$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
אימונוציטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה הן שיטות צביעה לחלבון מעניין בתאים וברקמות מתורבתות, בהתאמה. העיקרון הבסיסי של שתי הטכניקות הקשורות כולל שימוש בנוגדנים ספציפיים המתויגים במערכת זיהוי כדי לזהות ולהמחיש את החלבון ולקבוע את מיקומו בתוך התאים והרקמות, כמו גם את הרמות היחסיות. התהליך בכל אחד מהניסויים מתחיל בהכנת דגימה.
עבור אימונוציקטוכימיה, המדמה באופן ספציפי מיקומי חלבון או אנטיגן בתאים, זה כולל שלושה שלבים. השלב הראשון הוא ציפוי, הכרוך בתרבית התאים במצע גידול על החלקה או החלקה של כיסוי, בדרך כלל, בבארות של צלחת תרבית. לאחר מכן מגיע קיבוע, שבו מתווסף לתאים חומר משקע או צולב כמו פרפורמלדהיד כדי לשמר את השלמות המבנית של החלבונים ולמנוע מפעילות האנזים לפגוע בהם. השלב האחרון הוא חדירה, הכוללת הוספת חומר ניקוי כדי להפוך את קרומי התאים לחדירים לצביעה.
בשיטה המקבילה, אימונוהיסטוכימיה, חלבונים או אנטיגנים מוצגים ברקמות והכנת הדגימה כוללת חמישה שלבים. ראשית, הרקמה כולה נתונה לקיבוע, בדרך כלל עם פרפורמלדהיד. לאחר מכן מטמיעים את הרקמה בגוש פרפין, ולאחר מכן חתך את הבלוק הזה באמצעות מכונה הנקראת מיקרוטום כדי לחתוך את הרקמה לפרוסות דקות שניתן להניח על שקופיות. לאחר מכן, השקופיות עוברות דה-פרפיניזציה, או הסרת הפרפין סביב פרוסת הרקמה. לאחר מכן, ניתן לבצע שלב אחזור אנטיגן אופציונלי. זה יכול להיעשות באמצעות חום או אנזימים כדי לחשוף אפיטופים שהיו מקושרים במהלך הקיבוע, מה שהופך אותם לזמינים לקשירת נוגדנים. לאחר הכנת הדגימה המתאימה, מתווסף נוגדן ראשוני ספציפי למטרה לדגימת התא או הרקמה. נוגדן ראשוני זה אמור להיקשר לחלבון המבוקש. לאחר מכן, מתווסף נוגדן משני, שמזהה את הנוגדן הראשוני ונקשר אליו. נוגדן משני זה מצומד לאנזים הנקרא HRP, או יכול להיקשר אליו. כאשר מוסיפים את המצע הספציפי שלו, DAB, HRP ממיר אותו למשקע חום בלתי מסיס. כתם חום זה מסמן את מיקומו של חלבון המטרה. השקופיות מוכתמות גם בהמטוקסילין, המסמן את הגרעינים בכחול ומספק נקודת ייחוס מרחבית לקביעת לוקליזציה תת-תאית. לאחר מכן, מדיית הרכבה מתווספת לשקופית, ואחריה החלקת כיסוי על מנת לאטום ולשמר את הדגימה המוכתמת. לבסוף, ניתן לצלם את השקופיות במיקרוסקופ אור.
בסרטון זה תוכלו לצפות בטכניקת הכנת הדגימה עבור תאים מצופים וקטעי רקמות, ואחריה צביעה חיסונית של קטעי הרקמה.
ראשית, יש להושיב את התאים המעניינים על תלושי כיסוי. לשם כך, בעבודה במכסה מנוע לתרבית רקמות, הניחו כיסויים בודדים לבארות של צלחת 24 בארות. לאחר מכן, סגור את האבנט והדליק את אור ה-UV כדי לעקר את הכיסויים למשך 15 דקות לפחות. לאחר מכן, כבה את אור ה-UV. כדי להרים את התאים המעניינים מצלחת קונפלונטית של 10 סנטימטרים, שאפו את המדיה, שטפו לזמן קצר עם PBS והוסיפו טריפסין לתאים למשך 2 דקות. לאחר מכן, הקש על צד הצלחת כדי לוודא שהתאים התנתקו ונטרל את הטריפסין עם מדיה. לאחר מכן, הוסף 0. 5 מ"ל של מתלה התאים לכל באר, תוך הקפדה על כיסוי הכיסויים. הנח את הצלחת לתוך אינקובטור CO2 לח ואפשר לתאים לגדול ב-37 מעלות צלזיוס עד שהם מתכנסים 50-70%.
