אליסה אסייס: עקיפה, כריך ותחרותי

1. אליסה עקיפה

ELISA עקיף הוא אחד שבו הנוגדן העיקרי אנטיגן ספציפי מזוהה על ידי נוגדן מצומד משני. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה לשיטת ELISA עקיפה, שבה נבדקות דגימות הסרום של עכברים נגועים בשפעת A (IAV) לנוכחות נוגדן IgG ספציפי ל- IAV. כוח אחד של דוגמה זו הוא כי נוגדנים משניים שונים ניתן להשתמש המזהים את כל איזוטיפים נוגדנים או איזוטיפים ספציפיים (למשל, IgG).

ציפוי אנטיגן למיקרו-לוחית

1. מצופים את בארות של צלחת ELISA 96-well עם אנטיגן מטוהר על ידי צנרת 50 μL של אנטיגן מטוהר (2 מ"ג / מ"ל של A מטוהר A / PR / 8 שפעת וירוס ב 0.05M חוצץ Tris-HCl (pH 9.5)) לתוך כל באר של הצלחת.
2. מכסים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר אותה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאנטיגן להיקשר לצלחת.
3. עם השלמת הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.

חסימת

4. חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות המצולפות על ידי הוספת מאגר חסימה של 200 μL, נעשה שימוש בסרום חמור 5% ב-1X PBS, לבאר. ריאגנטים חלופיים לחסימה כוללים 5% חלב יבש ללא שומן או BSA ב- PBS או סרום רגיל מבעל חיים שבו נוצר הנוגדן המשני.
5. יש לדגור לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. לאחר הדגירה, להסיר את חוצץ חסימה על ידי הבהוב הצלחת ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.

דגירה עם הנוגדן העיקרי

7. הכן דילול סדרתי של דגימת הסרום, המכילה את הנוגדן העיקרי, כדי להשיג טווח דילול של 1 עד 204,800, באמצעות 1X PBS. כדי לעשות זאת, תחילה לדלל את הסרום 1:12.5 ולאחר מכן לבצע דילול 4X (טווח דילול - 1:12.5 עד 1:204,800).
8. הוסף 100 μL של דגימות סרום מדולל באופן סדרתי לבארות.
9. מכסים את הצלחת עם כיסוי דבק ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 1-2 שעות.
10. לאחר הדגירה, להעיף את הצלחת מעל כיור לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.

דגירה עם הנוגדן המשני

11. הוסף 100 μL של נוגדן משני מצומד אנזים, peroxidase חזרת, חומר מצומד HRP אנטי עכבר משני בניסוי זה, לכל באר.
12. לדגור על הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר.
13. לאחר הדגירה, להעיף את הצלחת מעל כיור ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.

זיהוי

14. הוסף 100 μL של מצע המחוון (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)) בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל לכל באר.
15. לדגור על הצלחת עם המצע במשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר.
16. לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N חומצה גופרתית (H₂SO₄).
    בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה, לקרוא את הצלחת באמצעות קורא microplate ב 405 ננומטר כדי לקבוע את ספיגת בארות.

2. כריך אליסה

בגרסת ELISA זו, המדגם הניסיוני "נדחף" בין נוגדן לכידה ללא מעצורים לנוגדן זיהוי מצומד, שניהם ספציפיים לאותו חלבון אך באפיטופים שונים. בדוגמה הבאה של ELISA, ריכוז TNFα אנושי נקבע במדגם לא ידוע באמצעות עקומה סטנדרטית שנוצרה מדילול סדרתי פי 2.5 של TNFα אנושי סטנדרטי ידוע (המציין בריכוז של 75 pg/mL).

ציפוי ללכוד נוגדן למיקרו-לוחית

1. יש לצפות את בארות של צלחת ELISA 96-באר עם נוגדן לכידה מטוהר על ידי הוספת 100 μL של נוגדן לכידה (1-10 מיקרוגרם / mL טווח) לכל באר של הצלחת.
2. מכסים צלחת עם כיסוי צלחת דבק ודגרה אותו לילה ב 4°C.
3. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי מהצלחת על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.

חסימת

4. חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות מצופות הנוגדנים על ידי הוספת פתרון חסימת 200 μL, 5% חלב יבש ללא שומן המכיל PBS, לבארות.
5. דגירה של לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4°C.
6. לאחר הדגירה, להסיר את חוצץ חסימה על ידי הבהוב הצלחת ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.

