אליסה אסייס: עקיפה, כריך ותחרותי
1. אליסה עקיפה
ELISA עקיף הוא אחד שבו הנוגדן העיקרי אנטיגן ספציפי מזוהה על ידי נוגדן מצומד משני. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה לשיטת ELISA עקיפה, שבה נבדקות דגימות הסרום של עכברים נגועים בשפעת A (IAV) לנוכחות נוגדן IgG ספציפי ל- IAV. כוח אחד של דוגמה זו הוא כי נוגדנים משניים שונים ניתן להשתמש המזהים את כל איזוטיפים נוגדנים או איזוטיפים ספציפיים (למשל, IgG).
ציפוי אנטיגן למיקרו-לוחית
- מצופים את בארות של צלחת ELISA 96-well עם אנטיגן מטוהר על ידי צנרת 50 μL של אנטיגן מטוהר (2 מ"ג / מ"ל של A מטוהר A / PR / 8 שפעת וירוס ב 0.05M חוצץ Tris-HCl (pH 9.5)) לתוך כל באר של הצלחת.
- מכסים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר אותה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאנטיגן להיקשר לצלחת.
- עם השלמת הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
חסימת
- חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות המצולפות על ידי הוספת מאגר חסימה של 200 μL, נעשה שימוש בסרום חמור 5% ב-1X PBS, לבאר. ריאגנטים חלופיים לחסימה כוללים 5% חלב יבש ללא שומן או BSA ב- PBS או סרום רגיל מבעל חיים שבו נוצר הנוגדן המשני.
- יש לדגור לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר הדגירה, להסיר את חוצץ חסימה על ידי הבהוב הצלחת ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.
דגירה עם הנוגדן העיקרי
- הכן דילול סדרתי של דגימת הסרום, המכילה את הנוגדן העיקרי, כדי להשיג טווח דילול של 1 עד 204,800, באמצעות 1X PBS. כדי לעשות זאת, תחילה לדלל את הסרום 1:12.5 ולאחר מכן לבצע דילול 4X (טווח דילול - 1:12.5 עד 1:204,800).
- הוסף 100 μL של דגימות סרום מדולל באופן סדרתי לבארות.
- מכסים את הצלחת עם כיסוי דבק ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 1-2 שעות.
- לאחר הדגירה, להעיף את הצלחת מעל כיור לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.
דגירה עם הנוגדן המשני
- הוסף 100 μL של נוגדן משני מצומד אנזים, peroxidase חזרת, חומר מצומד HRP אנטי עכבר משני בניסוי זה, לכל באר.
- לדגור על הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר.
- לאחר הדגירה, להעיף את הצלחת מעל כיור ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.
זיהוי
- הוסף 100 μL של מצע המחוון (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)) בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל לכל באר.
- לדגור על הצלחת עם המצע במשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N חומצה גופרתית (H2SO4).
בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה, לקרוא את הצלחת באמצעות קורא microplate ב 405 ננומטר כדי לקבוע את ספיגת בארות.
2. כריך אליסה
בגרסת ELISA זו, המדגם הניסיוני "נדחף" בין נוגדן לכידה ללא מעצורים לנוגדן זיהוי מצומד, שניהם ספציפיים לאותו חלבון אך באפיטופים שונים. בדוגמה הבאה של ELISA, ריכוז TNFα אנושי נקבע במדגם לא ידוע באמצעות עקומה סטנדרטית שנוצרה מדילול סדרתי פי 2.5 של TNFα אנושי סטנדרטי ידוע (המציין בריכוז של 75 pg/mL).
ציפוי ללכוד נוגדן למיקרו-לוחית
- יש לצפות את בארות של צלחת ELISA 96-באר עם נוגדן לכידה מטוהר על ידי הוספת 100 μL של נוגדן לכידה (1-10 מיקרוגרם / mL טווח) לכל באר של הצלחת.
- מכסים צלחת עם כיסוי צלחת דבק ודגרה אותו לילה ב 4°C.
