזור לשליטה בטמפרטורה שבה ממוקם תא השכבה הכפולה, ובמיקרו-מניפולטור להרכבת ראש הבמה של מגבר ה-patch clamp. יחידת סינון אלקטרונית משמשת לסינון נוסף של הפלט ממגבר ה-patch clamp ב-500 hertz. כדי להדמיא את מעברי הזרם, נעשה שימוש באוסצילוסקופ להצגת אות הזרם, הן מהפלט של מגבר ה-patch clamp והן מהמסנן האלקטרוני.לבסוף, תזדקקו למחשב עם מערכת לרכישת נתונים הממירה את אות ה-patch clamp לפורמט דיגיטלי. בקצב של 20 kilohertz, אנו משתמשים בתוכנה שפותחה במעבדה להקלטה וניתוח נתונים. יש להדליק את כל הציוד 20 דקות לפני התחלת העבודה.בשלב הבא, נכין את התא שבו מתבצעים הניסויים. התא מחולק לשני חצאים באמצעות מחיצה (septum), העשויה מיריעת טפלון דקה בעובי של כ-100 מיקרון ומלאה בתמיסת אלקטרוליט. אנו יוצרים את השכבה הכפולה (bilayer) על פני החור במחיצה, המאפשר קישור בין תמיסות האלקטרוליט.על החור להיות בעל קוטר של 1 עד 1.5 מילימטרים. בעזרת וזלין כחומר איטום, מקמו חלון זכוכית בחצי הקדמי של תא הטפלון, והשחילו ברגי פלדת אל-חלד דרך תומך מתכת אחד ודרך ארבעת החורים בחצי האחורי של התא. בעזרת וזלין כחומר איטום, מקמו מחיצת טפלון עגולה כך שתהיה דחוסה בין שני חצייה של התא המורכב.וודאו שהחור במחיצה ממוקם במרכז. מרחו וזלין על שני צדי המחיצה כדי להבטיח שתאי האלקטרוליט אטומים למים ומבודדים חשמלית. המשיכו להשחיל את הברגים דרך החלק הקדמי של התא ודרך התומך המתכתי הקדמי.הדק את המכלול כדי להבטיח שכל הרכיבים מוחזקים בחוזקה במקומם, אך לא הדוק מדי כדי לאפשר ניקוי של התא והסרה של הוזלינ (petroleum jelly). פיפט פסטור עובר חישול, ליטוש וכפיפה בזווית ישרה. חישול וליטוש של קצה הפיפט עד להשגתו למצב חלק מסייעים במניעת שריטות של הזכוכית או הטפלון.בשלב הבא, נקו את התא באמצעות תערובת של כלורופורם ומתנול ביחס של שניים לאחד או תמיסת fch. בעזרת הפ pipette, הסר את עודפי הוזלינ (petroleum jelly) באמצעות תמיסת ה-fch, תוך הקפדה לא למרוח אותם על הטפלון והזכוכית. השתמש בלפחות 10 נפחים של fch.לאחר סיום שלב זה, מוסיפים מגנטים לערבוב לתאים. לאחר מכן, מנקים את התא עם 95% ethanol. ולסיום, עם מים בדרגת טהרה גבוהה, מים מזוקקים, UE water, או מקבילה להם.כפי שנעשה קודם לכן, השתמשו בפיפטה מלוטשת באש כדי לשאוב את הנוזל. לבסוף, חזרו על הניקוי עם אתנול ומים. לאחר מכן, מים, אתנול וניקוי סופי.כעת נכין את מיקרו-פיפטת אלקטרודת הזכוכית, שתשמש כחיבור החשמלי לתא האחורי של התא, באמצעות מכשיר P 97 flaming brown micro pipette Polar מבית Sutter instruments. נמתח את קפילרת הזכוכית כדי ליצור שתי מיקרו-פיפטות, שלכל אחת מהן קונוס חד וקצר. אנו משתמשים בקפילרות העשויות מזכוכית בורוסיליקט בעלות קוטר חיצוני של 0.8 millimeters וקוטר פנימי של 0.5 millimeters. קפילרת זכוכית מוצבת ב-polar ומקובעת כהכנה למתיחת הפילמנט פנימה.האלקטרודה צריכה להיות עשויה פלטינה מכיוון שלא השגנו הצלחה במשיכת פיפטות לאלקטרודות עם פילמנטים של טונגסטן; השלבים הבאים יבוצעו במיקרו-פורג' (micro forge) עם פילמנט של פלטינה. לפני השימוש במיקרו-פורג', יש לוודא שהפילמנט מצופה היטב בזכוכית.