ספקטרוסקופיית אינפרא אדום

ספקטרוסקופיה אינפרא אדום, או IR, היא טכניקה המשמשת לאפיון קשרים קוולנטיים.

מולקולות עם סוגים מסוימים של קשרים קוולנטיים יכולות לספוג קרינת IR, ולגרום לקשרים לרטוט. ספקטרופוטומטר IR יכול למדוד אילו תדרים נספגים. זה מיוצג בדרך כלל עם ספקטרום של קרינת IR באחוזים המועברים דרך הדגימה בתדר נתון במספרי גל. בסוג זה של ספקטרום, הפסגות הפוכות, מכיוון שהן מייצגות ירידה באור המועבר בתדר זה.

התדרים הנספגים תלויים בזהות ובסביבה האלקטרונית של הקשרים, ומעניקים לכל מולקולה ספקטרום אופייני. עם זאת, כל סוג של קשר יספוג קרינת IR בטווח תדרים מסוים, ויהיה לו צורת שיא וחוזק ספיגה משותפים. לכן ניתן להקצות פסגות לקשרים ספציפיים, מה שמאפשר זיהוי של תרכובת לא ידועה מספקטרום ה-IR.

סרטון זה ימחיש את האפיון של תרכובת אורגנית לא ידועה עם ספקטרוסקופיה IR ויציג כמה יישומים נוספים של ספקטרוסקופיה IR בכימיה אורגנית.

ניתן לעצב קשר קוולנטי בין שני אטומים כקפיץ המחבר בין שני גופים בעלי מסות m1 ו-m2. ל"קפיץ "זה יש תדר תהודה, שבמקרה זה הוא תדר האור המתאים לקוונטום האנרגיה הדרוש כדי לעורר תנודה בקשר באותו תדר, אך עם משרעת גדולה עוד יותר.

תדירות התהודה של קשר תלויה בחוזק הקשר ובאורכו, בזהות האטומים המעורבים ובסביבה. לדוגמה, קשר מצומד ירטוט בטווח תדרים שונה מאשר קשר לא מצומד.

תדר התהודה תלוי גם במצב הרטט, שהוא דפוס התנודה של האטומים בתוך מולקולה. מצבי הרטט הנפוצים ביותר שנצפו על ידי ספקטרוסקופיה IR הם מתיחה וכיפוף. למולקולות ליניאריות יש 3N מינוס 5 מצבי רטט, כאשר N הוא מספר האטומים, ולמולקולות לא ליניאריות יש 3N מינוס 6 מצבי רטט.

ספקטרופוטומטריית IR מבוצעת בעיקר על ידי הזרקת מקור אור רחב ספקטרום דרך אינטרפרומטר, החוסם את כל אורכי הגל של האור מלבד כמה אורכי גל בכל זמן נתון, על הדגימה. גלאי IR מודד את עוצמות האור עבור כל הגדרת אינטרפרומטר. לאחר איסוף הנתונים בטווח התדרים הרצוי, הם מעובדים לספקטרום הניתן לזיהוי על ידי התמרת פורייה.

הדגימה יכולה להיות גזית, נוזלית או מוצקה, בהתאם למבנה המכשיר. עבור גלאי רגיל, גזים ונוזלים מונחים בתא עם חלונות שקופים IR, ומוצקים תלויים בשמן או נלחצים לגלולה שקופה עם אשלגן ברומיד. לאחר מכן, אור ה-IR מופנה דרך הדגימה אל הגלאי.

שיטה חלופית לדגימות מוצקות ונוזליות היא החזר כולל מוחלש, או ATR. בשיטה זו, הדגימה הטהורה ממוקמת במגע עם משטח גביש. לאחר מכן מוחזר אור IR מהצד התחתון של הגביש לגלאי, כאשר התדרים הנספגים משתקפים חלש יותר. אין צורך לעבד את הדגימה תחילה, מכיוון שהאור אינו עובר דרכה.