- לאחר הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי מהצלחת על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
חסימת
- חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות מצופות הנוגדנים על ידי הוספת פתרון חסימת 200 μL, 5% חלב יבש ללא שומן המכיל PBS, לבארות.
- דגירה של לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4°C.
- לאחר הדגירה, להסיר את חוצץ חסימה על ידי הבהוב הצלחת ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.
הוספת אנטיגן המכיל דגימות בדיקה
- הוסף 100 μL של מדגם הבדיקה לבארות. אוטמים את הצלחת עם כיסוי דבק.
- דגירה במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4°C.
- לאחר הדגירה, להסיר את הדגימות על ידי הבהוב הצלחת מעל הכיור ולאחר מכן לשטוף את הבארות עם 200 μL 1X PBS המכיל 1% Tween-20.
הוסף נוגדן זיהוי מצומד באנזים
- הוסף 100 μL של נוגדן זיהוי מצומד אנזים לבארות בריכוז preoptimized.
- אוטמים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
- הסר את נוגדן הזיהוי הלא מאוגד על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור ולשטוף את בארות עם 200 μL 1X PBS המכיל 1% Tween-20.
זיהוי
- הוסף 100 μL של מצע המחוון בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. כל נוגדן זיהוי מצומד באנזים ימיר את המצע לאות שניתן לזהותו.
- לדגור על הצלחת במשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר 5-10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N H2SO4 לבארות. בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה, לקרוא את הצלחת באמצעות קורא microplate כדי לקבוע את ספיגת בארות.
3. אליסה התחרותית
השלבים של ELISA תחרותי שונים מאלה המשמשים עקיפה ו כריך ELISA, עם ההבדל העיקרי להיות שלב מחייב תחרותי בין אנטיגן מדגם ו אנטיגן "תוספת". האנטיגן מדגם הוא דגירה עם הנוגדן העיקרי ללא תווית. מתחמי נוגדנים אנטיגן אלה מתווספים לאחר מכן לצלחת ELISA, אשר כבר מצופה מראש עם אותו אנטיגן. לאחר תקופת דגירה, כל נוגדן לא מאוגד נשטף. יש מתאם הפוך בין כמות הנוגדן החינמית הזמינה לאגד את האנטיגן בבאר לבין כמות האנטיגן במדגם המקורי. לדוגמה, מדגם עם אנטיגן בשפע יהיה יותר אנטיגן ראשוני קומפלקסים נוגדנים, משאיר נוגדן לא מאוגד קטן להיקשר לצלחת ELISA. נוגדן משני מצומד באנזים הספציפי לנוגדן העיקרי מתווסף לאחר מכן לבארות, ואחריו המצע.
ציפוי אנטיגן למיקרו-לוחית
- מצופים את בארות של צלחת ELISA 96-well עם 100 μL של אנטיגן מטוהר בריכוז של 1-10 מיקרוגרם / מ"ל.
- מכסים צלחת עם כיסוי צלחת דבק ודגרה הצלחת לילה ב 4°C.
- לאחר הדגירה, להסיר את פתרון אנטיגן מאוגד מן הבארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
חסימת
- לחסום את האתרים הנותרים כריכת חלבון בבארות מצופות על ידי הוספת 200 μL של חוצץ חסימה לכל באר, אשר יכול להיות גם 5% חלב יבש ללא שומן או BSA ב PBS.
- לדגור על הצלחת לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4°C.
דגימת דגירה (אנטיגן) עם הנוגדן העיקרי
- תוך כדי חסימת הבארות, להכין את תערובת אנטיגן נוגדנים על ידי ערבוב 150 אנטיגן מדגם μL ו 150 μL של נוגדן ראשוני עבור כל באר בבחינה.
- לדגור תערובת זו במשך 1 שעה ב 37°C.
הוסיפו לבאר תערובת אנטיגן-נוגדנים
- עכשיו, להסיר את מאגר חסימה מן בארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
- לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל Tween-20.
- הוסף 100 μL של תערובת נוגדנים אנטיגן-ראשוני מדגם.
- לדגור על הצלחת ב 37°C במשך 1 שעה.