לאחר שהתאים מגיעים למפגש האופטימלי, שאפו את מדיום התרבות מכל באר, ולאחר מכן קבעו את התאים על ידי דגירה ב- . 5 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד מדולל ב-1X PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הקיבוע, יש לשטוף את התאים ולהוסיף 1 מ"ל של 1X PBS על כל כיסוי. שאפו מיד את ה-PBS, ולאחר מכן חזרו על השטיפה פעמיים נוספות בסך הכל 3 כביסות.
כעת, חלחלו לתאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של 0.1% טריטון X-100 ב-1X PBS לכל באר. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שאפו את מאגר החדירות ולאחר מכן שטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 1X PBS לכל באר. שאפו מיד מה-PBS וחזרו על השטיפה פעמיים נוספות בסך הכל 3 כביסות. כעת, לאחר שהתאים על הכיסויים קבועים וחדירים, המשך להליך הצביעה המודגם עבור הדוגמה האימונוהיסטוכימית הבאה, למעט העובדה שיש לבצע את הדגירה בתוך הבארות של צלחת 24 הבארות ולא ישירות על שקופית חתך רקמות.
כדי להתחיל, השג קטעי רקמה מוכנים, קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין. הפזר את השקופיות על ידי הנחתן במתלה שקופיות ולאחר מכן טבילה לחלוטין ב-250 מ"ל של 100% קסילן. הניחו לשקופיות לדגור במשך 5 דקות בקסילן. לאחר מכן, הוציאו את השקופיות מהמיכל, נגבו אותן במגבת נייר והניחו אותן באמבט קסילן חדש בכלי טרי למשך 5 דקות נוספות.
לאחר מכן, יש להרטיב את החלקים בסדרה של תמיסות אתנול מדורגות החל מ-100% אתנול למשך 3 דקות. נגב את מתלה השקופיות במגבת נייר והעביר את השקופיות למיכל חדש של 100% אתנול למשך 3 דקות נוספות. המשך במחזור זה של כביסה, ייבוש במגבת נייר והעברת השקופיות לאמבטיה חדשה בעקבות ריכוזי האתנול המצוינים למשך הזמן שצוין. לאחר שטיפת האתנול הסופית, נגב את המתלה במגבת נייר ודגר את השקופיות ב 100 מ"ל של מי חמצן .3% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לחסום כל פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. שטפו את השקופיות ב -250 מ"ל של 1X PBS למשך 5 דקות. חזור על שטיפה זו במיכל של 1X PBS טרי למשך 5 דקות נוספות.
לאחר מכן, בצע אחזור אנטיגן על ידי טבילת השקופיות ב-250 מ"ל של מאגר ציטראט IHC ב-pH 6.0 והרתחתן למשך 20 דקות. לאחר מכן, המשך לפרוטוקול הצביעה.
כדי להתחיל בתהליך הצביעה עבור IHC, הקף את החלקים בעט הידרופובי כדי לזהות את השטח המינימלי שהמאגר צריך לכסות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להניח 100 מיקרוליטר של מאגר חוסם, שבניסוי זה הוא סרום סוס מדולל ב-1X PBS, מעל הקטע. דגרו את המגלשות למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את המאגר החוסם באמצעות פיפטה.
לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדן הראשוני ואת המאגר החוסם בדילול של 1:100 על ידי הוספת 990 מיקרוליטר של סרום סוס מדולל ב-1X PBS ל-1. 5 מ"ל צינור אפנדורף, ואחריו 10 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני. הוסיפו 100 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני המדולל לכל חלק, ודגרו על השקופיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר הטיימר נשמע, רוקנו את הנוגדן העיקרי מכל שקופית, ולאחר מכן שטפו אותם ב-250 מ"ל של 1X PBS למשך 5 דקות. חזור על שטיפה זו פעם נוספת באמצעות 1X PBS טרי.