כעת, לאחר שהבנתם את העקרונות של ספקטרוסקופיה IR, בואו נעבור על הליך לזיהוי תרכובת אורגנית לא ידועה באמצעות טכניקת דגימת ATR במכשיר FTIR.

כדי להתחיל בהליך האפיון, הפעל את ספקטרומטר FTIR ואפשר למנורה להתחמם לטמפרטורת ההפעלה.

ודא שגביש ה-ATR נקי. לאחר מכן, ללא דגימה במקום, השתמש בתוכנת הספקטרומטר כדי להקליט ספקטרום רקע.

לאחר מכן, השג דגימה מוצקה של תרכובת אורגנית לא ידועה ושים לב למראה שלה. בעזרת מרית מתכת נקייה, הניחו בזהירות את הדגימה על משטח הגביש. לחלופין, עבור דגימות נוזליות, פיפטה משמשת להעברת דגימות למשטח הגביש.

הברג בזהירות את הגשושית עד שהיא ננעלת במקומה כדי לקבע את הדגימה על משטח הגביש.

לאחר מכן, אסוף לפחות ספקטרום IR אחד של הדגימה הלא ידועה. לאחר סיום איסוף הנתונים והפחתת הרקע, השתמש בכלי הניתוח בתוכנה כדי לזהות את מספרי הגל של הפסגות.

בסיום עם הספקטרומטר, הסר את הדגימה ונקה את הגשושית בעזרת אצטון. שמור את הספקטרום, סגור את התוכנה וכבה את הספקטרומטר.

בניסוי זה, הדגימה הלא ידועה עשויה להיות אחת מעשר תרכובות אורגניות, כל אחת עם חמישה פסגות IR אופייניות. בהתבסס על הפאזה והמראה החזותי של הלא נודע, ניתן לבטל 8 מהאפשרויות.

הספקטרום מהתרכובת הלא ידועה מראה שיא רחב ליד אזור מספר הגל של 3,300, המעיד על ספיגת מתיחה -OH או -NH. הפסגות מימין מצביעות על נוכחותם של קשרים כפולים פחמן-פחמן וקשרי חמצן פחמן. מבין שתי התרכובות הנותרות, רק לאחת יש קבוצת -OH ולכן התרכובת היא פנול.

ספקטרופוטומטריית IR היא כלי אפיון בשימוש נרחב בביולוגיה ובכימיה. בואו נסתכל על כמה דוגמאות.

בהליך זה, נעשה שימוש בספקטרוסקופיה FTIR שבוצעה בשיטת ATR כדי להשיג תמונות ספיגת IR של רקמות על ידי הכנסת רכיב מיקרוסקופיה למכשיר. לכל פיקסל בתמונה היה ספקטרום IR מתאים, המאפשר קביעת ההרכב המולקולרי של הרקמה ברזולוציה מרחבית מצוינת. ניתן גם להציג את תמונת הרקמה בתדרים שונים כדי לדמיין את התפלגות סוגי המולקולות ברחבי הרקמה.

התנודות המולקולריות של קבוצות פפטידים בחלבון מושפעות משינויים קונפורמטיביים של חלבון. על ידי ניטור דגימת חלבון עם FTIR של סריקת צעדים, בעלת רזולוציה זמנית בסדר גודל של עשרות ננו-שניות, ניתן לנטר את דינמיקת החלבון באמצעות השינויים בספקטרום הספיגה שלהם. ניתן להציג את הנתונים כספקטרום בודד או כעלילות תלת מימד של עוצמה, תדירות וזמן לזיהוי שיא וניתוח נוסף.

זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לספקטרוסקופיה IR. כעת עליך להכיר את העקרונות הבסיסיים של ספקטרוסקופיה IR, את ההליך לספקטרוסקופיה IR של תרכובות אורגניות, וכמה דוגמאות לאופן השימוש בספקטרוסקופיה IR בכימיה אורגנית. תודה שצפית!