- הסר את התערובת לדוגמה על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
- לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 כדי להסיר כל נוגדן לא מאוגד.
הוסף את הנוגדן המשני
- הוסף 100 μL של נוגדן משני מצומד אנזים, אשר במקרה זה הוא נוגדן מצומד AP, לכל באר.
- לדגור על הצלחת במשך 1 שעה ב 37°C.
- לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20.
זיהוי
- הוסף 100 μL של פתרון המצע לכל באר.
- המתן 5-10 דקות.
- לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N חומצה גופרתית לבארות. לאחר מכן, למדוד את הספיגה בקורא מיקרו-לוח בתוך 30 דקות מהוספת פתרון העצירה
מקור: ויטני סוונסון1,2, פרנסס נגד Sjaastad2,3, ותומאס ס גריפית1,2,3,4
המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
2 המרכז לאימונולוגיה,…
1. אליסה עקיפה
ELISA עקיף הוא אחד שבו הנוגדן העיקרי אנטיגן ספציפי מזוהה על ידי נוגדן מצומד משני. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה לשיטת ELISA עקיפה, שבה נבדקות דגימות הסרום של עכברים נגועים בשפעת A (IAV) לנוכחות נוגדן IgG ספציפי ל- IAV. כוח אחד של דוגמה זו הוא כי נוגדנים משניים שונים ניתן להשתמש המזהים את כל איזוטיפים נוגדנים או איזוטיפים ספציפיים (למשל, IgG).
ציפוי אנטיגן למיקרו-לוחית
- מצופים את בארות של צלחת ELISA 96-well עם אנטיגן מטוהר על ידי צנרת 50 μL של אנטיגן מטוהר (2 מ"ג / מ"ל של A מטוהר A / PR / 8 שפעת וירוס ב 0.05M חוצץ Tris-HCl (pH 9.5)) לתוך כל באר של הצלחת.
- מכסים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר אותה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאנטיגן להיקשר לצלחת.
- עם השלמת הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
חסימת
- חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות המצולפות על ידי הוספת מאגר חסימה של 200 μL, נעשה שימוש בסרום חמור 5% ב-1X PBS, לבאר. ריאגנטים חלופיים לחסימה כוללים 5% חלב יבש ללא שומן או BSA ב- PBS או סרום רגיל מבעל חיים שבו נוצר הנוגדן המשני.
- יש לדגור לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר הדגירה, להסיר את חוצץ חסימה על ידי הבהוב הצלחת ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.
דגירה עם הנוגדן העיקרי
- הכן דילול סדרתי של דגימת הסרום, המכילה את הנוגדן העיקרי, כדי להשיג טווח דילול של 1 עד 204,800, באמצעות 1X PBS. כדי לעשות זאת, תחילה לדלל את הסרום 1:12.5 ולאחר מכן לבצע דילול 4X (טווח דילול - 1:12.5 עד 1:204,800).
- הוסף 100 μL של דגימות סרום מדולל באופן סדרתי לבארות.
- מכסים את הצלחת עם כיסוי דבק ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 1-2 שעות.
- לאחר הדגירה, להעיף את הצלחת מעל כיור לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.
דגירה עם הנוגדן המשני
- הוסף 100 μL של נוגדן משני מצומד אנזים, peroxidase חזרת, חומר מצומד HRP אנטי עכבר משני בניסוי זה, לכל באר.
- לדגור על הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר.
- לאחר הדגירה, להעיף את הצלחת מעל כיור ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.
זיהוי
- הוסף 100 μL של מצע המחוון (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)) בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל לכל באר.
- לדגור על הצלחת עם המצע במשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N חומצה גופרתית (H2SO4).
בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה, לקרוא את הצלחת באמצעות קורא microplate ב 405 ננומטר כדי לקבוע את ספיגת בארות.