ניתן להשתמש בזכוכית סודה-סיד רכה או בזכוכית בורוסיליקט קשה. יהיה עליכם לכוונן את החום במיקרו-forge כך שהזכוכית תזרום בצורה חלקה ותכסה את הסיב בשכבה דקה ואחידה. כעת התקינו את המיקרופיפט במיקרו-forge ושברו את הקצה.אנו עושים זאת על ידי ריכוך עדין של ציפוי הזכוכית על פילמנט החימום בטמפרטורה נמוכה יחסית. לאחר מכן, מקריבים בעדינות את קצה המיקרו-פיפטה לעבר ציפוי הזכוכית שעל הפילמנט כך ששניהם יימסכו יחד; מכבים את החימום של הפילמנט, אשר נסוג, והפיפטה נשברת. כעת נותרנו עם פתח חד ואחיד שקוטרו כ-30 microns.שוב, באמצעות המיקרו-forge, צרו כיפוף בזווית ישרה במיקרו-פיפט במרחק של שלושה עד ארבעה מילימטרים מהקצה, מקמו את הפיפט כמה מאות מיקרונים מעל לסיב (filament), ולאחר מכן הפעילו את החום כך שהסיב יהפוך לאדום. הסיב יזוז עקב התפשטות תרמית. לאחר מכן, הורידו בעדינות את הפיפט על הסיב והסיב יתכופף.את מידת הכיפוף שולטים באמצעות חום הסיב. כאשר הכיפוף מגיע לכ-80 מעלות, יש להזיז במהירות את הפפיטה כלפי מעלה וקדימה. פעולה זו דורשת מידה של קואורדינציה.המטרה היא להגיע לכיפוף של 90 מעלות תוך שימוש באותן הגדרות. בצעו ליטוש באש (fire polish) לקצה המיקרו-פיפט, ושמרו על פילמנט המיקרו-פיפט מצופה בזכוכית. כעת סילנזנו את קצה הפיפט באמצעות תמיסה של 10% של tri octal silene בבנזן.פעולה זו הופכת את פני השטח של הפ pipette להידרופוביים, כך שהם יתאימו היטב לממברנה. אפשרו לתמיסה לעלות מספר מילימטרים לתוך הפ pipette באמצעות פעולת נימיות. אידו את התמיסה באמצעות ה-micro forge בחום נמוך וסיימתם.כעת נדגים כיצד להכין את אלקטרודת הכסף. קחו חתיכה של 5 cm של חוט כסף בקוטר של כ-1 mm. גלגלו אותה שלוש עד ארבע פעמים לסליל בעל קוטר פנימי של 2 עד 3 mm.השאר את השאר כזנב שיכופף כך שיהיה בזווית ישרה לסליל. צפה את הזנב ואת חמשת עד עשרת המילימטרים הסמוכים של תיל הכסף בכסוף כלורי מותך. כעת הכן את תמיסת היצירה של השכבה הכפולה.במקרה שלנו, הליפיד הוא phosphatidylcholine בתוך decane. הליפיד מאוחסן במבחנות זכוכית בטמפרטורה של 40- °C כנפחים של 150 µL של תערובת ליפיד וכלורופורם. הוצא מבחנת זכוכית מהמקפיא, המתן להגעה לטמפרטורת החדר ואיד את הכלורופורם תחת זרם של חנקן יבש.בתוך מ㖘ת עבודה כימית, הוסף 50 µL של end decane וערבב במכשיר vortex. כדי להבטיח מגע טוב בין התמיסה ליצירת השכבה הדו-שכבתית לבין הטפלון המקיף את החור שמעליו נוצרת השכבה הדו-שכבתית, צבע מחדש את מחיצת הטפלון מסביב לחור. ראשית, נקה פיפטת פסטור שעברה ליטוש באש באמצעות fch.לאחר מכן, טבל את הפ pipette הנקי ב-2.5% phospholipid ב-end decane, ואפשר לליפידים לעלות כמילימטר אחד לתוך ה-pipette. הנח טיפה של ליפידים כשכבה מעל החור במחיצת ה-Teflon. אפשר לליפידים להתייבש במשך כ-10 עד 15 דקות וחזור על הפעולה.שלום.היום הדגמנו בפניכם כיצד להכין שכבות ביליפידיות לניסויי ערוץ בודד. בסרטון הנלווה, נראה לכם כיצד לבודד מקטעים קטנים של ממברנה, כיצד להקליט פעילות של ערוץ בודד, כיצד לשנות את הפעילות באמצעות מולקולות קטנות, וכיצד לנתח את התוצאות. אשרינו, זהו זה.תודה שצפיתם. בהצלחה בניסוי שלכם.

