What is magnetic-activated cell sorting and how does it separate cells?

Magnetic-activated cell sorting, or MACS, is a technique that separates cells based on specific epitopes expressed on their surfaces. Antibodies conjugated to biotin bind target cells, then streptavidin-coupled magnetic beads attach to the biotin. Labeled cells stick to a magnet in a column while unlabeled cells pass through, achieving 60 to 98% retrieval of target cells.

How does the biotin-streptavidin interaction work in MACS?

Biotin, attached to antibodies targeting specific cell surface markers, has high affinity for streptavidin molecules fused to magnetic beads. When biotin and streptavidin come into contact, they bind tightly, coating target cells with magnetic beads. This sandwich complex of cell surface marker, antibody, and magnetic bead enables magnetic capture and separation.

What steps are involved in preparing thymic tissue for MACS isolation?

The thymus is extracted and mechanically dissociated into single cells using a cell strainer and plunger. Unwanted erythrocytes are lysed using ACK buffer. Cells are then centrifuged and resuspended in HBSS with fetal calf serum. Cell concentration is adjusted to 10 to the seventh cells per milliliter before magnetic labeling with anti-CD3 antibodies.

How are CD3-positive T cells labeled and captured during MACS?

Cells are incubated with biotin-coupled anti-CD3 antibodies on ice for 20 minutes, then washed. Streptavidin-coupled magnetic beads are added and incubated for 20 minutes. The labeled cell suspension is pipetted into a column positioned on a magnet, where CD3-positive cells adhere while unlabeled cells flow through into a collection tube.

What is the purpose of using a column in the MACS separation process?

The column contains a non-magnetic matrix that lengthens the path cells travel through the system. This slows cell flow, allowing more time for magnetic beads to capture target cells efficiently. The column improves separation efficiency and increases the percentage of recovered cells compared to direct magnetic separation without a column.

How is the enrichment efficiency of CD3-positive T cells verified after MACS?

Enriched and non-enriched cell samples are stained with fluorescent anti-CD3 antibodies and analyzed using flow cytometry. Dot plots display CD3-positive lymphocytes, which should appear predominantly in the enriched sample. The frequency of CD3-positive cells among all lymphocytes is calculated, with enriched T-cells typically showing 80% or above CD3-positive cells.

What are the differences between positive and negative magnetic sorting?

In positive sorting, cells of interest are captured using magnetic beads coupled to antibodies targeting desired surface markers. In negative sorting, unwanted cells are removed by capturing them with magnetic beads carrying appropriate antibodies. Both approaches use the same MACS principle but differ in which cell population is retained versus discarded.

מיון תאים המופעל מגנטי (MACS): בידוד של לימפוציטים T תימיים

0 צפיות11:35 דק'

1. הכנה

לפני שתתחילו, לבשו כפפות מעבדה וביגוד מגן מתאים.
לשטוף את כל כלי הניתוח, תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן לייבש אותם עם מגבת נייר נקי.
הכן 200 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה 2% סרום עגל עוברי (FCS).

2. ניתוח

הצמד עכבר מורדם על צלחת ביתור בתנוחת עלון.
באמצעות מספריים ומלקחיים לבצע לפרוסטומיה אורך כדי לגשת לחלל החזה.
הסר את הלב כדי לקבל גישה התימוס, אשר ממוקם מעל הלב. לאחר מכן, לזהות את התימוס, אשר מורכב משתי אונות לבנות והוא ממוקם בחלל החזה מעל הלב.
באמצעות מלקחיים לנתק בזהירות את התימוס ומניחים אותו על צלחת פטרי עם 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.

3. בידוד תאי מערכת החיסון

מניחים את התימוס על מסננת תא 40 מיקרומטר על אותה צלחת פטרי. למחוץ את התימוס עם בוכנה כדי לנתק אותו באותה מנה.
מעבירים את התימוס הנותק ואת הנוזל לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מ"ל של HBSS 2% FCS ולהעביר את המדיום שטוף גם לתוך אותו צינור צנטריפוגה.
צנטריפוגות הצינור ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
resuspend הכדור ב 2 מ"ל של אשלגן אצטט ליזה אריתרוציטים. המתן 2 דקות ולאחר מכן האיפור את עוצמת הקול עד 14 מ"ל באמצעות HBSS 2% FCS.
צנטריפוגות הצינור שוב ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.
להעריך את ריכוז התא באמצעות בדיקות כתמים כחול טריפן ולהתאים את ריכוז התא הסופי ל 10⁷ תאים / מ"ל באמצעות נפח מתאים של HBSS 2% FCS.

4. תיוג מגנטי של תאי מערכת החיסון

קח שני צינורות FACS. סמן צינור אחד, "תאי T לא מועשרים", והצינור השני, "תאי T מועשרים" - שיופרדו באמצעות תיוג מגנטי.
הפצת פתרון תא לכל אחד משני צינורות ה- FACS.
צנטריפוגה צינור "תאי T מועשרים" ב 370 x גרם במשך 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
resuspend הכדור ב 250 μL של נוגדנים ביוטינילאט אנטי CD3 לערבב (טבלה 1, לערבב 1).