2. כריך אליסה
בגרסת ELISA זו, המדגם הניסיוני "נדחף" בין נוגדן לכידה ללא מעצורים לנוגדן זיהוי מצומד, שניהם ספציפיים לאותו חלבון אך באפיטופים שונים. בדוגמה הבאה של ELISA, ריכוז TNFα אנושי נקבע במדגם לא ידוע באמצעות עקומה סטנדרטית שנוצרה מדילול סדרתי פי 2.5 של TNFα אנושי סטנדרטי ידוע (המציין בריכוז של 75 pg/mL).
ציפוי ללכוד נוגדן למיקרו-לוחית
- יש לצפות את בארות של צלחת ELISA 96-באר עם נוגדן לכידה מטוהר על ידי הוספת 100 μL של נוגדן לכידה (1-10 מיקרוגרם / mL טווח) לכל באר של הצלחת.
- מכסים צלחת עם כיסוי צלחת דבק ודגרה אותו לילה ב 4°C.
- לאחר הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי מהצלחת על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
חסימת
- חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות מצופות הנוגדנים על ידי הוספת פתרון חסימת 200 μL, 5% חלב יבש ללא שומן המכיל PBS, לבארות.
- דגירה של לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4°C.
- לאחר הדגירה, להסיר את חוצץ חסימה על ידי הבהוב הצלחת ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.
הוספת אנטיגן המכיל דגימות בדיקה
- הוסף 100 μL של מדגם הבדיקה לבארות. אוטמים את הצלחת עם כיסוי דבק.
- דגירה במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4°C.
- לאחר הדגירה, להסיר את הדגימות על ידי הבהוב הצלחת מעל הכיור ולאחר מכן לשטוף את הבארות עם 200 μL 1X PBS המכיל 1% Tween-20.
הוסף נוגדן זיהוי מצומד באנזים
- הוסף 100 μL של נוגדן זיהוי מצומד אנזים לבארות בריכוז preoptimized.
- אוטמים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
- הסר את נוגדן הזיהוי הלא מאוגד על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור ולשטוף את בארות עם 200 μL 1X PBS המכיל 1% Tween-20.
זיהוי
- הוסף 100 μL של מצע המחוון בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. כל נוגדן זיהוי מצומד באנזים ימיר את המצע לאות שניתן לזהותו.
- לדגור על הצלחת במשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר 5-10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N H2SO4 לבארות. בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה, לקרוא את הצלחת באמצעות קורא microplate כדי לקבוע את ספיגת בארות.
3. אליסה התחרותית
השלבים של ELISA תחרותי שונים מאלה המשמשים עקיפה ו כריך ELISA, עם ההבדל העיקרי להיות שלב מחייב תחרותי בין אנטיגן מדגם ו אנטיגן "תוספת". האנטיגן מדגם הוא דגירה עם הנוגדן העיקרי ללא תווית. מתחמי נוגדנים אנטיגן אלה מתווספים לאחר מכן לצלחת ELISA, אשר כבר מצופה מראש עם אותו אנטיגן. לאחר תקופת דגירה, כל נוגדן לא מאוגד נשטף. יש מתאם הפוך בין כמות הנוגדן החינמית הזמינה לאגד את האנטיגן בבאר לבין כמות האנטיגן במדגם המקורי. לדוגמה, מדגם עם אנטיגן בשפע יהיה יותר אנטיגן ראשוני קומפלקסים נוגדנים, משאיר נוגדן לא מאוגד קטן להיקשר לצלחת ELISA. נוגדן משני מצומד באנזים הספציפי לנוגדן העיקרי מתווסף לאחר מכן לבארות, ואחריו המצע.
ציפוי אנטיגן למיקרו-לוחית
- מצופים את בארות של צלחת ELISA 96-well עם 100 μL של אנטיגן מטוהר בריכוז של 1-10 מיקרוגרם / מ"ל.
- מכסים צלחת עם כיסוי צלחת דבק ודגרה הצלחת לילה ב 4°C.
- לאחר הדגירה, להסיר את פתרון אנטיגן מאוגד מן הבארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
חסימת
- לחסום את האתרים הנותרים כריכת חלבון בבארות מצופות על ידי הוספת 200 μL של חוצץ חסימה לכל באר, אשר יכול להיות גם 5% חלב יבש ללא שומן או BSA ב PBS.