preparation-of-artificial-bilayers-for-electrophysiology-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. זה וידאו המאמר מפרט כיצד ליצור תיקון באמצעות אלקטרודות תיקון bilayer, כמו גם כיצד להשתמש ערוצי gramicidin כמו כתבים של תכונות הממברנה משתנה.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

הליכים לכינון מחדש של אב טיפוס ערוץ אשלגן מתח מגודרת לממברנות שומנים בדם מלא מתוארים. הערוצים המשוחזרים מתאימים למבחנים ביוכימיים, הקלטות חשמל, הקרנת יגנד ומחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים. שיטות אלה עשויות להיות יישומים כלליים למחקרים המבניים ותפקודיים של חלבוני קרום אחרים.

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

אנו מדגימים מערכת היווצרות bilayer שומנים שאפשר לשמור, יבילה. קרום bilayer השומנים יכול להיווצר בתוך שעה 1 עם למעלה מ -80% אחוזי הצלחה כאשר מבשר קרום קפוא מובא טמפרטורת הסביבה. מערכת זו תפחית תהליכי מייגע ומומחיות הקשורים תעלות יונים.

גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

כאן, אנו מציגים עבור היווצרות ליפיד bilayers באמצעות שיטת bilayer בועה קשר פרוטוקול. בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני, לפיה טפט נוצר ב הממשק מים-שמן. פיפטות שני יפגעו כדי לעגן את הבועות כדי ליצור bilayer.

השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

רכים, צריכת חשמל נמוכה, memristors למערכות ביולוגיות ממנפים קומפוזיציה דומה המבנה, החלפת מנגנונים של ביו-הסינפסות. המוצג כאן פרוטוקול כדי להרכיב או לאפיין למערכות ביולוגיות memristors מתקבל בידוד השומנים bilayers בין טיפות מים בשמן. שילוב של פפטידים מופעל מתח alamethicin תוצאות מוליכות יונית memristive על פני הקרום.

הרכבה ואפיון של Memristors למערכות ביולוגיות המורכב ממברנות השומנים מסטול-תעלת יונים

פרוטוקול זה מפרט את השימוש במערכת חימום מבוקרת טמפרטורת משוב כדי לקדם הרכבה מונולאייר השומנים ואת היווצרות bilayer ממשק טיפה עבור שומנים עם טמפרטורות התכה גבוהות, ומדידות קיבוליות לאפיון שינויים מונחי טמפרטורה בקרום.

הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

למדו הכנת ממברנות ליפידיות דו-שכבתיות לניסויים באלקטרופיזיולוגיה. הפרוטוקול מפרט את שלבי הכנת תא המדידה והאלקטרודות לרישום ערוצי יונים בודדים במעבדה.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

גלה סרטונים נוספים