הוספת אנטיגן המכיל דגימות בדיקה

7. הוסף 100 μL של מדגם הבדיקה לבארות. אוטמים את הצלחת עם כיסוי דבק.
8. דגירה במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4°C.
9. לאחר הדגירה, להסיר את הדגימות על ידי הבהוב הצלחת מעל הכיור ולאחר מכן לשטוף את הבארות עם 200 μL 1X PBS המכיל 1% Tween-20.

הוסף נוגדן זיהוי מצומד באנזים

10. הוסף 100 μL של נוגדן זיהוי מצומד אנזים לבארות בריכוז preoptimized.
11. אוטמים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
12. הסר את נוגדן הזיהוי הלא מאוגד על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור ולשטוף את בארות עם 200 μL 1X PBS המכיל 1% Tween-20.

זיהוי

13. הוסף 100 μL של מצע המחוון בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. כל נוגדן זיהוי מצומד באנזים ימיר את המצע לאות שניתן לזהותו.
14. לדגור על הצלחת במשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר.
15. לאחר 5-10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N H₂SO₄ לבארות. בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה, לקרוא את הצלחת באמצעות קורא microplate כדי לקבוע את ספיגת בארות.

3. אליסה התחרותית

השלבים של ELISA תחרותי שונים מאלה המשמשים עקיפה ו כריך ELISA, עם ההבדל העיקרי להיות שלב מחייב תחרותי בין אנטיגן מדגם ו אנטיגן "תוספת". האנטיגן מדגם הוא דגירה עם הנוגדן העיקרי ללא תווית. מתחמי נוגדנים אנטיגן אלה מתווספים לאחר מכן לצלחת ELISA, אשר כבר מצופה מראש עם אותו אנטיגן. לאחר תקופת דגירה, כל נוגדן לא מאוגד נשטף. יש מתאם הפוך בין כמות הנוגדן החינמית הזמינה לאגד את האנטיגן בבאר לבין כמות האנטיגן במדגם המקורי. לדוגמה, מדגם עם אנטיגן בשפע יהיה יותר אנטיגן ראשוני קומפלקסים נוגדנים, משאיר נוגדן לא מאוגד קטן להיקשר לצלחת ELISA. נוגדן משני מצומד באנזים הספציפי לנוגדן העיקרי מתווסף לאחר מכן לבארות, ואחריו המצע.

ציפוי אנטיגן למיקרו-לוחית

1. מצופים את בארות של צלחת ELISA 96-well עם 100 μL של אנטיגן מטוהר בריכוז של 1-10 מיקרוגרם / מ"ל.
2. מכסים צלחת עם כיסוי צלחת דבק ודגרה הצלחת לילה ב 4°C.
3. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון אנטיגן מאוגד מן הבארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.

חסימת

4. לחסום את האתרים הנותרים כריכת חלבון בבארות מצופות על ידי הוספת 200 μL של חוצץ חסימה לכל באר, אשר יכול להיות גם 5% חלב יבש ללא שומן או BSA ב PBS.
5. לדגור על הצלחת לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4°C.

דגימת דגירה (אנטיגן) עם הנוגדן העיקרי

6. תוך כדי חסימת הבארות, להכין את תערובת אנטיגן נוגדנים על ידי ערבוב 150 אנטיגן מדגם μL ו 150 μL של נוגדן ראשוני עבור כל באר בבחינה.
7. לדגור תערובת זו במשך 1 שעה ב 37°C.

הוסיפו לבאר תערובת אנטיגן-נוגדנים

8. עכשיו, להסיר את מאגר חסימה מן בארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
9. לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל Tween-20.
10. הוסף 100 μL של תערובת נוגדנים אנטיגן-ראשוני מדגם.
11. לדגור על הצלחת ב 37°C במשך 1 שעה.
12. הסר את התערובת לדוגמה על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
13. לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 כדי להסיר כל נוגדן לא מאוגד.

הוסף את הנוגדן המשני

14. הוסף 100 μL של נוגדן משני מצומד אנזים, אשר במקרה זה הוא נוגדן מצומד AP, לכל באר.
15. לדגור על הצלחת במשך 1 שעה ב 37°C.
16. לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20.

זיהוי

17. הוסף 100 μL של פתרון המצע לכל באר.
18. המתן 5-10 דקות.
19. לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N חומצה גופרתית לבארות. לאחר מכן, למדוד את הספיגה בקורא מיקרו-לוח בתוך 30 דקות מהוספת פתרון העצירה