בזמן שהשקופיות נשטפות ב-1X PBS, יש לדלל את הנוגדן המשני לדילול של 1:200 על ידי הוספת 995 מיקרוליטר של מאגר חוסם לצינור של 1.5 מ"ל ואחריו 5 מיקרוליטר של הנוגדן המשני, שבמקרה זה הוא IGG נגד עכברים של סוס ביוטיניל. הוסף 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המדולל לכל חלק, ולאחר מכן דגר את השקופיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, הסר את הנוגדן המשני על ידי ניקוזו מהחלקים, ולאחר מכן שטוף את השקופיות ב-250 מ"ל של 1X PBS למשך 5 דקות. חזור על שטיפה זו באמצעות 1X PBS טרי.
כעת, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מגיב קומפלקס אבידין-ביוטין, ודגרו את החלקים בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות על ידי טבילתן ב-250 מ"ל של 1X PBS למשך 5 דקות. בדומה לשלבי הכביסה הקודמים, חזור על שטיפה זו פעם נוספת באמצעות 1X PBS טרי. לאחר מכן, פתח את השקופיות על ידי דגירה של החלקים ב-100 מיקרוליטר DAB למשך עד 5 דקות. עצור את הפיתוח על ידי טבילת החלקים ב-250 מ"ל מים מזוקקים למשך 5 דקות.
כעת, ניתן להכתים שקופיות, אם תרצה. לשם כך, טבלו בקצרה את השקופיות ב -250 מ"ל של תמיסת המטוקסילין האריס. שטפו את כתם הנגד על ידי שטיפת השקופיות ב -250 מ"ל מים מזוקקים למשך 5 דקות. חזור על שטיפה זו פעם נוספת באמצעות מים מזוקקים טריים. לאחר מכן, יבשו את החלקים. לשם כך, דגרו תחילה את השקופיות באתנול 95% למשך 5 דקות. כתם את השקופיות על מגבת נייר, והעביר אותן למיכל חדש של 95% אתנול טרי למשך 5 דקות נוספות. המשך במחזור הכביסה, הספיגה במגבת נייר והעברת השקופיות לאמבטיה חדשה, בעקבות הפתרונות המצוינים למשך 5 דקות כל אחד.
לאחר הדגירה הסופית, כתם את השקופיות במגבת נייר, ולאחר מכן הוסף טיפה של אמצעי הרכבה, כגון תושבת אורגנו-לימונן, לשקופיות. כעת, הניחו כיסוי מעל החלקים, והקפידו לא ללכוד בועות אוויר. השקופיות מוכנות כעת לצפייה במיקרוסקופ לניתוח.
כדי להתבונן בחלקים המוכתמים, השתמש במיקרוסקופ אור רגיל כדי להמחיש את הכתם, ובמצלמה דיגיטלית כדי ללכוד את התמונה. בדוגמה הספציפית הזו של IHC, רקמות טחול מעכברים מסוג בר ועכברים ספונטניים, טרנסגניים כפולים או DTG, מושווים לחקר ביטוי Dyclin D1 בלימפומה. הרקמות הוטמעו בפרפין, נחתכו ונצבעו בנוגדנים אנטיציקלין D1, וצולמו בהגדלה של פי 20. תאים המבטאים ציקלין D1 מסומנים על ידי הצבע החום-אדמדם על רקע הרקמה הכחולה. בהשוואת עוצמות הצביעה בין התמונות מהעכברים השונים, לטחול הלא מוגדל, יש כמויות נמוכות יחסית של ביטוי ציקלין D1 ללא קשר לגנוטיפ העכבר. לעומת זאת, הטחול המוגדל מעכבר ה-DTG, מראה צביעה מוגברת בצבע חום-אדמדם המצביע על מתאם בין התפתחות סרטן לביטוי ציקלין D1 במודל עכבר זה.