- לדגור על הצלחת לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4°C.
דגימת דגירה (אנטיגן) עם הנוגדן העיקרי
- תוך כדי חסימת הבארות, להכין את תערובת אנטיגן נוגדנים על ידי ערבוב 150 אנטיגן מדגם μL ו 150 μL של נוגדן ראשוני עבור כל באר בבחינה.
- לדגור תערובת זו במשך 1 שעה ב 37°C.
הוסיפו לבאר תערובת אנטיגן-נוגדנים
- עכשיו, להסיר את מאגר חסימה מן בארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
- לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל Tween-20.
- הוסף 100 μL של תערובת נוגדנים אנטיגן-ראשוני מדגם.
- לדגור על הצלחת ב 37°C במשך 1 שעה.
- הסר את התערובת לדוגמה על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
- לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 כדי להסיר כל נוגדן לא מאוגד.
הוסף את הנוגדן המשני
- הוסף 100 μL של נוגדן משני מצומד אנזים, אשר במקרה זה הוא נוגדן מצומד AP, לכל באר.
- לדגור על הצלחת במשך 1 שעה ב 37°C.
- לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20.
זיהוי
- הוסף 100 μL של פתרון המצע לכל באר.
- המתן 5-10 דקות.
- לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N חומצה גופרתית לבארות. לאחר מכן, למדוד את הספיגה בקורא מיקרו-לוח בתוך 30 דקות מהוספת פתרון העצירה
בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים, או ELISA היא בדיקה כמותית רגישה ביותר המשמשת בדרך כלל למדידת ריכוז של אנליט כמו ציטוקינים ונוגדנים בדגימה ביולוגית. העיקרון הכללי של בדיקה זו כולל שלושה שלבים: החל מלכידה, או קיבוע, של אנליט המטרה על צלחת מיקרו, ולאחר מכן זיהוי האנליט על ידי חלבוני זיהוי ספציפיים למטרה, ולבסוף, תגובת אנזים, שבה אנזים מצומד ממיר את הסובסטרט שלו לתוצר צבעוני. בהתבסס על שיטות שונות של לכידה וזיהוי, ELISA יכולה להיות מארבעה סוגים: ישיר, עקיף, סנדוויץ' ותחרותי.
עבור ELISA ישיר, אנטיגן המטרה נקשר תחילה לצלחת, ולאחר מכן מזוהה על ידי נוגדן זיהוי ספציפי. שיטה זו משמשת בדרך כלל לסינון נוגדנים לאנטיגן ספציפי. ELISA עקיף משמש לזיהוי נוגדנים בדגימה על מנת לכמת תגובות חיסוניות. הצלחת מצופה תחילה באנטיגן לכידה ספציפי, המשתק את נוגדן המטרה, ולאחר מכן מתגלה קומפלקס אנטיגן-נוגדן זה באמצעות נוגדן שני.
במקרה של כריך ELISA, אנליט המטרה הוא אנטיגן, שנלכד על הצלחת באמצעות נוגדן לכידה ולאחר מכן מזוהה על ידי נוגדן הזיהוי, ומכאן יוצר כריך נוגדן-אנטיגן-נוגדן. שיטה זו שימושית למדידת ריכוז אנטיגן בדגימה מעורבת.
ELISA תחרותי משמש כאשר רק נוגדן אחד זמין לאנטיגן מטרה מעניין. הצלחת מצופה תחילה באנטיגן המטוהר. בינתיים, הדגימה המכילה את האנטיגן מודגרת מראש עם הנוגדן ולאחר מכן מתווספת לצלחת, כדי לאפשר לכל מולקולות הנוגדנים החופשיות להיקשר לאנטיגן המשותק. ככל שהאות מהצלחת גבוה יותר, כך ריכוז האנטיגן בדגימה נמוך יותר. בכל ארבעת סוגי ה-ELISA, ישיר, עקיף, סנדוויץ' ותחרותי, נוגדן הזיהוי מצומד ישירות לאנזים או יכול להיות מקושר אליו בעקיפין באמצעות נוגדן או חלבון אחר.
