Question 1

מהי בדיקת ELISPOT וכיצד היא מזהה תגובות חיסוניות?

Accepted Answer

ELISPOT (Enzyme-linked Immunospot) היא שיטה המזהה ומכמתת הפעלת תאי מערכת החיסון על ידי מדידה של חלבונים מופרשים, כגון ציטוקינים. הבדיקה משתמשת במיקרו-פלטה מצופה בנוגדנים ללכידה (capture antibodies) המקבעים באופן מיידי חלבונים המופרשים על ידי תאים חיים, ובכך מונעים דילול או פירוק שלהם. גישה בעלת דיוק גבוה זו מאפשרת זיהוי של תאים מופעלים בודדים, גם בתוך תתי-אוכלוסיות קטנות, מה שהופך אותה לאידיאלית למחקר של תגובות חיסוניות ברמת התא.

Question 2

כיצד פועל תהליך הלכידה והזיהוי בבדיקת ELISPOT מבוססת ציטוקינים?

Accepted Answer

נוגדן לכידה ספציפי לציטוקין המטרה מצפה את בארות המיקרופלטה. כאשר תאי T מעוררים ומפרישים ציטוקינים, נוגדן הלכידה מקבע אותם באופן מיידי. לאחר מכן, נוגדן זיהוי ביוטינילי נקשר לציטוקין שנלכד, ואחריו פרוקסידאז חזרית (HRP) מצומד לסטרפטאבידין. הוספת סובסטרט AEC יוצרת משקה כהה המסמן כל תא מפריש כנקודה נראית לעין.

Question 3

האם ניתן להשתמש ב-ELISPOT למדידת תאי B המפרישים נוגדנים?

Accepted Answer

כן, ניתן להשתמש ב-ELISPOT כדי לכמת תאי B זיכרון לאחר זיהום או חיסון על ידי ניתוח ייצור הנוגדנים שלהם. ב-ELISPOT מבוסס נוגדנים, אנטיגן ספציפי מחליף את הנוגדן בשלב הלכידה או בשלב הזיהוי. וריאציה זו מאפשרת לחוקרים להעריך תגובות של תאי B זיכרון ספציפיים לאנטיגן, החשובים לתגובות נוגדנים הגנתיות ומהירות בעקבות חשיפה חוזרת לפתוגן.

Question 4

מהי מטרת הדילול סדרתי בפרוטוקול ה-ELISPOT?

Accepted Answer

דילול סדרה יוצר ריכוזי תאים הולכים ופוחתים לאורך בארי הפלטה, ובכך מאפשר לחוקרים לבסס קשר של תגובה למנה. על ידי זריעת תאים בריכוזים מרובים ומעקב אחר האופן שבו מספר הנקודות פוחת עם ירידה בצפיפות התאים, מדענים יכולים לקבוע את השכיחות של תאים מופעלים בתוך כלל האוכלוסייה ולאמת את הליניאריות של הבדיקה.

Question 5

מדוע חסימה (blocking) באמצעות מצע גידול תאים היא שלב חשוב ב-ELISPOT?

Accepted Answer

לאחר ציפוי הפלטה בנוגדן לכידה, חסימה באמצעות מצע תרבית תאים מונעת קישור לא ספציפי של תאים וחלבונים לפני שטח הפלטה. שלב זה מבטיח שרק הציטוקין מטרה שנלכד על ידי הנוגדן הספציפי יתרום להיווצרות הכתמים, ובכך משפר את ספציפיות הבדיקה ומפחית רעשי רקע במהלך שלב הגילוי.

Question 6

כיצד סופרות את הנקודות בבדיקת ELISPOT ומה הן מייצגות?

Accepted Answer

לאחר שמצע ה-AEC מייצר כתמים של משקוע כהה, קורא פלטות אוטומטי או מיקרוסקופ סופרים אותם. כל כתם מייצג תא הפרשה פעיל אחד, וגודל הכתם נמצא במתאם עם כמות החלבון שהופרש מאותו תא. התוצאות מובאות בדרך כלל כספירת כתמים למספר התאים שהועלו לפלטה, נתון המצביע על שכיחות התאים הפעילים בתוך האוכלוסייה.

Question 7

מהם היתרונות המרכזיים של ELISPOT בהשוואה לשיטות אחרות לגילוי תגובות חיסוניות?

Accepted Answer

שיטת ה-ELISPOT מציעה פשטות באמצעות פרוטוקולים ישירים הדורשים מומחיות טכנית מינימלית, רגישות יוצאת דופן המאפשרת זיהוי של תאים בודדים מתוך 300,000 תאים, ונתונים פונקציונליים כמותיים על תגובות חיסוניות. בניגוד לציטומטריה של זרימה, ELISPOT דורשת מספר תאים קטן מאוד ומספקת ספירה ישירה של תאים מפרישי חלבון, מה שהופך אותה לסטנדרט הזהב למדידת חסינות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בניסויים קליניים.

אליספוט אסאי: זיהוי של IFN-γ הפרשת טחול - חידון הערכה