לערבב	תיוג ריאגנטים	דילול
1	נוגדן ביוטינילאט נגד CD3	1/400 (ב- HBSS 2% FCS)
2	סטרפטאבידין חרוזים מצמידים	1/5 (ב- HBSS 2% FCS)
3	אנטי CD3 BV421	1/200 (ב- HBSS 2% FCS)

טבלה 1: קומפוזיציה לערבב נוגדנים. תערובות 1 ו-2 משמשות להפרדה מגנטית. תערובת 3 משמשת להערכת העשרת התא לאחר הפרדה מגנטית.

לדגור על תערובת ההשעיה-נוגדנים של התא במשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
הוסף 3 מ"ל של HBSS 2% FCS הן לצינורות וצנטריפוגה אותם שוב ב 370 x g במשך 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
השליכו את הסופר-נט והדביקו מחדש את הכדור ב-250 חרוזים מצמידי סטרפטאבין (טבלה 1, ערבוב 2).
לדגור על תערובת התאים והחרוזים במשך 20 דקות על קרח.
לאחר מכן, להוסיף 3 מ"ל של HBSS 2% FCS ולערבב היטב צנטריפוגה שוב ב 370 x g במשך 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
resuspend הכדור ב 2 מ"ל של HBSS 2% FCS.

5. הפרדה מגנטית של תאים חיוביים CD3

מקם את העמודה על המגנט והוסף 3 מ"ל של HBSS 2% FCS כדי לח את המערכת. חכה 5 דקות.
לאחר מכן, הזרם את התאים המסומנים בתווית לתוך העמודה.
לאחר התליית התא עובר דרך העמודה, לשטוף את העמודה X3 פעמים עם 3 מ"ל של HBSS 2% FCS.
לאחר מכן, הסר את העמודה מהמגנט והנח אותו בצינור איסוף של 15 מ"ל.
כדי לחמוק מתאי היעד, הוסף 5 מ"ל של HBSS 2% FCS לעמודה ורוקן את העמודה עם הבוכנה.
חזור על שלב ההתחמקות עם עוד 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.

6. הערכת העשרת תאי יעד לפי ציטומטריית זרימה

העבר 500 μL של השעיית תא eluted לצינור FACS שכותרתו "תאי T מועשרים". העבר 200 μL של השעיית "תאי T לא מועשרים" ל- FACS שני.
לאחר מכן, צנטריפוגה שני הצינורות ב 370 x g במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
השלך את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של נוגדן פלואורסצנטי לערבב 3 (ראה טבלה 1) לשני הצינורות.
לדגור על שני הצינורות במשך 20 דקות ב 4°C בחושך.
לאחר מכן, להוסיף 3 מ"ל של HBSS 2% FCS צינורות צנטריפוגה אותם ב 370 x g במשך 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
להשליך את supernatant, ולאחר מכן resuspend כל צינור ב 250 μL של HBSS 2% FCS.
עכשיו, להעריך את קצב העשרת התאים CD3 חיובי על ידי ציטומטריית זרימה.

7. ניתוח נתונים

פתח את סמל 'FlowJo' וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון "כל הדוגמה".
לחץ פעמיים על קובץ "תאי T מועשרים" כדי להציג את התוויית הנקודות המציגה פיזור קדימה (FSC-A) בציר X ופיזור הצד (SSC-A) בציר ה- Y.
לחץ על "מצולע" כדי להקיף את אוכלוסיות הלימפוציטים.
לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה כדי ליצור חלון חדש.
בחר "FSC-W" בציר Y ו - "FSC-A" בציר X והקף את התאים השליליים FSA-W. בחלון "זיהוי אוכלוסין משנה", תן שם לאוכלוסיית התאים "תאים בודדים".
לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה כדי ליצור חלון חדש. בחר "CD3" בציר Y והקף את התאים החיוביים ל- CD3. בחלון "זיהוי אוכלוסין משנה" קוראים לאוכלוסיית התאים שלך "תאי T".
חזור על הפעולה עם "תאי T לא מועשרים".
כדי להציג באופן חזותי את אוכלוסיית התאים, לחץ על "עורך הפריסה" וגרור את האוכלוסייה "תאי T" מקבצים "תאי T מועשרים" ו " תאי T שאינם מועשרים "לתוך הכרטיסיה.
חלקות נקודה המייצגות לימפוציטים CD3+ יופיעו. תאי CD3+ אמורים להופיע רק באוכלוסיית העניין בצינור המועשר CD3+ בלבד.
כדי להעריך את ההעשרה של לימפוציטים CD3+ בתאים ממוינים, לחץ על "עורך טבלאות"ולאחר מכן גרור את האוכלוסייה "תאי T" מקבצים "תאי T מועשרים" ו " תאי T לא מועשרים "לטבלה.
בתפריט "סטטיסטיקה", בחר "תדירות הלימפוציטים" תאים כדי לבדוק את אחוז תאי CD3 + בכל הלימפוציטים ולאחר מכן לחץ על "צור טבלה".
ערכי פרמטר יופיעו בטבלה חדשה. עבור "תאי T מועשרים", התדירות של תאי CD3+ צריכה להיות סביב 80%.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: מוניר^{סילבן 1,2,3}, פרצ'ט^{תיבו 1,2,3}, סופי^{נובולט 4}, רחל גולוב^1,2,3
^{יחידה אחת} ללימפופוליס, המחלקה לאימונולוגיה, מכון פסטר, פריז, צרפת
² INSERM U1223,…

Browse More Videos

Magnetic Activated Cell Sorting

Thymic T Lymphocytes

CD3 positive Cells

Cell Isolation