האנזימים הנפוצים לתגובה הם חזרת פרוקסידאז או פוספטאז אלקליין עם המצעים שלהם, שניהם מייצרים תוצר צבעוני מסיס שניתן למדוד ולכמת באמצעות קורא צלחות. בסרטון זה תוכלו לראות כיצד לבצע ELISA עקיף, ELISA סנדוויץ' ו-ELISA תחרותי, ואחריו דוגמאות לכימות של אנליט המטרה משיטות ELISA העקיפות והסנדוויץ'.
הניסוי הראשון ידגים כיצד להשתמש ב-ELISA עקיף כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים נגד נגיף השפעת בסרום המתקבל מעכברים נגועים בשפעת.
כדי להתחיל, הוסף 50 מיקרוליטר של אנטיגן מטוהר - במקרה זה, 2 מיליגרם למיליליטר של נגיף שפעת A/PR/8 מטוהר - לכל באר של צלחת ELISA עם 96 בארות. לאחר מכן, מכסים את הצלחת במכסה דבק ומדגרים אותה למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאנטיגן להיקשר לצלחת. למחרת, הסר את תמיסת הציפוי על ידי הזזת הצלחת מעל כיור. לאחר מכן, חסמו את אתרי קשירת החלבון הנותרים בבארות המצופות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם - כאן, 5% סרום חמור ב-1X PBS - לכל באר. השאירו את הצלחת לדגור לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את המאגר החוסם ולאחר מכן שטוף את הצלחת על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 1X PBS המכיל 1% Tween-20. העבירו את הצלחת מעל הכיור פעם נוספת כדי להסיר את הכביסה.
לאחר מכן, הכינו את דגימות הבדיקה על ידי הוספת 460 מיקרוליטר PBS לשפופרת טרייה, ולאחר מכן הוספת 40 מיקרוליטר סרום כדי ליצור דילול של 1 עד 12.5. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר PBS לצינור שני, ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מהדילול הראשון. המשך בטווח דילול סדרתי זה עד לקבלת דגימה סופית עם דילול של 1 עד 204,800. הוסף את דגימות הסרום המדוללות סדרתיות בשלוש עותקים לבארות. מכסים את הצלחת במכסה דבק ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, הסר את הדגימות על ידי הזזת הצלחת לכיור ולאחר מכן שטוף את הצלחת על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 1X PBS המכיל 1% Tween-20. שוב, החלק את הצלחת כדי להסיר את הכביסה.
כעת, הוסיפו 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מצומד אנזים, שבניסוי זה הוא פרוקסידאז חזרת, או HRP, מצומד חמור נגד עכברים משני, לכל באר. דגרו את הצלחת למשך שעה בטמפרטורת החדר, והעבירו את הצלחת כדי להסיר עודפי נוזלים. שטפו את הצלחת עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 ולאחר מכן מרחו 100 מיקרוליטר ממצע המחוון בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר על כל באר. דגרו את הצלחת עם המצע למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. בדוגמה זו, המצע חסר הצבע 3,3', 5,5' - tetramethylbenzidine, או TMB, הופך לצבע כחול כאשר קיים HRP. לאחר 10 דקות, עצרו את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חומצה גופרתית 2N. הדגימות יהפכו לצבע צהוב.
תוך 30 דקות מהוספת תמיסת העצירה, הכנס את הצלחת לקורא מיקרו-פלטות וקרא את הצלחת באורך הגל המתאים למצע כדי לקבוע את ספיגת הבארות.
כדי להתחיל את הכריך ELISA, הצלחת חייבת להיות מצופה בנוגדני לכידה מטוהרים. לשם כך, הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן הלכידה בריכוז בטווח של 1-10 מיקרוגרם למיליליטר, לכל באר של צלחת ELISA של 96 בארות. לאחר מכן, מכסים את הצלחת במכסה צלחת דבק ואז דוגרים את הצלחת למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הציפוי על ידי הזזת הצלחת מעל כיור.
