אימונוהיסטוכימיה ואימונוציטוכימיה: הדמיית רקמות באמצעות מיקרוסקופיה קלה

1. הכנת תאים לאימונוציטוכימיה

1. תאי זרעים מעניינים על מגלשות תאים או כיסויים מקוביים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של השעיית תאים לבארות של צלחת תרבות 24 היטב.
   הערה: תאים מסוימים עשויים לדרוש צמיחה על כיסויים מטופלים, כגון כיסויים שטופלו פולי-ליזין. תנאי טיפול אופטימליים צריכים להיקבע על ידי המשתמש בהתאם לסוג התא המשמש.
2. מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור CO₂ לח ולאפשר לתאים לגדול ב 37 מעלות צלזיוס עד 50-70% confluent.
3. ברגע התאים להגיע למפגש אופטימלי, להסיר את מדיה תרבית מכל באר ולאחר מכן, לתקן את התאים על ידי דגירה אותם ב 0.5 מ"ל של 4% PFA (מדולל ב 1X PBS) ודגרה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הסר את הקיבעון ולשטוף את בארות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1X PBS.
5. לאחר מכן, לפרמיביל להפוך את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של 0.1% טריטון-X-100 ב 1X PBS לכל באר ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שאפו את חיץ permeabilization ולשטוף את בארות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1X PBS.
7. התאים על כיסויים קבועים כעת וחלחלו. המשך להליך הכתמים שהודגם עבור הדוגמה האימונוהיסטוכמית הבאה - למעט כי הדגירות צריכות להתבצע בתוך הבארות של צלחת 24 באר ולא ישירות על שקופית קטע רקמה.

2. הכנת מקטעים קבועים בפורמלין, משובצים פרפין להכתמה

1. השג מקטעי רקמות מוטבעים בפורמלין קבועים, פרפין.

דפראפיניזציה

2. לטבול את השקופיות 100% קסילן 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.

התייבשות

3. לטבול את השקופיות 100% אתנול 2 פעמים במשך 3 דקות כל אחד.
4. לטבול את השקופיות ב 95% אתנול במשך 3 דקות.
5. לטבול את השקופיות ב 70% אתנול במשך 3 דקות.
6. לטבול את השקופיות ב 50% אתנול במשך 3 דקות.

חסימת פעילות פרוקסידאז אנדוגני

7. לדגור על המגלשות ב 100 מ"ל של 0.3% H₂O₂ במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
8. לשטוף את השקופיות עם 1X PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.

אחזור אנטיגן

9. לטבול את השקופיות במאגר ציטוט IHC (pH 6) ולהרתיח אותם במשך 20 דקות.
10. שקופיות רקמות מוכנות כעת להכתמה.

3. הכנת חלקים טריים קפואים, משובצים ב-OTC להכתמה

1. מניחים 5 מ"מ של רקמה מבודדת טרייה לתוך תבנית ומוסיפים OCT עד שהחלק מכוסה לחלוטין.
2. לאט לאט להטביע את בלוק הרקמה לתוך חנקן נוזלי עד קפוא לחלוטין. המדגם יכול כעת להיות מאוחסן ב -80°C עד שנה אחת.
3. לאחר מוכן לחיתוך, להעביר את בלוק הרקמה הקפואה להקפאה ולאפשר את ההתקנה כולה לבוא -20 מעלות צלזיוס.
4. חותכים מקטעי רקמות בעובי 5-10 מיקרומטר באמצעות קריוסטט והשתמשו במברשת כדי למקם מקטעים ישירות על שקופיות זכוכית תואמות IHC.
5. אפשרו לשקופיות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. ניתן גם לאחסן את השקופיות ב- -80°C.
6. לטבול את השקופיות 250 מ"ל של 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את השקופיות לפני הכתמים. שיטת קיבוע אופטימלית צריכה להיקבע על-ידי המשתמש.
7. לטבול את השקופיות ב 250 מ"ל של 1X PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
8. לטבול את השקופיות 250 מ"ל של 0.3% H₂O₂ במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לחסום כל פעילות peroxidase אנדוגני.
9. לטבול את השקופיות ב 250 מ"ל של 1X PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
10. השקופיות מוכנות כעת להכתמתם.

4. כתמים

1. הקיפו את הרקמה במחסום הידרופובי באמצעות עט מחסום.

חסימת

2. באמצעות פיפטה, מניחים 100 μL של חוצץ חסימה (סרום סוס מדולל ב- 1X PBS) - מעל המקטע במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
3. הסר מאגר חסימה באמצעות pipette.

דגירה ראשונית של נוגדנים

4. לדגור את הרקמה המקיפה עם פתרון נוגדנים ראשוני מדולל 100 μL (עכבר אנטי אנושי ציקלין D1 מדולל 1:100 חוצץ חסימה) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. מסננים את הנוגדן העיקרי מכל שקופית ושטפו את השקופיות עם 1X PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחת.

דגירה משנית של נוגדנים

6. לדגור על המדגם עם 100 μL של נוגדן משני ביוטינילציה מדולל (ביוטינילציה סוס נגד עכבר IgG מדולל 1:200) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הסר את הנוגדן המשני על ידי ניקוז את החלקים לשטוף עם 1X PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.

פיתוח צבע

8. הדמיה באמצעות HRP: הוסף 100 μL של קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC) ריאגנט ודגרה את החלקים בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר
   הערה: נוגדנים מתויגים פלואורסצנטית ניתן גם להשתמש ודמיינו באמצעות מיקרוסקופ מתאים.
9. לשטוף את השקופיות עם 1X PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
10. לפתח את השקופיות על ידי דגירה של המקטעים ב 100 μL של DAB עד 5 דקות.
11. עצור את הפיתוח על ידי הוספת מים מזוקקים (dH₂O) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

תגובה נגדית (אם תרצה)

12. לטבול את השקופיות בקצרה האריס המטוקסילין פתרון (או 0.5% מתיל ירוק ב 0.1M נתרן אצטט (pH 4.2)) במשך 10 דקות.
13. יש לשטוף את הדלפק על ידי שטיפת מגלשות ב- dH₂O פעמיים למשך 5 דקות כל אחת.

התייבשות

14. לטבול את השקופיות 95% אתנול 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
15. לטבול את השקופיות 100% אתנול 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
16. לטבול את השקופיות 100% קסילן 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
17. כתם את השקופיות במגבת נייר.

יישום הרכבה וכיסוי

18. הוסף טיפה של מדיה הרכבה כגון Mount Organo-Limonene לשקופיות והנח כיסוי מעל המקטעים.

ניתוח מיקרוסקופי

19. שים לב למקטעים המוכתמים תחת מיקרוסקופ מתאים לניתוח. כאן נעשה שימוש במיקרוסקופ אור סטנדרטי לתצפית ומצלמה דיגיטלית מותקנת שימשה להדמיה.