כעת, חסמו את אתרי קשירת החלבון הנותרים בבארות המצופות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של חלב יבש ללא שומן 5% לבארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות. לאחר מכן, הסר את המאגר החוסם, ולאחר מכן שטוף את הבארות עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20. הסר את הכביסה על ידי הזזת הצלחת מעל הכיור. כעת, הוסיפו 100 מיקרוליטר מדגימת הבדיקה לבארות, אטמו את הצלחת במכסה דבק ואז דגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, הסר את הדגימות על ידי הזזת הצלחת מעל הכיור ולאחר מכן שטוף את הבארות עם 200 מיקרוליטר של 1X PBS המכיל 1% Tween-20. העבירו את הצלחת מעל הכיור כדי להסיר את הכביסה ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של נוגדן זיהוי מצומד אנזימים לבארות.
אטום את הצלחת עם מכסה דבק. השאירו את הצלחת לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, הסר את נוגדן הזיהוי הבלתי קשור על ידי הזזת הצלחת מעל כיור ושטוף את הבארות עם 200 מיקרוליטר של 1X PBS המכיל 1% Tween-20. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר ממצע המחוון בריכוז של 1 מיליגרם למיליליטר, ודגר את הצלחת למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, עצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חומצה גופרתית 2N לבארות ולאחר מכן קרא את הצלחת תוך 30 דקות מהוספת תמיסת העצירה בקורא מיקרופלייט.
כדי לבצע ELISA תחרותי, יש לצפות תחילה את הבארות של צלחת ELISA בת 96 בארות ב-100 מיקרוליטר אנטיגן מטוהר בריכוז של 1-10 מיקרוגרם למיליליטר. מכסים את הצלחת במכסה צלחת דבק ואז דוגרים למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את תמיסת האנטיגן הלא קשורה מהבארות על ידי הזזת הצלחת מעל כיור.
לאחר מכן, חסום את אתרי קשירת החלבון הנותרים בבארות המצופות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של חיץ חוסם לכל באר - כאן, 5% חלב יבש ללא שומן ב-PBS. דגרו את הצלחת לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר. תוך כדי חסימת הבארות, הכינו את תערובת האנטיגן-נוגדנים ב-1. צינור של 5 מיליליטר על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של אנטיגן דגימה ל-150 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני לכל באר בבדיקה. דגרו על תערובת זו למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. כעת, הסר את המאגר החוסם מהבארות על ידי הזזת הצלחת מעל כיור. לאחר מכן, שטפו את הבארות עם 1X PBS המכיל Tween 20 ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים הראשונית של אנטיגן.
השאירו את הצלחת לדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הסר את תערובת הדגימה על ידי הזזת הצלחת מעל כיור ולאחר מכן שטוף את הבארות עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 כדי להסיר כל נוגדן לא קשור. הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מצומד אנזים לכל באר ודגר את הצלחת למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הצלחת עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר מתמיסת המצע לכל באר. המתן 5-10 דקות. לאחר 10 דקות, עצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חומצה גופרתית 2N ולאחר מכן מדוד את הספיגה בקורא מיקרו-פלטות תוך 30 דקות מהוספת תמיסת העצירה.
עבור בדיקת ELISA עקיפה למחצה כמותית, נוכחותם של נוגדנים לנגיף שפעת A בדגימות מדוללות סדרתיות של סרום מעכברים נגועים בשפעת A נקבעה על ידי קריאת הספיגה של כל באר ב-405 ננומטר בקורא צלחות. נתונים גולמיים אלה מיוצאים לגיליון אלקטרוני למטרות חישוב. בניסוי זה, דגימות הסרום המדוללות סדרתיות, שנעות בין 1 - 12.5, ל -1 - 204,800, חזרו על עצמן בשלוש עותקים.
כדי לנתח את הנתונים, ערך הספיגה הממוצע מחושב אפוא עבור כל קבוצה של משולשים על ידי הוספת כל הערכים עבור כל דילול וחלוקת הסכום ב-3. לאחר קביעת הממוצע עבור כל קבוצה של משולשים, קריאות ה-OD450 הממוצעות משורטטות כנגד הדילולים הסדרתיים. קריאות ה-OD יורדות ככל שהסרום מדולל, מה שמצביע על כך שפחות נוגדנים נמצאים בדגימות המדוללות יותר. בסנדוויץ' הכמותי ELISA, דילולים בסטנדרט ידוע, במקרה זה רקומבינציה TNFalpha אנושי, נוספו לצלחת של 96 בארות ונקראו יחד עם הדגימות הלא ידועות.
כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית, חושב ערך הספיגה הממוצע עבור כל קבוצת קריאות של הריכוזים הידועים. לאחר מכן, ערך הספיגה הממוצע שורטט על ציר ה-y, כנגד ריכוזי החלבון הידועים על ציר ה-x. עקומת ההתאמה הטובה ביותר נוספת דרך הנקודות בתרשים.
לאחר יצירת העקומה הסטנדרטית, ניתן לקבוע את כמות חלבון TNFalpha בדגימת הבדיקה על ידי חישוב ערך הספיגה הממוצע עבור דגימת הבדיקה. בדוגמה זו, דגימות הבדיקה נתנו קריאות OD450 של 0.636 ו-0. 681. חיבור ערכים אלה וחלוקת הסכום ב-2 נותן ממוצע של 0.659. מציר ה-y בגרף העקומה הסטנדרטית, הרחב קו אופקי מערך ספיגה זה לעקומה הסטנדרטית. בנקודת החיתוך, האריכו קו אנכי לציר ה-x וקראו את הריכוז המתאים, שבמדגם בדיקה זה, מתאים לריכוז TNFalpha של 38.72 פיקוגרם למיליליטר.
Q1: What are the three main steps in an ELISA assay?
ELISA involves three sequential steps: capture or immobilization of the target analyte on a microplate, detection of the analyte using target-specific detection proteins, and enzyme reaction where a conjugated enzyme converts its substrate to a colored product. This three-step process forms the foundation for all ELISA variants, enabling sensitive quantification of biomolecules in biological samples.
Q2: How does indirect ELISA differ from sandwich ELISA?
Indirect ELISA coats the plate with a specific capture antigen to detect antibodies in a sample, measuring immune responses. Sandwich ELISA uses a capture antibody to coat the plate and detects antigens sandwiched between capture and detection antibodies. Sandwich ELISA is better suited for analyzing complex samples like tissue culture supernatants where the antigen is part of a mixed sample.
Q3: When should competitive ELISA be used instead of other ELISA types?
Competitive ELISA is used when only one antibody is available for a target antigen or when detecting small antigens with a single epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hindrance. The plate is coated with purified antigen, and higher signal indicates lower antigen concentration in the sample, creating an inverse relationship.
Q4: What enzymes are commonly used in ELISA and what do they do?
Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes conjugated to antibodies in ELISA. These enzymes convert colorless substrates into soluble, colored products that can be measured and quantified using a plate reader, enabling detection and quantification of antigen-antibody complexes.
Q5: How is a standard curve created and used in sandwich ELISA?
A standard curve is generated by adding known concentrations of purified recombinant protein to designated wells and processing them alongside test samples. Mean absorbance values for known concentrations are plotted on the y-axis against protein concentrations on the x-axis. Test sample absorbance values are then compared to this curve to determine the unknown antigen concentration in the sample.
Q6: Why is blocking an important step in ELISA protocols?
Blocking prevents non-specific binding of antibodies and proteins to empty sites on the microplate. After coating the plate with antigen or antibody, blocking buffer fills remaining protein-binding sites, reducing background signal and improving assay specificity. This step ensures that only target-specific interactions are detected.
Q7: What information does serial dilution provide in indirect ELISA analysis?
Serial dilution of serum samples reveals antibody concentration patterns by showing how absorbance decreases as samples become more diluted. When mean absorbance values from serially diluted samples are plotted against dilution factors, the resulting curve demonstrates that less antibody is present in more diluted samples, enabling semi-quantitative assessment of immune response.